2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 张晗笑, 肖云杰, 杨海涛, 王泽方
- ZHANG Hanxiao, XIAO Yunjie, YANG Haitao, WANG Zefang
- 聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶检测方法的研究进展
- Detection methods for polyethylene terephthalate degrading enzymes: a review
- 生物工程学报, 2023, 39(8): 3219-3235
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(8): 3219-3235
- 10.13345/j.cjb.230069
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文章历史
- Received: February 2, 2023
- Accepted: May 6, 2023
- Published: May 9, 2023
引用本文
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Science杂志在2021年提出了125个科学前沿问题[1]，其中包括“我们如何更好地管理塑料废弃物?(How can we better manage the world’s plastic waste?)”以及“我们可以创造一种环保的塑料替代品吗? (Can we create an environmentally friendly replacement for plastics?)”。塑料主要是以石油、煤、天然气等化石燃料为原材料，通过聚合作用形成的高分子聚合物[2-3]。在过去半个多世纪中，塑料因其耐用、轻便、绝缘性好和生产成本低等特性，成为人类工作和生活中必不可少的材料。但是，这些特性也导致塑料不易降解，大多数塑料在环境中能够持续存在很长时间[4]。2021年，全球塑料产量近3.9亿t，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)的产量约占6.2%[5]。PET由乙二醇(ethylene glycol, EG)和对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)缩聚而成，是应用最广泛的聚酯塑料之一[6]。PET在自然界中很难分解，未分解部分在环境中积累形成塑料废弃物，对陆地、水生生态系统以及人类健康构成严重威胁。
为了应对PET造成的环境污染问题，研究人员开始关注对环境友好的生物降解策略。研究表明，多种水解酶能够切割PET单体之间的酯键[7]。一些真菌和细菌产生的酶可以将PET水解为单体对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯[bis (2-hydroxyethyl) terephthalic acid, BHET]、对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯[mono (2-hydroxyethyl) terephthalic acid, MHET]、TPA和EG[6, 8-11]。PET酶法回收的研究已有20多年的历史[12]。传统的PET生物降解检测方法包括：(1) 直接可视化观察。使用扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)或原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)等，对PET塑料的可见变化进行评估，包括表面粗糙程度变化，形成空洞或裂缝等。通过该方法获得的参数可作为PET发生酶解的第一指标，并可用于研究PET表面侵蚀的机理。(2) 测定PET的重量损失。PET薄膜等样品重量损失的测定在降解测试中被广泛使用。(3) 机械性能和摩尔质量的变化。当PET发生降解时，其物理特性会发生改变，其中，PET的拉伸强度等性能与PET摩尔质量密切相关，通常被直接视为降解的指标。但是在生物降解过程中，只有观察到明显的质量损失时，材料的性能才能发生改变，表面侵蚀并不影响材料内部性质。(4) 二氧化碳(carbon dioxide, CO2)的排放以及氧气(oxygen, O2)的消耗。在好氧条件下，微生物利用O2氧化碳原子，形成CO2，CO2的形成以及O2的消耗都是PET发生水解的良好指标[13]。