2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 陈晓阳, 安瑞珩, 黄菊, 梁有沣, 张文静, 郝明炫, 郭蕊, 李小宁, 李永超, 应璐, 杨昭
- CHEN Xiaoyang, AN Ruiheng, HUANG Ju, LIANG Youfeng, ZHANG Wenjing, HAO Mingxuan, GUO Rui, LI Xiaoning, LI Yongchao, YING Lu, YANG Zhao
- 噬菌体抗体库技术在肿瘤治疗中的研究进展及应用
- Phage antibody library technology in tumor therapy: a review
- 生物工程学报, 2023, 39(9): 3644-3669
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(9): 3644-3669
- 10.13345/j.cjb.230048
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文章历史
- Received: January 21, 2023
- Accepted: May 26, 2023
引用本文
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2. 塔里木大学生命科学与技术学院 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室, 新疆 阿拉尔 843300
2. Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps, College of Life Science and Technology, Tarim University, Alar 843300, Xinjiang, China
肿瘤是指人体细胞在各种致癌因子作用下发生过度增生和异常分化所形成的一种新生物肿块。据2020年全球癌症统计数据显示：当年全球新增恶性肿瘤病例1 930万，死亡病例1 000万，是当今社会对人类生命威胁最大的疾病[1]。顶级医学期刊The Lancet于2019年刊登的2项大规模调查研究显示，肿瘤已经取代心血管疾病，成为发达国家民众的第一大死因，并将在未来几十年内成为全球范围内的“第一大健康杀手”。2021年中国新增恶性肿瘤病例457万，死亡病例300万，二者均位列全球第一[2]，严重影响了我国人民的生命健康。肿瘤根据发生的组织部位不同可以分为不同类型，其按发病率从高到低的排序为[3]：乳腺癌(11.7%)、肺癌(11.4%)、结直肠癌(10.0%)、前列腺癌(7.3%)和胃癌(5.6%)；按死亡率从高到低排序为：肺癌(18.0%)、结直肠癌(9.4%)、肝癌(8.3%)、胃癌(7.7%)和乳腺癌(6.9%)。
目前肿瘤治疗策略是以手术为主，并结合放化疗、靶向治疗及免疫治疗等方法的联合治疗，多种方法借助抗肿瘤药物发挥作用。抗肿瘤药物主要分为细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂和单克隆抗体(单抗)药物等几大类。其中单抗药物具有特异性高、毒副作用小等优点，不仅对多种恶性肿瘤具有显著疗效，还能与其他抗肿瘤药物联合使用，给肿瘤患者带来显著的生存受益，成为当代主流抗肿瘤药物之一，也是部分肿瘤一线治疗的首选药物。
单抗的制备方法和技术主要包括免疫血清提取法、杂交瘤技术、单个B淋巴细胞抗体制备技术和噬菌体抗体库技术(phage antibody library technology, PALT)等。1890年，德国科学家埃米尔·阿道夫·冯·贝林以及日本科学家北里柴三郎[4]首次发现了血清中存在某种特殊物质分别对白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生的白喉毒素和破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生的破伤风痉挛毒素具有抵抗作用，并提出了这种介质可以与外来抗原发生反应的假设，这是第一个用免疫血清中抗体治疗的实例。1975年，英国科学家Köhler和Milstein[5]将鼠源的B淋巴细胞与肿瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，发明了杂交瘤技术。杂交瘤技术是整个生命科学发展的一个重要里程碑，其制备的单抗特异性较高，且易于大量生产。虽然杂交瘤技术在基础生物学研究和临床医学方面均发挥着重要作用，但仍存在着操作相对复杂且产生的抗体并非人源抗体等不足。单个B淋巴细胞的抗体制备技术利用单细胞测序技术生产全人源化抗体，主要包括单个B细胞分选、抗体基因扩增和克隆及抗原特异性抗体表达、筛选和鉴定等过程[6]。其产生的抗体具有全人源性、高抗原特异性、高亲和性和基因多样性等优势[7]，但制备过程受限于B细胞，不易获得靶向自身抗原的抗体。
