2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 官嫒林, 张萌, 许菲
- GUAN Ailin, ZHANG Meng, XU Fei
- 结构指导的玉米赤霉烯酮水解酶的热稳定性改造
- Structure-guided engineering for improving the thermal stability of zearalenone hydrolase
- 生物工程学报, 2023, 39(8): 3336-3350
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(8): 3336-3350
- 10.13345/j.cjb.220858
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文章历史
- Received: October 27, 2022
- Accepted: February 2, 2023
- Published: February 13, 2023
引用本文
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霉菌毒素污染一直是全球畜牧业和食品工业的重大威胁。据联合国粮农组织统计，全世界谷物供应中有25%以上受霉菌毒素污染而不能食用，由此造成的经济损失高达数千亿美元[1]，而且毒素的毒性还严重危害牲畜以及人类的健康[2-4]，所以从农产品中去除霉菌毒素是一个世界性的问题。玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌毒素[5]，哺乳动物因食用含有ZEN的饲料而在体内积累毒素，并造成一系列由雌性激素紊乱而引起的危害，主要表现为免疫抑制、食欲下降以及生长缓慢，同时ZEN对母畜繁殖产生障碍，持续中毒易引发不孕不育、流产和死胎现象[6]。
目前已有的ZEN脱毒方法包括物理法(热解、辐射处理等)、化学法(氧化、还原、水解等)和生物法(微生物降解、酶法等)[7]。然而物理法与化学法脱毒存在明显的缺陷，破坏谷物和饲料的营养成分、对产品造成二次污染、导致食品价值降低等[8]。因此，反应环境温和、水解能力高效和低成本的生物酶法脱毒在食品和饲料脱毒工业中展示出巨大的前景。目前从粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea) IFO 7063分离出的ZEN内酯水解酶ZHD101能有效水解ZEN及其衍生物的内酯环，达到脱毒的效果[9]。然而将酶催化剂应用到现有工业的过程常常对酶的耐热性有较高的需求。耐热酶可以减少反应过程的时间，并且相较于中温酶减少了反应混合物冷却再加热过程的能量消耗，耐热酶在环境温度下使用，可重复利用，且在固定化中易于回收[10]。ZHD101的最适温度在37−45 ℃，50 ℃会使得ZHD101丧失大部分活性[11]，这就限制了该酶在工业上的应用，因此ZHD101的热稳定性改造显得尤为重要。
蛋白质工程领域长期致力于提高酶的热稳定性，近年来随着计算机技术的发展，计算设计改造酶热稳定性的方法由于人力成本低、实验室进化时间短等优点，广受科研界的关注[12]。目前已有多种计算机辅助的蛋白质改造策略被开发出来，例如同源序列比对[13]、蛋白质构象自由能计算[14-15]、二硫键设计[16]等，这些方法依赖进化信息、能量信息来提高蛋白质的热稳定性。其中PROSS计算设计策略又通过将序列保守性信息与蛋白质构象自由能计算相结合，预测了包含51个突变位点的酶变体，将模式蛋白的Tm提高了20 ℃[14]。此外，基于结构特征的蛋白质改造策略引起了科学家的兴趣。ZHD101作为一种典型的α/β水解酶，其晶体结构(PDB ID: 3WZL)已被解析，具有一个结构灵活的帽子区域和结构稳定的催化结构域，同时通过丙氨酸扫描确认了ZHD101水解ZEN的Ser102-His242- Glu126催化三联体及其他关键残基[9]。α/β水解酶超家族酶类的成员通常共享具有相似关键残基的基本催化支架，这类催化支架在进化中保持高度的结构相似性，然而这些酶在热稳定性、酶活性上存在很大的差异[13]。该类酶往往还具有一个结构灵活区域、环区或者帽子区域(cap domain)，有研究表明这是形成酶性质差异的原因之一[9, 17-18]。这部分区域由于暴露在溶液表面，在与溶剂和底物分子发生相互作用时会产生较大的构象变化，而这种结构上的灵活性、多变性，使其成为了蛋白质热稳定性改造的热点区域。例如，基于两种嗜热糖苷酶的结构灵活区域的移植互换，得到的酶变体在70 ℃下的半衰期延长11.8倍[19]；对定向进化改造后的蛋白酶分析，发现大多数突变位点都位于结构灵活的区域，其热稳定性能达到嗜热酶的强度[20]。将天然酶普适的计算设计改造策略与α/β水解酶特征结构分析相结合，可以弥补单一计算设计策略的局限性，减少设计中的假阳性概率，从而实现高效的改造策略开发。