以上这些方法在早期鉴定PET水解酶或微生物的工作中发挥了重要作用，然而，随着研究的深入，这些方法无法对降解产物进行定量分析，不能深入揭示PET水解酶的分子机制，而表现出一定的局限性。此外，新型PET水解酶的筛选是一个漫长而复杂的过程[14]，使用传统的方法进行检测可能需要长达几个月的时间。因此，需要高效的筛选方法去探索自然界中丰富的微生物资源以及数量庞大的突变体文库。为了更准确地对PET水解产物进行定量分析，深入了解其分子机制，同时寻求更快速的检测方法，研究人员开发了一系列针对于PET水解酶的筛选方法。在这些方法的使用过程中，除直接使用PET作为水解底物外，还可使用其他不同的底物进行测定，如低聚PET、对硝基苯基乙酸酯(p-nitrophenyl acetate, pNPA)和BHET等。通过测定其各自形成的水解产物来评估PET水解酶的水解活性(表 1)。根据近些年的研究进展，本文总结了一些PET水解酶的筛选方法。
| Compound | Abbreviation | Structural formula | Hydrolysate |
| p-nitrophenyl acetate | pNPA |  |
pNP, acetate |
| p-nitrophenyl butyrate | pNPB |  |
pNP, butyrate |
| p-nitrophenyl caproate | pNPC |  |
pNP, hexanoate |
| p-nitrophenyl caprylate | pNPO |  |
pNP, caprylate |
| Bis (2-hydroxyethyl) terephthalic acid | BHET |  |
MHET, TPA, EG |
| Ethylene glycol bis (p-methyl benzoate) | 2PET |  |
4-methylbenzoic acid |
| Polyethylene glycol terephthalate | PET |  |
MHET, TPA, EG |
PET的水解产物TPA、MHET、BHET均含有羰基，在240−244 nm范围内具有紫外吸收[6, 8, 15]。此外，这3种产物上带有的苯环也具有吸光性[16]，在254−260 nm范围内可以检测到紫外吸收[17-19]。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)被广泛应用于定量检测PET水解产物。其基本原理是流动相各组分经过固定相时，与固定相之间发生作用的强度不同，导致在固定相中滞留时间不同，达到分离的目的。使用反相色谱柱ODS (octadecylsilyl，也称C18)可以有效地分离PET水解产生的化合物，即TPA、MHET和BHET[6, 8, 20]。将反应混合物装入用极性流动相平衡过的色谱柱中，通过提高有机溶剂的浓度进行梯度洗脱。3种产物在洗脱过程中，TPA的保留时间最短，BHET的保留时间最长。
2016年，Yoshida等[8]报道，从暴露于PET的天然微生物群落中筛选出一株名为大版伊德氏菌(Ideonella sakaiensis) 201-F6的新型细菌，它可以产生PET水解酶，以PET为主要能源和碳源生长。该酶因专一性降解PET而被命名为PETase。通过对PETase水解PET后的产物进行分析，研究人员发现，降解产物中MHET含量最多，同时含有少量的TPA和BHET。近年来，对PETase进行改造成为全球范围内的热门研究课题。2020年，Son等[18]通过结构生物信息学分析对PETase的底物结合位点进行优化，以瓶级PET膜为底物，通过HPLC测定PETase突变体的PET水解活性，得到了热稳定性更高的突变体PETaseS121E/D186H/S242T/N246D。在37 ℃条件下，该变体可以保持20 d的PET水解活性。2022年，Lu等[21]通过HPLC分析改造后的PETase突变体FAST-PETase的水解活性，发现FAST-PETase在50 ℃条件下96 h内生成了33.8 mmol/L的PET单体，并在不到两周的时间内基本完全降解热预处理后的水瓶(约9 g)。HPLC是目前唯一能准确定量PET降解产物的检测方法[8, 14, 17, 22-25]。其准确性和灵敏性对于降解分析非常重要。但是该方法在分析速度和吞吐量上受到一定限制，难以应用于大型突变体文库和宏基因组文库的筛选。可以通过优化洗脱梯度减少分析时间，提高分析效率。此外，HPLC无法“连续”测量同一酶反应的酶动力学。