PALT是一种基于噬菌体展示技术(phage display technology, PDT)的抗体制备技术。PDT是由美国生物学家Smith[8]于1985年发明，他通过将外源基因序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因中，使外源蛋白与噬菌体的外壳蛋白融合表达，并展示在子代噬菌体的表面[9]。PDT突破性地在体外建立了蛋白表型与其遗传信息的直接联系，并保持了抗体的空间结构和生物学活性。1990年，Mccafferty等[10]利用PDT成功构建出第一个噬菌体抗体库。PALT是一种强大的用于制备全人源抗体的技术手段[11]，其制备抗体不依赖于体内的免疫反应，可用于发现针对几乎所有类型抗原的抗体，并且结合了PDT表达蛋白基因型和表型的统一的特点，通过表型筛选就能得到相应的基因，可用于疾病标志物的识别和抗体药物的筛选制备，是制备单克隆抗体领域中继B细胞杂交瘤技术后的又一次飞跃[12]。2002年首次上市的阿达木单抗(Humira)是第一个通过PDT获得的单抗药物，也是全球首个获批的全人源抗体，它先后获批治疗10多种不同的适应症(如类风湿关节炎、强直性脊柱炎等)，累计销售额突破1 700亿美元，连续多年成为全球药王[13]，为全球广大患者带来了福音，在医药研发史上有着特殊的意义。
PALT与其他单抗制备技术相比有很大的优势(表 1)，例如其具有强大的筛选能力，筛选范围为107‒109，而杂交瘤技术的筛选范围为103左右。PALT能够在体外模拟体内的抗体生成过程，在体外进行试验并灵活筛选，可以不经杂交瘤途径，甚至不经过免疫就可以制备和生产单克隆抗体。PALT能够制备人源抗体并优化抗体结构，促使抗体在应用中发挥更好的作用，且PALT抗体制备周期短。这些优点使PALT已广泛应用于人源抗体制备、药物筛选、疫苗研制和肿瘤生物标志物筛选鉴定等方面[10]。近年来，各领域针对PALT不断进行研究和试验过程的优化，已经筛选出多种肿瘤对应的抗体，正在进行临床试验并用于肿瘤的治疗，包括乳腺癌[14]、胃癌[15]、肺癌[16]和肝癌[17]等，PALT在肿瘤诊断和肿瘤药物制备等领域已经受到广泛关注。
| Immunoserological extraction | Hybridoma technique | PALT | |
| Antibody form | Polyclonal antibody | Monoclonal antibody | Monoclonal recombinant antibody |
| Host cell | N/A (not applicable) | Hybridoma | E. coli/293/CHO |
| Screening range | N/A (not applicable) | 103 | 107−109 |
| Time period | A couple of months | A couple of months | Several weeks |
| Immunization | Requires immunization | Requires immunization | Independent of immunization |
| Humanized antibody | No | No | Yes |
| Production | +++ | ++ | ++++ |
| Gene sequence | N/A (not applicable) | Yes | Yes |
| + represents the degree, the more + the higher the degree. | |||