本研究以ZHD101为研究对象，首先通过多蛋白质结构比对筛选出结构灵活区，进一步对灵活区域残基进行序列保守性分析和构象自由能计算，结合3种策略，从结构、进化和能量多方面因素筛选获得潜在的提高热稳定性的突变文库，以期开发出热稳定性增强的ZHD101变体，拓展其工业应用范围，并为蛋白质的热稳定性改造提供新的计算设计策略。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株表达载体pET-28a(+)与大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)菌株，购自Novagen公司。玉米赤霉烯酮水解酶基因zhd101，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
1.1.2 主要试剂PrimeSTAR HS (premix)高保真PCR酶、DL 10 000 DNA Marker以及Premixed Protein Maker购于TaKaRa公司；质粒DNA提取试剂盒以及DNA胶回收试剂盒购于爱思进生物技术有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；PCR引物由亦欣生物科技(上海)有限公司合成；玉米赤霉烯酮购于Sigma-Aldrich公司。甲醇与乙腈为市售高效液相色谱纯，其余试剂均为市售分析纯。
1.2 方法 1.2.1 蛋白质结构比对基于蛋白质结构比对筛选出结构灵活区域的步骤如下：(1) 首先，基于ZHD101的晶体结构(PDB ID: 3WZL)，利用mTM-align[21]服务器的第一个模块构建蛋白质结构文库，mTM-align算法以TM-score大于0.5为筛选条件生成蛋白质结构文库，TM-score分值表明了这些结构与目的蛋白质的结构相似性打分，相似性越高分值越接近1；(2) 对蛋白质结构文库除冗杂(排除同类酶的变体)，通过蛋白质间成对的TM-score分值生成基于结构的系统发育树；(3) 进一步通过检索蛋白质的热稳定性信息，选出6个代表性的PDB结构。利用mTM-align服务器的第二个模块，生成所选蛋白质的多蛋白质结构比对(multiple structure alignment, MSTA)结果，在MSTA结果中，对多蛋白质序列和结构之间进行匹配，并计算配对残基之间的距离，将序列对齐有空位或配对残基距离大于等于4 Å的区域认为是灵活的，并作为热稳定性改造的候选区域。
1.2.2 构象自由能计算基于ZHD101的晶体结构，对每个残基进行虚拟饱和突变。利用基于力场的能量算法(rosetta_cartesian_ddg)计算出ZHD101虚拟饱和突变体的构象自由能差值(ΔΔG)[14]，计算公式如下：
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其中，ΔG表示蛋白质解折叠自由能差值。
Rosetta_Cartesian_ddg算法[22]：首先对每个虚拟突变体使用FastRelax进行优化，确定野生型以及点突变氨基酸最佳的侧链排布方式；再使用卡迪尔空间版本的FastRelax对局部区域(点突变位置6 Å范围内)进行彻底优化以获得Relax后的突变体结构；最后评估野生型以及突变型蛋白的能量差，并使用能量函数特异性的校正因子对ΔΔG进一步矫正，能量单位为kcal/mol。
1.2.3 序列保守性分析基于蛋白质的序列信息，ConSurf[23-25]服务器(https://consurf.tau.ac.il/consurf-old.php)可以根据同源序列之间的系统发育关系来估算蛋白质不同氨基酸位置的序列保守性。ZHD101的晶体结构被提交到ConSurf服务器，使用默认参数计算各个残基的序列保守性分数(consurf score)，Consurf score分值从位点可变到位点保守为1−9共9个离散等级，并将数值按照颜色投影在蛋白质的结构中[26-27]。
1.2.4 分子动力学模拟分子动力学模拟使用AMBER99SB-ILDN力场在Gromacs 5.0.4软件中实现[28]。以ZHD101的晶体结构(PDB ID: 3WZL)作为分子动力学模拟的初始结构，突变体初始构象通过PyMOL (http://www.pymol.org)进行氨基酸替换获得。首先将蛋白质置于正方体的水盒子中，采用TIP3P模型的水分子[29]，其中范德华相互和静电相互作用的最小截止距离为12 Å。随后采用Steepest Descent方法[30]对模拟系统进行能量最小化。接着通过Velocity Rescaling算法保持体系温度310 K，并且使用Berendsen的弱耦合方法控制压力为1 bar[31]，将模拟的时间步长设置为2 fs，先后进行1 ns NVT (N为粒子数，V为体积，T为温度)，1 ns NPT (N为粒子数，P为压力，T为温度)的模型优化，最终进行开放限制的200 ns NPT平衡模拟。
在基于MD的作用力的分析中，氢键的定义为：采用几何准则定义氢键，两个参数分别为供体(N)-受体(O)的距离(RNO)和3个原子之间的∠HNO，其截断值为3.5 Å和30°[32]；盐桥的定义为：带正电(Arg或Lys)氨基酸酰胺基团中的氮原子与带负电(Glu或Asp)氨基酸羧酸酯基团中的氧原子之间的最小距离，其截断值为4 Å[33]。