目前，可以进行高速分析的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)已经被广泛应用，相比HPLC，UPLC具有更快的筛选速度、更高的灵敏度以及更好的分离度，使得分析时间大大缩短，同时还可以减少溶剂用量，降低分析成本。2020年，Tournier等[6]通过计算机辅助酶工程，使用UPLC对PET解聚动力学进行测定，获得了叶枝堆肥角质酶(leaf-branch compost cutinase, LCC)突变体ICCG，将酶催化PET解聚的转化率提高到了90%。2022年，Bell等[26]以筛选高温下酶活性提高的PETase突变体为目的，利用UPLC搭建了一个自动化、高通量的定向进化平台，成功获得了一种耐热的PETase突变体(HotPETase, Tm=82.5 ℃)，该变体可以更快地解聚半结晶PET。Bell等[26]开发的UPLC方法，能够在2 min内完成对单一降解反应产生的MHET和TPA的分析，在2 d内对2 000多种酶变体的降解活性进行测定。UPLC具有分离度高、检测速度快、灵敏度高等优点，是一种理想的高通量检测方法，但是UPLC设备价格相对昂贵，现实中需要结合实际需求选择设备。
2 基于PET纳米颗粒的琼脂平板培养快速筛选法琼脂板培养快速筛选法解决了HPLC检测通量低的问题，是宏基因组文库中活性筛选的常用工具，特别是对于脂肪分解酶的筛选[27-28]。在琼脂平板制备时加入PET，就可以通过菌落周围产生透明水解圈的大小筛选具有PET水解活性的菌落[29-30]。PET水解是一个表面侵蚀的过程，由于PET分子排列致密，使得PET水解酶只能接触到PET表面的酯键。将固态PET制备成纳米颗粒可以有效提高PET水解酶与PET的接触面积，直径为100 nm的PET颗粒的比表面积大约是直径为300 μm的PET片的3 000倍[31]。此前，Gan等[32-33]利用激光散射法对假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶水解聚己内酯(polycaprolactone, PCL)纳米颗粒的活性进行了研究，发现使用PCL纳米颗粒代替薄膜时，酶解速度提高了103倍。这说明通过使用纳米级的PET颗粒，提高聚合物的比表面积，进而提高酶的降解速率是可行的。Pirillo等[34]将0.5 g PET溶解在50 mL六氟异丙醇中，在剧烈的搅拌下，将PET溶液滴入500 mL蒸馏水中，PET在水中被稀释形成纳米颗粒，通过过滤除去较大颗粒，并使用蒸发器除去沸点较低的六氟异丙醇，干燥后得到平均直径为80 nm的颗粒，随后将PET纳米颗粒加入到琼脂平板的制备中。Danso等[35]将具有PET降解活性的克隆接种到含有PET纳米颗粒的琼脂平板上，过夜培养后，菌落周围产生了透明水解圈。Charnock[36]将商业PET片加到二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中，加热至180 ℃溶解PET，随后在将PET溶液滴入到琼脂中的同时，使用超声波均质仪将PET分散到琼脂中，在平板上接种菌落之后，能够水解PET的细菌菌落周围会形成透明水解圈，由此判断菌落是否存在PET降解活性，此方法快速、高效，每周可以筛选数百万个克隆[37]。
2021年，Liu等[38]提出了一种新的共培养体系来回收PET和BHET水解后的单体。他们将水解PET与生成聚羟基丁酸酯(polyhydroxy butyrate, PHB)耦合，在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) Po1f中表达来自Ideonella sakaiensis 201-F6的PETase，将PET粉末和BHET添加到琼脂平板中，发现表达解脂耶氏酵母Po1f菌落的周围形成了透明的水解圈，表明该菌落能够分泌PETase。然后，Liu等[38]将含有来自真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)的phbCAB操纵子的重组质粒转化至从PET废物中分离的TPA降解菌株旋施假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中。以共培养的方式在一个发酵步骤中直接水解BHET生成生物塑料PHB。该研究为利用人工微生物菌群实现PET废弃物的生物降解和回收利用提供了新的思路。2022年，为了实现IsPETase的定向进化，Wang等[39]以BHET作为PET的模型底物添加至琼脂平板中，通过菌落周围产生透明水解圈直径的大小反映酶的活性水平，最终获得了活性较高的突变体IsPETaseS139T。