PALT的发展(图 1)最早可追溯到1985年，Smith[8]将EcoR I内切酶部分基因片段与PIII基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增长，同时表达产物能被抗EcoR I内切酶抗体所识别。试验成功地将外源DNA整合到M13噬菌体中，并利用M13噬菌体外壳蛋白表达了外源多肽，首次证实了丝状噬菌体(M13噬菌体)的基因组能通过基因工程的手段加以改造。1988年，Parmley等[18]首次应用PDT阐明抗体分子是噬菌体表面表达的一个具有天然蛋白质功能的蛋白质分子。1989年英国剑桥大学的Ward等[19]采用PCR技术从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA中扩增出重链可变区(variable region of heavy chain, VH)基因，测序证实了其多样性，并随后在大肠杆菌中表达了该VH片段，该小组发表的关于VH抗体库构建的文章是最早关于PALT的报道。同年，美国Scripps研究所Huse等[24]利用噬菌体载体，通过噬菌斑印迹技术筛选抗体，发表了关于含有完整轻重链抗体库的文章。
1990年，Mccafferty等[10]利用丝状噬菌体及其衍生的噬菌粒，在噬菌体表面表达了一种溶菌酶的抗体，这是公认的第一例噬菌体抗体库。1994年，Winter等[11]首次使用了辅助噬菌体M13K07，进一步完善了利用噬菌粒构建完整轻重链抗体库的方式。该方法产生的抗体具有良好的亲和力(10‒8‒10‒9 mol/L)，并能够有效与外来或自身抗原高特异性结合。
1997年Sblattero等[20]设计的构建噬菌体抗体库所用的“通用引物”广泛应用于国内外很多研究中。2002年，Arap等[21]首次利用噬菌体展示文库在人体内进行筛选。试验发现噬菌体展示肽在各个组织内并非随机分布，它可以特异性地进入前列腺血管系统，最终筛选出了一种前列腺特异性的七肽，这是人体内噬菌体展示筛选的首次报道。
同年，第一个由PDT得到的药物Humira获美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准上市[13]。Humira又被称为D2E7，为评估其治疗效果，1999年Kempeni[25]招募了120名类风湿性关节炎患者进行临床试验，试验中发现在3个最高治疗剂量组中，40%−70%的患者达到了疾病活动评分(disease activity score, DAS)和美国风湿病学会疗效评估标准(American College of Rheumatology Efficacy Evaluation Criteria, ACR20)缓解状态；采用安慰剂的对照组中，达到此状态的患者比例只有19%。2002年，Feldmann等[26]招募了超过2 000名类风湿关节炎患者进行了4项大型Ⅲ期临床试验，相较于安慰剂治疗的对照组患者，D2E7治疗组患者症状显著改善，其中30%的患者甚至达到了3年以上的缓解。以上临床试验数据证明D2E7对类风湿性关节炎具有良好的治疗效果。自上市以来，Humira已连续8年蝉联全球销售额冠军，是利用PDT制备的最具有代表性的单抗药物。
2007年，日本金泽医学大学的Dong等[22]利用人噬菌体抗体库筛选得到了2个特异识别EBV-VCA的抗体，它们能降低其他抗EBV-VCA单抗对其抗原的结合，这一研究为今后疫苗的设计和致病机理的研究提供了依据。2017年，美国FDA和欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)批准了6种通过PALT发现或设计的全人源化抗体[27]。Smith和Winter凭借他们在PALT领域的杰出贡献，2018年获得了诺贝尔奖化学奖[23]。
2019年，新冠疫情暴发，杨晓明研究员团队利用PALT以8名SARS-CoV-2感染康复患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)为基因原材料，建立抗体文库，成功筛选出多株对SARS-CoV-2具有高中和活性的单抗[28]。晶体结构解析数据显示，活性最强的抗体2B11所识别的受体结合区(receptor binding domain, RBD)表位与血管紧张素转化酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE-2)的结合位点高度重叠，通过竞争性结合有效阻断新冠病毒与细胞表面的ACE-2结合，进而阻止其感染细胞。随着科学技术的不断发展和革新，PALT未来在抗体药物研发过程中将发挥重要作用。