1.2.5 定点突变及表达纯化以质粒pET28a-zhd101为模板，根据突变位点设计PCR上下游引物(表 1)进行全质粒PCR，对野生型的特定位点进行突变。将PCR产物回收后转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞中[34]。
| Primer name | Primer sequence (5′−3′) | Size (bp) |
| S220Y-F | CCGACAGAGTATTTCTTCGAC | 21 |
| S220Y-R | ATACTCTGTCGGGGTGGCGGC | 21 |
| S220R-F | CACCCCGACAGAGCGTTTCTTCGACAATATC | 31 |
| S220R-R | CTCTGTCGGGGTGGCGGCGCCAACTG | 26 |
| S220L-F | CACCCCGACAGAGCTGTTCTTCGACAATATC | 31 |
| S220L-R | CTCTGTCGGGGTGGCGGCGCCAACTG | 26 |
| S220F-F | GACAGAGTTCTTCTTCGACAATATC | 25 |
| S220F-R | GAAGAACTCTGTCGGGGTG | 19 |
| S220W-F | GACAGAGTGGTTCTTCGACAATATC | 25 |
| S220W-R | GAAGAACCACTCTGTCGGGGTG | 22 |
| S220M-F | CGACAGAGATGTTCTTCGACAATATCG | 27 |
| S220M-R | GAAGAACATCTCTGTCGGGGTGGC | 24 |
| S136M-F | GCTGGATCACCTGATGAACACAGCAGTG | 28 |
| S136M-R | CATCAGGTGATCCAGCAGTTTGGTCGGC | 28 |
| S136L-F | GCTGGATCACCTGCTGAACACAGCAGTG | 28 |
| S136L-R | CAGCAGGTGATCCAGCAGTTTGGTCGGC | 28 |
| S136A-F | GCTGGATCACCTGGCAAACACAGCAGTG | 28 |
| S136A-R | TGCCAGGTGATCCAGCAGTTTGGTCGG | 27 |
将重组菌株接种至LB液体培养基于37 ℃过夜培养(12 h左右)，然后以1%的接种量转接至TB培养基，培养至OD600达到0.6−0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导。诱导结束后，在10 000 r/min的离心条件下分离上清，留下细胞沉淀备用，随后利用超声破碎仪将细胞破碎超声(超声2 s，间歇3 s，30 min)，分离胞内上清和沉淀物。将胞内上清利用0.22 µm滤膜过滤除杂，随后利用His Trap HP柱进行镍柱亲和层析。亲和层析的过程为：首先用A液(0.02 mol/L Tris，0.02 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl)平衡10个柱体积，再以1 mL/min的流速上样，上样完成后用5%的B液(0.02 mol/L Tris，0.5 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl)除去杂蛋白，然后进行梯度洗脱(15%、25%和100%的B液)，在15%梯度时获得目的蛋白，最后用Desalting凝胶柱对目的蛋白进行脱盐处理。将纯化脱盐后的蛋白稀释至0.2 mg/mL，进行SDS-PAGE检验及后续的酶学实验。
1.2.6 圆二色谱实验圆二色谱(circular dichroism, CD)实验用于测定酶及突变体的二级结构和热熔融温度(Tm)。首先将纯化脱盐处理后的酶液稀释到0.2 mg/mL，取200 μL酶液加入光程为0.1 cm的石英比色皿进行CD实验。在4 ℃条件下，对样品进行190−260 nm范围内的全波长扫描，设定每步的增量0.5 nm，平均扫描时间2 ns，依据测得全波长的特征吸收峰来确定蛋白质的二级结构。随后进行热变实验，以最低吸收值(220 nm波长)作为热变吸光值，设置温度范围4−80 ℃，升温速率为1 ℃/min，测定其摩尔椭圆率的变化曲线。Tm通过以下公式估算：
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其中，θ(T)是实验测得的椭圆率，θF(T)和θU(T)是对折叠和展开的基线进行线性拟合得到的估计椭圆率，其中F(T)=0.5时，T等于Tm。