2022年，Zhang等[30]为了探索潜在的隶属于拟杆菌门(Bacteroidetes)的PET酯酶，通过基于隐马尔可夫模型(hidden markov model, HMM)的PETase特异性搜索算法，从黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)中鉴定了几个PETase候选基因。在含有三丁酸甘油酯(tributyrin, TBT)的琼脂平板进行初步测试，筛选出具有酯酶活性的重组酯酶，这些酯酶也能够水解对硝基苯基己酸酯和对硝基苯基癸酸酯，随后将重组酯酶进一步在含有聚己内酯(polymeric polycaprolactone, PCL)、BHET和聚氨酯(polyurethane, PU)的琼脂平板上进行孵育，在这些底物的琼脂板上均产生明显的透明水解圈，随后使用UPLC验证了这些酯酶对PET的水解活性。
琼脂平板培养快速筛选法是一种简单直接的筛选方法，但是对PET水解酶突变体间差异的可视化较弱，仅适用于突变体的初步筛选，排除无活性或活性极低的突变体，筛选出的突变体的水解活性仍需要其他检测方法如HPLC或UPLC法进行准确定量。另外，该方法大多需要将酶展示在细胞表面或进行外泌表达，无法筛选进行胞内表达的微生物，可以尝试将微生物细胞裂解，将细胞粗提物滴加到平板上，通过控制温度与湿度进行降解反应。
3 基于紫外/可见光分光光度计的分析方法在表征和筛选PET水解酶中的应用基于紫外/可见光分光光度计的分析方法，其原理是通过检测反应体系中生成具有光吸收性产物所引起的吸光度变化，或测定由合适的pH指示剂染料所引起的吸光度变化来分析。另外，也可通过反应体系浊度的变化来检测PET水解酶活性。
3.1 比色法测定4‐硝基苯酚的水解度在表征和筛选PET水解酶中的应用在开发高效PET水解酶的过程中，对PET水解酶的动力学进行研究有助于了解酶的催化机制，对酶的理性改造具有指导意义。由于PET水解过程缓慢，导致以PET为底物进行PET水解酶动力学分析时，无法获得有效的动力学参数，如Km和Kcat等。另外，由于PET分子量巨大，在解析PET水解酶的酶促水解机理时，难以获得酶与PET配体的复合物，因此需要选择降解速度快且分子量小的底物进行酶促测定[40]。4‐硝基苯酚(p-nitrophenyl, pNP)是一种常用的酯酶(EC.3.1.1.X)活性测定化合物，例如脂肪酶(E.C.3.1.1.3)[41]。大多数酶促测定以pNP衍生物为底物，例如pNPA和对硝基苯基丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate, pNPB)。酯酶通过水解pNP衍生物中酰基和pNP之间的酯键生成pNP单体，在碱性条件下pNP显黄色，通过在405−420 nm处测定其吸光度进行定量[42-43]。2013年，Ribitsch等[44]以pNPB为底物测定了角质酶Thc_Cut1及其余2个结合模块的融合蛋白的动力学参数Km和Kcat。2015年，Dimarogona等[45]以pNPA、pNPB等底物对纯化后的角质酶进行动力学研究，在410 nm下检测pNP的吸光度，计算动力学常数Km和Kcat。其中一个酶活性单位被定义为每分钟释放1 μmol/L pNP的酶量。2016年，Yoshida等[8]测定了PETase和其同源酶对pNP连接的脂肪酸酯的活性。pNP衍生物分解过程简单，结果易于测定，可应用于酶学分析以及随机诱变过程中活性与非活性克隆比例的测定。此外，连接不同链长脂肪酸酯的pNP衍生物可以用来探测酶活性位点的大小。2019年，Liu等[46]测试了PETase对5种pNP酯的活性，为了使PETase能够水解萘酯，他们根据晶体结构信息设计了突变体进行定点突变，得到了能够水解萘酯的突变体PETaseS93M、PETaseW159F和PETaseN241F。
由于pNP的解离常数与pH和温度有关，所以在分析pNP的吸光度时，需要考虑pH和温度的影响[41]。另外，该方法的主要缺点是PET和pNP脂肪酸酯之间的结构相似性较低，不能完全反映酶对PET的水解能力。但该方法适合用于大规模初筛具有酯键水解能力的酶，大大降低了初期的筛选压力。