2 噬菌体抗体库的构建及分类 2.1 噬菌体抗体库的构建PALT的基本技术路线如图 2所示。(1) 从体外细胞中提取总RNA，包括免疫的细胞、杂交瘤细胞、B淋巴细胞、末梢血淋巴细胞、骨髓淋巴细胞和脾细胞等。(2) 反转录总RNA得到细胞的cDNA文库，从中扩增获得全套的可变区基因，包括重链可变区VH和轻链可变区(variable region of light chain, VL)基因，随机拼接VH和VL基因构建多样性的抗体基因库。(3) 将抗体基因克隆至噬菌体表达载体，并加入辅助噬菌体侵染大肠杆菌，通过离心取上清即得到针对某种抗原的初级噬菌体抗体库。(4) 选择某种特定抗原作为靶标，对建立的初级抗体库通常进行3‒6轮重复的筛选流程，其中有2个主要的步骤分别是淘筛(panning)和单克隆鉴定。淘筛分为吸附、洗脱和扩增3个过程[29]。吸附指噬菌体抗体库与抗原共同孵育，使噬菌体抗体与抗原特异性结合；接下来弃去未结合的噬菌体，并在不影响噬菌体的感染能力的前提下洗脱与抗原特异性结合的噬菌体，收集结合的噬菌体。然后将获得的噬菌体感染细菌并扩增，进行下一轮淘筛。几轮淘筛后，对富集到的与抗原特异性结合的多克隆噬菌体进行单克隆化，即从多克隆噬菌体中挑选出单克隆噬菌体。至此可得到高特异性单克隆菌株，并获得抗体基因[30]。
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| 图 2 噬菌体抗体库的构建 Fig. 2 Construction of phage antibody library. |
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笔者团队从10例膀胱癌患者的外周血中分离了PBMC、提取了总RNA后经反转录得到cDNA，并通过PCR对抗体的VH片段和VL λ (variable region of lambda light chain)、VL κ (variable region of kappa light chain)这2个区域进行扩增，最终利用短接头肽(linker peptide)将上述片段拼接形成单链抗体(single chain variable fragment, scFv)片段。将scFv片段电转至大肠杆菌XL1-Blue中，并利用辅助噬菌体VCSM13侵染重组的大肠杆菌，成功制备了膀胱癌人源scFv重组抗体库[31]。
2.2 主要分类 2.2.1 按基因来源分类已建立的噬菌体抗体库根据基因的来源不同，可分为免疫抗体库和非免疫抗体库[32]。
免疫抗体库里的抗体基因主要来自于经抗原免疫的个体，采用经过免疫后的淋巴细胞直接建立抗体库，由于存在免疫偏好性，因此从该类抗体库中容易筛选出针对与某一特定抗原反应的高亲和力抗体克隆[32]。因为在体内淋巴细胞已经过与抗原的亲和力选择，所以建立小容量的抗体库即可筛选出特异性强的高亲和力抗体。但是这种抗体库有着明显的缺点，即免疫个体本身就有限制性和偏好性，且只能产生针对特定抗原的特定抗体，其通量小，存在需要进行主动免疫的缺陷。1998年Chang等[33]针对经过人Rh (D)抗原免疫后的人外周血淋巴细胞构建了抗原结合片段(fragment of antigen binding, Fab)免疫抗体库，并得到大量抗Rh (D)抗体。研究人员对得到的83个克隆进行序列分析，抗体序列中包含了28个不同的VH和41个不同的VL基因片段，多样性不高。同时免疫抗体库对弱抗原、毒性抗原和自身抗原均无效果[34]，某一特定的免疫库只能产生针对特定抗原的抗体，不能作为一个广泛筛选的平台。
非免疫抗体库可识别的抗原具有多样性，包括那些不引起机体免疫反应的弱抗原、自身抗原和具有毒性的抗原，理论上能够制备大量的多样性抗体。非免疫抗体库又分为天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。天然抗体库是采用未经免疫的淋巴细胞建立的抗体库，可获得全部的抗体可变区序列，而且不易遗漏抗体基因[35]。半合成抗体库为人工合成一部分可变区，其余部分来自于天然抗体的合成抗体库。而全合成抗体库是指可变区都由人工合成的抗体库。非免疫抗体库的特点是不针对特定的抗原，建立多样性强的抗体库，最大可能分离出高亲和力的抗体[36]。Kim等[37]成功构建了一个庞大的Fab非免疫抗体库，通过测序获得了包含7 373个VH和41 804个kappa轻链可变区域VL κ序列的数据库，证实了VH和VL κ序列的多样性，得到的抗体片段序列未来可以用于设计多样性的抗体库。随着基因工程技术的不断发展，构建无免疫偏好性的大容量、多样性的非免疫抗体库已成为抗体库技术的发展方向。
2.2.2 按噬菌体展示系统分类噬菌体抗体库技术可以选择不同的噬菌体来进行抗体的展示，具体可分为丝状噬菌体展示系统、T4、T7和λ噬菌体展示系统等(表 2)[38]。
| Phage display system | Phage type | Display site | Characteristic |