1.2.7 酶活性测定ZHD101的酶活力是利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测样品中底物ZEN减少量的方法来表征。在50 μL的0.02 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中加入10 μL ZEN，吹吸混匀后放置于35 ℃孵育10 min，孵育结束后加入40 μL纯酶液进行催化反应，反应时间为3 min，用200 μL的纯甲醇溶液作为反应终止剂。反应结束后经0.22 μm滤膜过滤后，取200 μL样品用于254 nm的吸光值下的HPLC检测，色谱条件为：流动相乙腈: 水= 60:40；流速为1 mL/min；柱温为30 ℃。为了计算ZHD101的比活力，用BCA法测定蛋白质浓度，样品放置的温度统一为37 ℃，时间为3 min。酶活力(U)的定义：在37 ℃，在1 min内能降解1 μg/mL ZEN所用的酶量。比活力(U/mg)按照如下公式的计算：
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其中，k为ZEN浓度标准曲线斜率；ΔA表示(实验组峰面积–对照组峰面积)，ΔT表示反应时间，单位：min；v表示体系浓度(mL)；m表示反应体系中单位体积的酶含量(mg)。相对酶活定义为：实验组比酶活力相较于对照组比酶活力的比值的百分比。
酶学参数的测定：(1) 最适反应温度(Topt)：将预混溶液分别置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃金属浴温度下预热5 min，然后加入40 μL酶液反应3 min，最后加入200 μL甲醇终止反应，通过高效液相色谱法测定剩余底物量来确定最适反应温度。(2) 热半失活温度(T50)：将酶液按每管40 μL分装，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃的金属浴温度下孵育10 min后，立即冰上放置10 min。将预混溶液在最适反应温度下预热5 min，然后分别加入40 μL经过热处理与冰上冷却的酶液，反应3 min，然后加入200 μL甲醇终止反应，通过高效液相色谱法测定剩余底物量计算得到热半失活温度，以样品中最高酶活力为100%计算其余温度下的相对酶活。(3) 热半失活时间(t1/2)：将酶液按每管40 μL分装，在45 ℃的金属浴温度下，分别孵育0、5、10、15、20、25、30 min，孵育时间到后立即与预混体系进行反应，加入200 μL甲醇终止反应后，通过高效液相色谱法测定剩余底物量计算得到热半失活时间，以0时刻样品的酶活力为100%计算其余时间下的相对酶活。
2 结果与分析 2.1 筛选热稳定性改造区域为了筛选热稳定性改造区域，首先通过mTM-align[21]算法，得到与ZHD101序列相似性低但结构相似性高的蛋白质文库，该文库共计2 580个PDB结构，其TM-score均大于0.5，其中有42%分布于0.60−0.70 (1 092个)以及43%分布于0.75−0.90 (1 108个)，并且在这些结构中有97% (2 504个)与ZHD101的序列相似性低于20% (图 1A)。随后对文库除冗杂(排除同类酶的变体)，基于TM-score构建系统发育树(图 1B)，结果表明该文库中的蛋白质有超过500种来源，行使5种以上的催化功能。随后检索文库中蛋白质的热稳定性数据，筛选出6个代表性蛋白质与ZHD101的热稳定性进行比较(表 2)，Tm、T50、Topt和t1/2的差异表明这些蛋白质大都有比ZHD101更高的热稳定性(除5XWZ外)。
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| 图 1 突变区域的选择 Fig. 1 Selection of non-conserved regions of the structure. A：ZHD101的MSTA文库中TM-score及序列相似性的核密度分布图. B：基于结构的系统发育树. C：所选蛋白质的结构比对. D：ZHD101的蛋白质拓扑结构示意图 A: Kernel density distribution map of TM-score and sequence similarity in MSTA library of ZHD101. B: Phylogenetic tree of ZHD101 structural analogs, the information from left to right is enzyme PDB ID, source, function, quantity; The horizontal line is the sequence similarity between the corresponding PDB structure and ZHD101; The "*" next to the organisms indicates that it has thermal stability data. C: Structural alignment of the selected proteins. D: Schematic diagram of the protein topology of ZHD101, the yellow dots represent catalytic triads, the 'α' stands for alpha helix and 'β' stands for beta sheet. |