3.2 紫外吸光度法分析PET的酶水解动力学紫外(ultraviolet, UV)吸光度法检测PET水解酶活性可以作为一种高通量筛选手段。其检测原理与HPLC相似，都是基于PET水解产物MHET、TPA、BHET上苯环的吸光性[6, 17, 23-24]。2021年，Zhong-Johnson等[47]提出了一种简单、快速和高效的PET水解酶筛选方法，该方法基于PET水解产物在260 nm处的吸光特性，通过NanoDrop或UV分光光度计测定酶反应动力学。此外，研究人员还比较了PETase的耐热突变体TS-PETase和野生型PETase的动力学曲线，发现该方法能够反映耐热突变引起的酶行为变化，耐热突变株可以在不提高酶催化速率的情况下随时间的推移产生更多的产物。尽管与野生型相比具有相似的内在催化潜能，但耐热突变体无论在常温还是高温下，都表现出优异的PET降解能力。此外，当野生型PETase失去活性后，耐热突变体仍能随着时间的推移继续水解PET，从而提高了TS-PETase的总转化率。如果缺少动力学研究，TS-PETase转化率的提高可能被错误地归因于催化性能的提高，而不是稳定性的提高。该研究表明，紫外吸光度法能准确测定PET水解酶的动力学特征，如反应轨迹和反应的线性区域等。
总的来说，该法简单、快速，是一种高通量的检测方法，并能反映酶动力学的变化。但其单独使用可能存在问题，还需要通过HPLC进行结果验证。另外，该方法的局限性在于检测前要将不溶性的底物与可溶性的水解产物分离，因此只适用于易分离的底物。2022年，Thomsen等[48]提出了一种分区的UV测定法，用于连续检测PET酶降解过程中生成的可溶性水解产物。该方法将透明微孔板中两个对角相邻孔的壁去除，以确保2个相邻孔之间的可溶性酶水解产物通过，一个孔用于容纳PET片，另一个用于在240 nm处连续读取酶产物的吸光度。该方法省去了将底物分离的步骤，并可实现同一酶反应的“连续”检测。其次，酶降解机制的不同会导致产物生成的比例不一样，而UV测定法只能反映产物混合物整体的吸光度，无法对每种产物进行定量，不能进一步分析酶的降解机制。
3.3 浊度法分析PET纳米颗粒的水解度浊度法分析PET水解酶活性的体系相对简单，可应用于96孔板筛选，具有一定的通量，不需要将底物与产物进行分离，而且可以直接以PET作为反应底物，排除非特异性底物带来的误差。其原理是PET纳米颗粒分散在水中产生丁达尔效应，通过分光光度计记录溶液在600 nm处的光密度(OD600)来测定溶液的浊度[49]。在PET纳米颗粒的酶解过程中，随着悬浮液中纳米颗粒尺寸和数量的降低，溶液的OD600将会降低，其降低速率与酶活性成正比[50]。
为了研究聚酯水解酶TfCut2对PET纳米颗粒的降解活性，Wei等[50]将PET纳米颗粒固定在琼脂糖凝胶中进行快速酶解，避免了反应过程中较大粒径颗粒的沉淀。利用分光光度计在600 nm处测定纳米颗粒酶解引起的浊度的降低，由此直接计算出酶解反应的初始反应速率和相应的动力学常数。2019年，Wei等[51]又报道了一种新的浊度法，用于快速筛选具有BHET和乙二醇双(对-甲基苯甲酸酯) [ethylene glycol bis (p-methyl benzoate), 2PET]两种PET模型底物水解活性的酶。该方法通过预混BHET和2PET纳米颗粒悬液与四甲基乙二胺(etramethylethylenediamine, TEMED)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris hydrochloride, Tris-HCl)和商业Rotiphorese凝胶原液，得到底物预混液。向微孔板中加入过硫酸铵溶液和TfCa酶液后，将底物预混液加入到微孔板中，将微孔板放入预热至60 ℃的微孔板读取器中，监测浊度下降情况。
通过将PET底物固定在琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶的浊度测定法，避免了底物形成沉淀而带来的比浊度测量误差，具有较好的重复性。同时浊度法还可以测量PET水解酶对于其他底物的活性，如BHET和2PET。但是，基于微孔板的浊度分析法检测通量有限，难以应用于大型文库的筛选。相比之下，琼脂平板培养快速筛选法的通量要高于浊度分析法。
4 荧光法在表征和筛选PET水解酶中的应用 4.1 基于TPA的微孔板荧光检测法在筛选PET水解酶中的应用在很早以前的研究中就已经提出使用荧光法定量检测TPA可以反映PET水解酶的降解活性[52-53]。TPA以对苯二甲酸酯的形式存在于碱性缓冲液中。1994年，Mason等[54]报道在碱性缓冲液(pH > 8)中，TPA以去质子化形式存在，可以与过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)中的羟基自由基(hydroxyl radical，分子式为·OH)发生反应，产生带有荧光的羟基对苯二甲酸离子(2-hydroxyterephthalate, HOTP)。2003年，O’NEILL等[55]将TPA与H2O2在90 ℃下反应30 min后，用激发波长为315 nm的发光光谱仪在300–600 nm之间扫描样品，在425 nm的发射波长下检测到HOTP的存在。但是，H2O2和TPA反应转化为HOTP需要在90 ℃的高温下进行，会导致样品产生气泡，严重干扰荧光分析。此外，90 ℃的高温也不适合在微孔板读取器中进行操作分析，难以应用于大规模筛选。芬顿(Fendon)反应中，铁(ferrum，化学式为Fe)在室温下自氧化产生游离的·OH[56]，可以代替H2O2。Fe(Ⅱ)与乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)络合物通过稳定Fe(Ⅲ)来促进这一反应的发生[57]，从而促进TPA的羟基化。此外，多种化合物清除·OH的能力也可以用Fe(Ⅱ)-EDTA络合物介导的TPA羟基化反应评估[58-60]。