| Filamentary phage display system | Single stranded circular DNA, mild phage, siphonate | PⅢ protein | The PⅧ system displays long peptides with low copy number The PⅧ system displays short peptides with high copy number |
| PⅧ protein | |||
| T4 phage display system | Linear double stranded DNA, virulent phage, icosahedron | SOC protein | Both SOC and HOC proteins could display different peptides or proteins at the same time |
| HOC protein | |||
| T7 phage display system | Linear double stranded DNA, virulent phage, icosahedron | 10B protein | The T7 display system displays short peptides with high copy number and long peptides with medium or low copy number |
| λ phage display system | Linear double stranded DNA, mild phage, icosahedron | D protein | The D protein makes up the phage head protein and the PV protein makes up the phage tail protein, showing a wide range of proteins |
| PV protein |
丝状噬菌体是一种单链DNA噬菌体，由管状蛋白质外壳和单链环状DNA构成。它属于溶原性噬菌体，在周质中组装，在不裂解宿主的情况下从细菌膜中分泌出来，是噬菌体抗体库技术应用最多的噬菌体类型，最常见的为M13噬菌体。丝状噬菌体DNA共编码5种衣壳蛋白，包括PⅢ、PⅣ、PⅦ、PⅧ和PⅨ，其中PⅢ与PⅧ基因常用来展示外源蛋白，又称为PⅢ展示系统和PⅧ展示系统[38]。PⅢ是丝状噬菌体的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，具有3−5个拷贝数。PⅢ蛋白的结构特点是具有高度的灵活性和易变性，使得其可以展示较大的蛋白质片段且不影响噬菌体结构。PⅧ基因是丝状噬菌体主要的衣壳蛋白，位于噬菌体两侧，约有2 700个拷贝数，可以展示多种外源蛋白，但是其只能展示约5个氨基酸组成的多肽，较大的多肽会影响噬菌体本身的装配和感染力。
T4噬菌体为二十面体结构，具有线性双链DNA。其衣壳蛋白中含有2种非必需外壳蛋白：小外衣壳蛋白(small outer capsid protein, SOC)和高抗原外衣壳蛋白(highly antigenic outer capsid protein, HOC)，它们不影响噬菌体的正常活性因而可以作为外源基因的结合位点来展示外源蛋白[39]。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示多种大小的多肽或蛋白质而很少受到限制，并且SOC和HOC蛋白拷贝数较多，可以进行多价展示。
T7噬菌体是一种双链丝状DNA烈性噬菌体，成熟的噬菌体通过细胞裂解而释放，展示在T7表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围较广。它的衣壳蛋白有10A蛋白和10B蛋白2种形式，其中10B蛋白位于噬菌体表面，用于噬菌体展示系统[40]。T7展示系统能够以高拷贝数展示50个氨基酸长度的多肽；也可通过中或低拷贝数展示900−1 200个氨基酸的多肽(蛋白质)，因此广泛应用于筛选不同分子量、不同亲和力的蛋白质。
λ噬菌体具有线性双链DNA分子，与T4噬菌体相同为二十面体，主要进行裂解性生长和溶源性生长。λ噬菌体有D蛋白和PV蛋白2种展示系统[41]，D蛋白是参与噬菌体头部组装的装饰蛋白，PV蛋白构成了尾部管状部分。λ噬菌体在宿主细胞内完成装配，同样无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示的蛋白质范围极广。