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| PDB ID, chain | TM-score | Tm (℃) | T50 (℃) | Topt (℃) | T (℃), t1/2 (min) | Reference |
| 3WZL, A | 1 | 40.0 | 43.9 | 35 | 45 ℃, 5.5 | [9] |
| 5NG7, A | 0.825 9 | 55.0 | ≈45 | 30 | n.d. | [35] |
| 5NFQ, A | 0.805 1 | 85.0 | ≈75 | 50 | n.d. | [35] |
| 4UHC, A | 0.825 4 | n.d. | 80−85 | n.d. | n.d. | [36] |
| 5FRD, A | 0.801 0 | n.d. | 85−90 | 80 | n.d. | [37] |
| 2YH2, A | 0.650 4 | n.d. | n.d. | n.d. | 110, 56 | [38] |
| 5XWZ, A | 0.966 0 | n.d. | n.d. | 35 | 40, 2 | [39] |
| “n.d.” indicates that the data has not been determined by experiment. | ||||||
为了在整体相似的结构中寻找变化的区域，将已选的7个蛋白质进行MSTA分析。结果表明结构变化大的区域主要位于ZHD101的帽子区域(α5、α6、α7和α8)及α9和α10螺旋(图 1C、1D中的灰色区域)，α9连接了帽子区域第二层的α8，而α10位于蛋白质表面，与α5和α6形成了蛋白质空腔。此外，N端和C端由于暴露在溶液剂中而导致结构波动性大，不作为结构非保守区域的讨论。之前的研究中基于ZHD101的柔性(RMSF高)区域改造策略，通过对α7、α8和α9区域改造，获得了3个热稳定性均提高4 ℃以上的单点突变[34]。为避免重复实验，本研究选取α5、α6和α10作为研究区域。
2.2 构建突变文库为了在突变区域(α5和α6：L132−D157，α10：P217−G232，共计40个残基)确立突变热点残基，引入Consurf序列保守性分析[23]，筛选出该区域序列保守性低(consurf score < 5)的残基位点。结果表明突变区域中序列保守性低的残基共有24个(图 2A)。这24个残基大部分都位于蛋白质表面，部分残基的侧链指向溶剂区域。
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| 图 2 突变文库的构建 Fig. 2 Construction of mutant library. A：ZHD101序列保守性分析. B：氨基酸突变类型的统计. C：S136、N137、S220残基的构象自由能(ΔΔG)热图，斜线代表ΔΔG < –3.0 kcal/mol的突变体 A: Heatmap for conservation analysis of ZHD101, from the most variable fraction 1 being turquoise, to the middle conservative fraction 5 being white, to the most conservative fraction 9 being maroon. B: Statistics of amino acid mutation types. C: Conformational free energy (ΔΔG) heatmap of selected residues (S136, N137, S220), slashes represent mutants with ΔΔG < –3.0 kcal/mol. |
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为了进一步确定突变类型，基于ZHD101的晶体结构，在Pymol中对所选的24个残基进行虚拟饱和突变。使用Rosetta_Cartesian_DDG计算了每种突变情况引起的构象自由能变化(ΔΔG)。接着统计了该区域残基位点在虚拟饱和突变中展现出能量降低(ΔΔG < 0)的可突变氨基酸种类(没有突变类型的除外)，突变类型最多能达到16种(S220)，次好的有12种(S136和N137)，可突变氨基酸种类越多说明此位点对氨基酸突变耐受性越好，最终选择种类多于10种的残基位点(S136、N137、S220)作为突变热点残基(图 2B)。
最后，分析了这3个残基位点所有单点饱和突变的ΔΔG值，3个残基对甲硫氨酸和亮氨酸的突变倾向高(平均ΔΔG=−3.0 kcal/mol)，而均排斥脯氨酸和甘氨酸突变。为了富集正向突变，选取ΔΔG < –3.0 kcal/mol的突变为潜在候选突变设计，最终确定了S136M/L/A、S220Y/W/R/M/L/F共9种突变体(图 2C)。