2012年，Wei等[61]建立了一种适用于96孔微孔板的TPA荧光检测法，用于PET水解酶活性的检测。该方法基于Fe自氧化介导的fendon反应，将PET水解产物置于96孔微孔板中，在每个孔中加入5 mmol/L EDTA、5 mmol/L硫酸亚铁(ferrous sulfate, FeSO4)和pH 8.5的磷酸盐缓冲液，在室温下孵育10 min，引发TPA的羟基化反应，随后在360 nm的激发波长和465 nm的发射波长下，检测荧光产物HOTP (图 1)。HOTP荧光强度与TPA浓度(0.01−0.075 mmol/L)之间呈线性关系，HOTP荧光在室温下可稳定保持50 min。2020年，Pfaff等[62]改进了TPA荧光分析法，在添加ZYM-5052自诱导培养基的96深孔板中表达来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusa) KW3菌株的TfCut2及其失活变异体TfCut2_S130A。通过在−80 ℃反复冻融获得粗细胞裂解物，离心后取可溶性蛋白上清液，在96孔板中将其与PET纳米颗粒进行水解反应，随后向每孔反应液中加入25 μL EDTA (5 mmol/L)和25 μL FeSO4 (5 mmol/L)，在室温下孵育10 min引发TPA的羟基化反应，并使用微孔板读取器检测在315 nm处激发波长和在421 nm处发射波长下的荧光强度。考虑到PET的主降解产物有TPA和MHET，只检测TPA的荧光强度存在一定的局限性，Weigert等[63]向反应液中添加了200 mmol/L的MHET降解酶MHETase，在10 min后MHET被完全转化为TPA。此外，Weigert等[63]还将PET溶解在三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)中，并将其应用于96孔或384孔板的涂层。通过控制涂层干燥步骤中的温度得到不同结晶度的PET薄膜，在减少荧光测定过程中分离底物步骤的同时，还可以检测不同结晶度下PET水解酶的降解情况。
芬顿反应介导的荧光检测，可以有效地区分活性和非活性PET水解酶。该方法也适用于新型PET水解酶突变体文库的筛选，通常比吸光度法更加灵敏，适用于检测浓度较低的化合物。而且当反应混合物中有残留酶时，会干扰HPLC以及UV吸光度的测定，该方法则不受残留酶的影响。但是会受到其他能与·OH发生反应的物质的干扰，如Tris缓冲液，因此，在测定时一般选择磷酸盐缓冲液。
4.2 基于荧光激活液滴分选系统的超高通量PET水解酶活性检测法基于微液滴微反应器的超高通量酶活筛选体系是一项新技术。该技术通过将表达有目标酶的细菌细胞、荧光底物及构成反应体系的其他成分包裹在直径仅有几微米的“水-油”一级微液滴或“水-油-水”二级微液滴中，形成酶微反应器[64] (图 2A)。利用流式细胞仪或微流控芯片，根据微反应器中产物的荧光信号强度来定量酶活性。2022年，Qiao等[65]研发了一种荧光激活液滴分选(fluorescence-activated droplet sorting, FADS)系统，用于高通量筛选水解PET的微生物或变体酶。该系统包括3个模块：产生和孵化微液滴的模块、以荧光素二苯甲酸酯(fluorescein dibenzoate, FDBz)作为荧光探针的微量注射模块，以及用于检测和分选具有PET降解活性微液滴的模块(图 2B)。研究人员利用搭建的微流控平台，从一家涤纶纺织厂的废水样本中，筛选得到了9个不同种属的具有PET降解活性的菌株。FADS系统可以加快筛选速度，极大地简化操作流程，提高分选效率和灵活性，同时降低大型文库筛选的成本。除PET外，FADS系统还可以应用于筛选水解其他合成塑料的微生物或酶，如聚酯[66]、聚乙烯[67]和聚碳酸酯[68]等。