2.2.3 按载体类型分类噬菌体抗体库技术中常用的载体包括噬菌体载体和噬菌粒载体2种[42]。噬菌体是基因工程中常用的载体，将外源基因替代或插入到噬菌体基因组当中，组成噬菌体载体。大多数噬菌体载体表面有多个蛋白展示位点，通常为多价展示。但是多价展示会使弱结合性克隆显示出假阳性，不易筛选特异性高的克隆，相反单价展示可以提高筛选到高亲和力克隆的可能性，因此人们选择利用噬菌粒作为载体，通过单价展示进行高亲和力的筛选。
噬菌粒是一种对丝状噬菌体进行人工改造得到的特殊类型载体，兼具丝状噬菌体与质粒的优点[43]。作为一种特殊的质粒，可以像一般的质粒那样被复制，也可以在病毒体内作为单链DNA被包装。噬菌粒具有基因组较小可插入较大片段、复制型为双链DNA、易于操作、转化效率高和产生的重组子更加稳定等优点。但由于其没有任何噬菌体功能基因，导致噬菌粒不能独立合成单链DNA，因此需要在辅助噬菌体的帮助下才可以完成对宿主细胞的侵染。
2.2.4 按抗体类型分类传统的全抗体由于分子量较大，不易于展示在噬菌体表面，因此噬菌体抗体库技术主要用于制备scFv、Fab、二硫键稳定性抗体(disulfide-stabilized Fv fragment, DsFv)、双链抗体(diabody)或小抗体(minibody)等(图 3)。
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| 图 3 不同抗体类型模式图 Fig. 3 Diagram of different antibody types. |
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scFv是利用基因工程的方法将抗体的VH与VL通过一段15−25个氨基酸的linker连接构成的重组蛋白，是具有抗体活性的最小功能结构单位，其分子量约为完整抗体分子的1/6。scFv的优势是分子量小、穿透力强，但容易形成聚体，构建成完整分子后亲和力可能会缺失[44]。
Fab是一种完整抗体的片段，由VH与重链恒定区(heavy chain constant region 1, CH1)以及一条完整的轻链即VL与轻链恒定区(light chain constant region, CL)组成，二者之间由一个链间二硫键连接，形成异二聚体，仅有一个完整的抗原结合位点，其分子量约为完整IgG (immunoglobulin G)分子的1/3。相较于scFv库，Fab的形式更接近于完整抗体，其稳定性更好，但其表达水平较低[45]。
DsFv是通过在VH和VL之间形成二硫键来稳定Fv片段。与scFv相比，DsFv的稳定性和亲和力更高，同时也具有scFv小分子的优势，在临床上具有很高的应用价值。2009年Huang等[46]成功开发出一个sc-DsFv噬菌体展示平台，sc-DsFv蛋白被成功地表达在M13噬菌体表面，其表达量与野生型的信号肽序列文库相比增加了2个数量级。
双链抗体由2个交叉的单链抗体scFv组成，由于连接用的linker将每个轻链重链的可变区分隔开，所以只能形成二聚体。2015年Li等[47]构建了2个大型的人scFv噬菌体抗体库，并使scFv带有2种不同的连接(linker) (17 aa-SSA和18 aa-SX)，通过限制性内切酶消化和重新连接使linker长度迅速缩短，可将scFvs快速转化为双链抗体。
小抗体通过基因工程手段采用不同的linker把scFv的VH与IgG的重链恒定区CH3 (constant region of heavy chain, CH)融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为小抗体。早在1994年Martin等[48]就已经成功构建出小抗体库，并成功分离得到一种能够抑制人白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)活性的特异性结合的多肽。
3 噬菌体抗体库技术在肿瘤治疗中的研究进展及应用 3.1 乳腺癌乳腺癌(breast cancer)是一种由乳房腺上皮组织发生恶性增生而引发的肿瘤疾病[49]，2020年，全球乳腺癌新发病例230万，已经成为全球发病率最高的癌症，死亡病例68.5万[1]，是全球第五大癌症死亡原因，也是女性人群中发病率最高的恶性肿瘤，在110个国家中死亡率中排名第一[50]。乳腺癌目前治疗方案为以手术为主，辅以放化疗、内分泌治疗的个体化综合治疗，但是乳腺癌常发生转移，患者面临着生存降低和预后差等问题。