2.3 野生型与突变体的表达纯化突变体使用全质粒PCR方法构建并在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中表达。将表达所得的蛋白质纯化后，采用SDS-PAGE进行验证，结果表明，野生型(WT)及突变体的分子量大小约为29.0 kDa，与理论值相符，且纯度达到电泳纯(图 3)。
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| 图 3 野生型ZHD101及其突变体在大肠杆菌中的表达纯化 Fig. 3 Expression and purification of wild type ZHD and its mutants using Escherichia coli BL21(DE3). M: Premixed protein marker; 1: Purified wild type ZHD; 2−10: Purified protein of mutant S220R, S220F, S220M, S220Y, S220L, S220W, S136M, S136L, S136A. |
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利用圆二色光谱对WT及突变体进行热力学稳定性表征，在4 ℃进行190−260 nm的全波长扫描，如全波长曲线所示(图 4A)，所有蛋白质全部折叠形成了正确的二级结构。在4−80 ℃的范围内测定蛋白质热熔融过程中椭圆率的变化情况。蛋白的热熔融温度(Tm)由220 ns波长下的热变曲线获得(图 4B)。表 2展示了WT及9种突变体的Tm值，9种突变体的热力学稳定性都有提高(ΔTm=0.4−5.6 ℃，表 3)，220残基位点表现好的突变体为S220R和S220W，其Tm分别提高了5.6 ℃和4.0 ℃，次好的突变体S220Y的Tm提高了1.8 ℃；136位点表现好的S136A、S136L，其Tm提高了1.7 ℃和1.4 ℃。
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| 图 4 ZHD101及其突变体的热力学稳定性的表征 Fig. 4 Far-UV CD spectra and thermal denaturation of wild type and its mutants. A：在4 ℃下的CD光谱. B：在220 nm处测定的热熔融曲线 A: CD spectra at 4 ℃ under pH 7, 20 mmol/L Tris-HCl buffer. B: Thermal melting curves monitored at 220 nm in Tris-HCl buffer. The samples were shown in colors as labeled in the plots. |
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| Mutant | Tm (℃) | ΔTm (℃) | Relative activity (%) | ΔΔG (kcal/mol) |
| WT | 40.0±0.4 | 0.0 | 100.0±3.2 | 0 |
| S220L | 40.4±0.1 | 0.4 | 70.6±9.4 | –3.798 |
| S220F | 40.9±0.1 | 0.9 | 61.6±2.2 | –3.798 |
| S220M | 41.1±0.3 | 1.1 | 61.0±3.3 | –3.972 |
| S220Y | 41.8±0.1 | 1.8 | 54.5±3.3 | –3.330 |
| S220W | 44.0±0.4 | 4.0 | 40.7±9.8 | –6.170 |
| S220R | 45.6±0.1 | 5.6 | 56.1±6.3 | –4.235 |
| S136M | 40.9±0.1 | 0.9 | 69.3±2.9 | –6.078 |
| S136L | 41.4±0.2 | 1.4 | 47.8±3.9 | –3.031 |
| S136A | 41.7±0.1 | 1.7 | 38.2±7.6 | –3.150 |
进一步测定了WT及突变体的酶活性，表 3中的酶活实验数据表明，突变体的相对酶活性都有损失(相对酶活性为38.2%−70.6%)。220号残基的6个突变体，其相对酶活性随着其热稳定性的提高而下降(除S220R突变外)，220号残基热稳定性表现好的突变体S220R和S220W的相对酶活性分别为56.1%和40.7%；136号残基的3个突变体也呈现同样的趋势，热稳定性较高的S136A和S136L的相对酶活性分别为38.2%和47.8%。
2.5 突变体S220R和S220W的动力学稳定性表征随后对ΔTm≥4.0 ℃的突变体S220R和S220W进行动力学稳定性的表征。测量最适反应温度(Topt)、热半失活温度(T50)和热半失活时间(t1/2) (表 4，图 5)。从最适反应温度(图 5A)可以看出突变体S220R和S220W的最适反应温度都向45 ℃漂移，相较于WT的最适反应温度35 ℃，升高了10 ℃；S220R、S220W的T50也分别增加了4.9 ℃和3.9 ℃ (图 5B)，这与Tm的增加趋势相同；S220R在45 ℃条件下的t1/2为90 min，S220W在45 ℃条件下的t1/2为22 min，相较于45 ℃下WT的t1/2 (5.5 min)分别延长了15.4倍和3.1倍(图 5C)；突变体在45 ℃时的相对酶活性相比于35 ℃时有所提高，表明酶在高温下的催化能力得到更多的保留。综合酶热力学稳定性及酶动力学稳定性的表征，说明S220R和S220W这两种突变体对酶的热稳定性有正向的改善。