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| 图 2 荧光激活液滴分选系统 Fig. 2 Fluorescence activated droplet sorting system. A：一级微液滴和二级微液滴酶微反应器[64]. B：分选系统的3大组成部分，包括微液滴生成、微液滴注射和荧光激活分选[65] A: Primary microdroplet and secondary microdroplet enzyme microreactor[64]. B: Three major components of the sorting system, including microdroplet generation, microdroplet injection and fluorescence activated sorting[65]. |
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该方法不需要针对目标酶设计特定的底物分子或复杂的筛选体系，理论上只要有适合于微液滴实验的荧光底物即可，具有极高的通用性。基于荧光激活液滴分选系统的超高通量筛选平台，为通过随机诱变和定向进化获得高活性PET水解酶提供了可能性。虽然该方法中的底物FDBz很早便被合成用于脂肪酶的鉴定，但是FDBz与PET结构相似性低，不是PET水解酶的特异性底物，在筛选的过程中可能更倾向于筛选出具有脂肪酶活性的菌株。因此该方法适合大规模初筛具有酯键水解活性的酶，无法特异性地筛选出具有PET水解活性的酶。
Zumstein等[69]提出一个概念性方法，通过监测嵌入聚酯的酯基荧光探针经共水解产生的荧光，来跟踪聚酯的水解。这项工作的目标是开发和验证一种酶促聚酯水解法，研究人员以二月桂酸荧光素(fluorescein dilaurate, FDL)作为探针，月桂酸基将探针有效地固定在聚己二酸丁二醇酯基质中，从而将探针从聚酯中的浸出降至最低。此外，水解产物荧光素是高度水溶性的，很容易通过荧光测量检测到。该方法可应用于筛选PET水解酶的荧光激活液滴分选系统，有望克服底物特异性的问题。
5 基于生物传感器的超高通量PET水解酶活性检测法针对PET水解产物TPA建立智能和易于应用的生物传感器，可实现对自然界中水解PET的微生物的快速筛选，有望成为一种高通量的筛选方法。先前的研究报道了一些参与吸收TPA的转录因子：TpiA-TpiB[70]、TphR[71]，以及其降解途径[72]等。这些转录因子可以被用来生成生物传感器。到目前为止，报道了3种可以应用于检测TPA的生物传感器。
Pardo等[71]设计了一种TPA生物传感器，该传感器由睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterone)的转录因子TphR及其调控核苷酸序列和超折叠绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein, sfGFP)组成，用来评估贝利不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADP1对TPA的转运能力。在睾丸酮丛毛单胞菌株中，TphR是一种转录激活剂，与TPA结合后，负责将TPA转化为原儿茶酸盐。该生物传感器系统结合流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)可以筛选吸收TPA的贝利不动杆菌突变体。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的转录因子XylS能结合苯甲酸和各种衍生物，但不能识别TPA[73-75]。2022年，Li等[76]对XylS进行定向进化，生成了一种能够结合TPA并对其作出反应的XylS突变体，该突变体可用于构建全细胞生物传感器。将xylS基因、启动子Pm和绿色荧光蛋白编码基因(sfGFP)重组到pUC57质粒(图 3A)，将重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)细胞中，生成一种新的大肠杆菌生物传感器pUC57-Xyls-sfGFP，并应用于TPA的荧光检测。培养BL21(DE3)细胞，在细胞OD600达到0.6时，加入不同浓度的TPA，收集不同时间段下的样品，在488 nm的激发波长和515 nm的发射波长下检测样品的荧光强度。在这一理念的引领下，利用RNA高通量测序技术，将很快识别出更多的用来降解此类聚合物的寡聚物和单体的启动子，从而为开发更高效的生物传感器奠定基础。