人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2)在30%的浸润性乳腺癌中高表达，靶向HER2可以有效治疗HER2阳性乳腺癌[51]。1998年获批的赫赛汀(曲妥珠单克隆抗体)是第一个乳腺癌靶向治疗药物，它主要通过特异性阻断HER2信号通路，抑制癌细胞的增生，这使得药物治疗乳腺癌的方法取得突破性进展[52]。2021年Lamtha等[53]用HER2-酪氨酸激酶(HER2-tyrosine kinase, HER2-TK)重组蛋白作为靶抗原，从人源化噬菌体展示文库中筛选出了抗HER2-TK结构域的重组单域抗体(single-domain antibody, sdAb) VHH17，该抗体可以抑制HER2-TK的磷酸化，最终降低乳腺癌细胞的活力；VHH17能显著结合HER2-TK，其Kd值为7.49×10−7 mol/L，并对HER2-TK的TK活性有抑制作用，IC50值为3 nmol/L；试验将VHH17与富含精氨酸的细胞穿透性多肽Nona-Arg (R9)相连，得到抗体R9VHH17，其与HER2-TK间的Kd值为3.74×10−7 mol/L，对HER2-TK也具有明显亲和力，并且VHH17添加了穿透性多肽后增强了对靶细胞的穿透，显著降低HER2阳性癌细胞的存活率，试验测定MDA-MB-231 (三阴性乳腺癌细胞)、A431 (表皮生长因子受体[epidermal growth factor receptor, EGFR]阳性的表皮样癌细胞)和BT-474 (HER2阳性的人乳腺癌细胞)的IC50值分别为1 282、314 nmol/L和41 nmol/L，说明R9VHH17的作用是细胞特异性的，对表达HER2的癌细胞具有细胞穿透性和生长抑制活性。因此，VHH17可以降低癌细胞的增殖速度，减缓疾病的进展，有望成为治疗HER2阳性乳腺癌的有效药物。
2021年Sales-Dias等[54]以重组人DLL1 (rhDLL1)蛋白为靶抗原，从人scFv噬菌体展示文库中进行3轮筛选得到DLL1特异性单抗IgG-69；试验测定IgG-69与细胞表面rhDLL1的半数有效结合浓度(EC50)近似值为0.17 nmol/L，具有良好的抗肿瘤活性。IgG-69是DLL1特异性结合抗体，其Kd值为22 nmol/L，亲和力在两位数nmol/L范围内；试验通过Notch荧光素酶报告基因检测来研究IgG-69对DLL1-Notch信号转导的抑制作用，数据发现IgG-69显著降低了由rhDLL1-EGF3-Fc诱导的Notch报告基因的活性，平均降低25% (P=0.012 2)；将MCF-7细胞暴露于不同IgG-69浓度中，观察抗体对Notch靶基因HY-L表达水平的影响，与暴露于同等浓度的IgG Ctr的细胞(P=0.015 0)相比，10 μg/mL的IgG-69使HY-L的表达水平降低了30%，由此可见，IgG-69显著削弱了DLL1-Notch通路的激活；同时试验检测了抗体对癌细胞生长的抑制作用，IgG-69使rhDLL1-ECD-Fc诱导的MCF-7细胞生长减少50% (P=0.011 5)，结果与抑制DLL1-Notch信号一致；利用体外的乳腺癌细胞成球试验评估其潜在的抗乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells, BCSCs)效果，与未经处理的对照细胞(P=0.043 3)或用IgG Ctr处理的细胞(P=0.017 4)相比，IgG-69使MCF-7成球的数量分别减少了约30%和40%，这表明IgG-69显著抑制了BCSCs的自我更新能力。单抗IgG-69能够部分抑制DLL1介导的Notch通路的激活，并能损伤乳腺癌干细胞亚群，抑制癌细胞生长。在未来的乳腺癌治疗中具有很大潜力，考虑到目前IgG-69的亲和力较差，需要进一步提高亲和力，从而改善在未来的体内试验以及可能的临床试验中的治疗效果。
虽然近几年乳腺癌的治疗和预后情况得到了改善，但乳腺癌仍是女性中的第一大癌，寻找针对乳腺癌特异性抗原的无创、敏感性高、特异性强且简单可行的抗体，作为乳腺癌的早期诊断和治疗工具依然具有重要的临床应用价值。PALT得到的抗体是目前报道最多且有应用前景的一类小分子抗体，其结构简单，能够减少抗体引起的免疫反应，因此已经应用PALT筛选出针对乳腺癌相关抗原及受体所对应的单抗如VHH17和IgG-69等，为肿瘤的诊断和靶向治疗提供理论依据。