| Mutant | Tm (℃) | ΔTm (℃) | 35 ℃ relative activity (%) | 45 ℃ relative activity (%) | Topt (℃) | T50 (℃) | t1/2 (min) |
| WT | 40.0±0.4 | 0.0 | 100.0±3.2 | 100.0±5.6 | 35.0 | 43.9 | 5.5 |
| S220R | 45.6±0.1 | 5.6 | 54.5±3.3 | 70.6±4.5 | 45.0 | 48.8 | 90.0 |
| S220W | 44.0±0.4 | 4.0 | 40.7±9.8 | 57.3±6.7 | 45.0 | 47.8 | 22.0 |
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| 图 5 酶动力学稳定性的表征 Fig. 5 Characterization of enzyme (WT, S220R, S220W) kinetic stability. A：最适反应温度Topt. B：热半失活温度T50. C：45 ℃热半失活时间t1/2；相对酶活指代各个突变体相对于自身最大值的酶活性 A: Optimal reaction temperature Topt. B: Thermal half-inactivation temperature T50. C: 45 ℃ thermal half-inactivation time t1/2. The relative enzyme activity of the ordinate refers to the enzyme activity of each mutant relative to its own maximum value. |
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为了探究S220R和S220W热稳定性提高的机理，对WT、S220R和S220W进行了200 ns的分子动力学模拟。首先基于轨迹计算了蛋白质主链原子Cα的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)及均方根波动(root mean square fluctuation, RMSF)。RMSD值用来反映蛋白质结构整体的波动性，WT、S220R和S220W的平均RMSD值分别是(1.6±0.2) Å、(1.9±0.2) Å和(1.5±0.3) Å，均小于3.2 Å[40]，表明其构象在模拟体系中处于稳定状态(图 6A)。RMSF值用来反映蛋白质残基的波动性，对于WT及突变体，其在MD模拟时长内具有较高RMSF值的区域与晶体结构中B因子所代表的柔性区域一致，并且覆盖了帽子区域(残基位置L132−P188的α5、α6、α7、α8螺旋区域) (图 6B)。此外，相较于WT帽子区域较高的构象波动性，S220R突变体帽子区域残基的RMSF值有所降低，S220R突变实现局部柔性区域的刚性化，从而对酶整体热稳定性的提高有利。相比于S220R突变，S220W突变体在帽子区域的RMSF值略有下降，变化不显著。
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| 图 6 分子动力学模拟分析 Fig. 6 Molecular dynamics simulation analysis for wild type (red) and mutant S220R (cyan), S220W (grey). A：均方根偏差. B：均方根波动和B因子映射的蛋白质三级结构，模型越粗代表B因子越大；方框标出的为帽子区域 A: The root mean square deviation (RMSD). B: The root mean square fluctuation (RMSF) and protein tertiary structure revealed by B factor, a thick model represents a large B factor; The squares highlight the cap domain. |