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| 图 3 通过检测TPA来筛选PET水解酶的生物传感器的示意图[76-77] Fig. 3 Biosensor used for screening PET hydrolases by detecting TPA[76-77]. A：用于TPA荧光检测的工程化XylS全细胞生物传感器. B：用于检测大肠杆菌中TPA的酶偶联生物传感器 A: Fluorimetric detection of TPA using engineered XylS-based whole-cell biosensor. B: Enzyme-coupled biosensor for the detection of TPA in E. coli. |
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2022年，Bayer等[77]构建了一种细胞传感器，用于TPA的高通量检测。该细胞传感器将羧酸还原酶(carboxylate reductase, CARMm)和来自发光假单胞菌(P. luminescens)的荧光素酶LuxAB偶联，LuxAB用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)中结构多样的醛类[78]。CARMm将TPA还原为4-羧基苯甲醛(4-carboxybenzaldehyde, 4-CBAL)和对苯二甲醛(terephthalaldehde, TAL)后，进一步被荧光素酶LuxAB感知，并产生生物荧光(图 3B)。荧光强度反映水解产物中TPA的量，可以作为评估PET水解酶活性的方法。该系统不仅为TPA提供了基于生物传感器的高通量分析方法，而且在反应过程中生成了TPA衍生的高活性醛，如TAL，避免了危险的化学反应过程[79]，同时将TAL在同一反应容器中进行转化，可以得到相应的二胺，具有潜在的工业应用价值[80-81]。
全细胞生物传感器可以直接检测PET降解产物，为PET水解酶提供了一种通用的筛选方法。通过优化生物传感器组件和开发更高效的用于TPA检测的转录因子，以进一步提高生物传感器的检测性能，推动高效PET水解酶的研究进展。但是上述3种方法能否成功应用于大规模文库的筛选还需实验进行验证。另外，PET主降解产物为MHET，基于TPA检测的生物传感器可能只部分反映PET水解酶的活性，因此可以在该方法的基础上进行优化，筛选出能够同时识别MHET和TPA的菌株，从而建立更准确的检测方法，为更深入地了解PET水解酶活性提供帮助。
6 展望酶生物催化降解法为可持续管理和回收PET塑料垃圾提供了一种绿色化学的替代方案。通过将酶介导的生物催化降解整合到塑料回收过程中，以配合或取代目前的回收方法。例如，将机械处理后的PET材料，转移到含有PET降解酶的生物反应器中进行生物催化解聚，生成解聚单体并合成新的塑料产品或升级为价值更高的产品[82]。虽然这方面的研究工作在最近取得了重大进展，但在工业层面上将酶生物催化大规模应用于PET回收仍然存在关键挑战，其中一项是如何开发有效且高效的PET水解酶筛选方法，从宏基因组学或突变体库中发现高效的PET水解酶。
目前的PET水解酶筛选方法大多集中于底物的变化或者产物的生成方面。只有HPLC和UPLC检测法能够实现PET水解产物的定量检测。可以实现PET水解产物半定量检测的方法有UV吸光度法、浊度法、基于TPA的微孔板荧光法和生物传感器法，这些方法能够整体反映PET水解酶活性的高低而无法确定具体的产物量。琼脂板培养快速筛选法只能定性检测有无PET水解酶活性而无法反映水解能力的强弱。pNP比色法和以FDBz为底物的荧光激活液滴分选系统可定性检测酶有无酯键水解活性而无法确定酶是否具有PET水解活性，需要进一步进行PET水解活性验证。
上述检测方法均存在一定的局限性。在实际测定过程中，建议将几种检测方法结合使用或者将目前这些方法进行优势整合，开发出简便易行且成本低廉的高效筛选方法。例如，HPLC可以定量检测反应产物，分析酶的分子机制，但是低通量使得HPLC不适用于初筛和动力学测量，而紫外分光光度法可以快速进行分析筛选，反映酶的催化能力，2种方法相辅相成，可以深入研究PET水解酶的内切活性和外源活性。此外，将基于TPA的微孔板荧光检测法与荧光激活液滴分选系统相结合，以PET纳米颗粒作为底物，利用荧光激活液滴分选系统检测TPA荧光，避免了非特异性底物带来的假阳性结果的误差，提高了分选效率。另外，组学技术、合成生物学、蛋白质工程技术的快速发展，为发现、表征、修饰PET降解酶提供了一系列强大的工具，为寻找高效和低成本的新型PET水解酶提供了新的可能性，结合高效的筛选方法，将大大推动高效PET水解酶的研究进展。
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