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为了进一步解析突变体热稳定性提高的机制，基于野生型和突变体Rosetta_fastRelax前后的结构和MD轨迹分析了突变位点附近区域的氢键或盐桥的距离分布及成键概率。首先，220位点无论是突变成R还是W，都可导致该残基的空间位置发生偏移，这种空间位置的变化导致220残基的主链O原子有更大概率与K130残基侧链上的N原子形成主链-侧链氢键，将该氢键命名为氢键A (图 7)，氢键A的距离在S220R_relax、S220W_relax突变体(7.7 Å)和野生型ZHD101 (7.1 Å)中略有差异(图 7A)；MD的结果显示，相较于WT，S220R和S220W两个突变体的氢键A的成键距离在3.5 Å内的分布密度更大(图 7B、7C)，其成键概率分别增加了37.1%和19.3%。
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| 图 7 氢键及盐桥作用力增强 Fig. 7 The enhancement of hydrogen bonds and salt bridge forces. A：野生型ZHD101、S220R_relax和S220W_relax结构中的氢键A和盐桥B成键情况. B：WT及突变体(S220R、S220W)在K130、S/W/R220、D223号残基中的相互作用力示意图. C：分子动力学模拟中的氢键A、盐桥B距离的核密度分布图 A: Hydrogen bond A and salt bridge B bonding in wild-type ZHD101, S220R_relax and S220W_relax structures. B: Schematic diagram of the interaction force in residues K130, S/W/R220, and D223 of WT (red) and S220R (cyan), S220W (grey); The numbers between two residues represent distances in units of Å. C: Kernel density distribution plot of hydrogen bond A and salt bridge B distance in molecular dynamics simulation; The mutants were shown in colors as labeled in the plots. |
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此外，K130残基的氨基侧链和D223残基的羧基侧链可以形成一对盐桥B，被220突变所带动的K130残基也使得盐桥B的作用力发生变化，S220R_relax、S220W_relax突变体中盐桥B的距离(2.4 Å)比野生型的(4.4 Å)缩短(图 7A)；MD的结果显示，S220R、S220W突变体盐桥B的成键距离在4.0 Å内的分布密度更大(图 7B–C)，与WT相比，成键概率分别增加了30.1%和12.5%。S220R和S220W突变体的两组作用力都得到了增强，并且其成键概率的增长也与实验所得S220R (ΔTm=5.6 ℃)和S220W (ΔTm=4.0 ℃)的热稳定性的增长趋势相同，S220R突变所表现出的热稳定性更好，其成键概率的涨幅也更大。这两组作用力对热稳定性的提高存在一定的贡献。
3 讨论与结论本研究通过多蛋白质结构比对，确定了ZHD101的结构灵活区域，进一步通过序列保守性分析及构象自由能计算，最终筛选出位于220号和136号残基位点的9种突变体(ΔTm=0.4− 5.6 ℃)，其中表现最好的2个突变体S220R和S220W，相较于野生型，Tm提高了5.6 ℃和4.0 ℃；最适反应温度均升高了10 ℃；热半失活温度分别增加了4.9 ℃和3.9 ℃；45 ℃下的热半失活时间分别延长了15.4倍和3.1倍；45 ℃下的相对酶活性分别为70.6%和57.3%。综合酶热力学稳定性及酶动力学稳定性的表征，说明S220R和S220W两种突变体确实对酶的热稳定性有正向的改善，酶活性得到部分保留。最后，通过分子动力学模拟，表明S220R突变使得帽子区域残基的RMSF值降低，实现局部柔性区域的刚性化，从而对酶整体热稳定性的提高有利。S220R和S220W两种突变都对其附近的作用力网络进行了调整，通过增强氢键220-K130、盐桥K130-D223作用力来提高其热稳定性。同时，针对酶稳定性的改造常常陷于酶活与稳定性的权衡，尤其对于靠近活性中心残基的改造[41]。220号残基位于ZHD101底物结合口袋上方，距离催化三联体质心9.3 Å，S220的突变体(S220L、F、M、R、Y、W)相较于野生型均有残基侧链的增大，且突变后的氨基酸侧链增大，酶活损失也增加，突变为较大的氨基酸侧链可能导致底物进入活性区域困难、底物结合口袋区域的面积减小，从而造成酶活性的损失，也为后续研究提供了参考。
本研究表明，基于结构、进化和能量多方面因素建立的蛋白质热稳定性改造计算设计策略能提供小而精的突变文库，使得改造过程更加高效便利，最终获得热稳定性增强的突变体，此外在设计过程中对结构、序列信息的挖掘也为ZHD101的进一步功能改造，如高化学选择性、区域选择性和催化活性等提供基础。
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