3.2 肺癌肺癌(lung cancer)是仅次于乳腺癌的第二大常见癌症类型。2020年，全球肺癌新发病例220万，新增肺癌死亡病例180万[1]，是死亡率最高的癌症。根据肺癌细胞的形态特点可将肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) 2种，绝大多数肺癌为NSCLC，约占所有肺癌的85%[55]；SCLC相比NSCLC恶性程度更高，其5年的生存率 < 6%。NSCLC的治疗多以靶向EGFR为主[56]，SCLC的一线化疗方案仍以顺铂或卡铂加依托泊苷为主[57]。传统治疗方式尽管使NSCLC和SCLC对放化疗敏感，但容易出现复发和转移，亟需开发肺癌治疗的新方法。
2020年Kang等[58]利用PALT针对肿瘤生物标志物hYKL-40[59]进行人Fab噬菌体展示文库的抗体筛选，鉴定出独特的单抗片段H1 (Fab)；将H1 (Fab)重组成免疫球蛋白IgG形式并使用生物层干涉仪(biolayer interferometer, BLI)和蛋白质热位移(protein thermal shift, PTS)进一步分析，其表观Kd和热稳定性Tm分别为5.0×10−11 nmol/L和73.7 ℃，EC50值为0.5 nmol/L，亲和力效果显著；单抗IgG-H1在体外试验中明显抑制肺癌细胞系A549和H460的迁移，PBS处理的A549细胞和H460细胞对照组中，分别有(405±21)个/mm2和(529±14)个/mm2细胞迁移到跨孔下侧，而IgG-H1处理组细胞迁移数为(124±5)个/mm2和(112±12)个/mm2。之后进行小鼠体内试验研究IgG-H1的体内抗癌作用，在PBS处理的对照组中，肿瘤占据了肺组织表面的41.3%±5.0%，而经IgG-H1治疗后肿瘤占肺组织表面积降低至7%±1.2%；此外，用PBS处理的小鼠肺表面的平均肿瘤结节数为(38.7±4.9)个，而用IgG-H1处理的小鼠中平均肿瘤结节数显著降低至(3.8±0.4)个[58]。以上体外和体内试验发现了抗hYKL-40的单克隆抗体IgG-H1可能具有治疗肺癌的能力，其在亲和力、热稳定性和非聚集性等生物物理特性中有显著优势，并且在体内可以明显抑制肺癌细胞生长和迁移，有望可以开发成为良好的抗肺癌药物。
2018年Dho等[60]从scFv噬菌体展示文库中经过4轮筛选，得到与CD55特异性结合的scFv抗体，转化为IgG并用镥-177 (Lu-177)标记得到抗CD55的177Lu抗体；177Lu-anti-CD55抗体与H460细胞具有高亲和力，其Kd值为(7.149±5.144) nmol/L；试验研究了这种抗体在小鼠胸膜转移性肺癌模型中的分布，177Lu-anti-CD55主要滞留在肿瘤组织，抗体经过24 h后在肿瘤组织蓄积达18.35%±3.58% ID (initial dose)/g，而在正常组织中并不聚集，说明177Lu-anti-CD55可以特异性地靶向表达CD55的转移性肺癌细胞；在体外试验中，用177Lu-anti-CD55处理H460细胞后，肺癌细胞侵袭减少66.23%，迁移减少61.51%，表明该抗体在体外能够抑制肺癌细胞的侵袭和迁移；177Lu-anti-CD55还可以与顺铂联合治疗肺癌，试验单独用177Lu-anti-CD55和单独用顺铂处理H460细胞，细胞存活率分别下降11.5%和13.6%，而当177Lu-anti-CD55和顺铂联合处理后，H460细胞存活率降低了44.2%，这表明二者存在协同效应，可以更好地发挥治疗效果。177Lu-anti-CD55抗体是治疗胸膜转移性肺癌的一种有前途的药物，通过单抗与Lu-177相结合，可以更好地发挥治疗肺癌的效果，在转移性肺癌的治疗领域有广泛的应用前景。
2015年经FDA批准上市的耐昔妥珠单抗(necitumumab)是一种重组人源性IgG1单克隆抗体，作为EGFR的拮抗剂，其可与吉西他滨和顺铂共同用于NSCLC的联合化疗。同年The Lancet Oncology的一项研究指出，与单纯化疗组相比，耐昔妥珠单抗联合化疗可将NSCLC患者总生存期从9.9个月提高至11.5个月，死亡风险下降16%[61]。尽管该药物尚未在我国国内上市，但相信随着未来PALT和其他诊疗技术的逐步发展与成熟，这类单抗药物有望成为肺癌的“明星药物”，给众多肿瘤患者提供新的治疗方案。
噬菌体抗体库技术筛选得到的特异性抗体在肺癌的临床治疗中发挥着重要作用，现阶段PALT可以结合放射性核素疗法和放化疗等方法帮助临床上的诊断和治疗，不再局限于单一的抗体使用。因此，PALT与不同治疗癌症的方式相结合的治疗手段仍在不断的探索和改进，相信未来会有很大的突破。
3.3 胃癌胃癌(gastric cancer)是全世界重视的恶性消化道癌症，2020年全球胃癌新发病例100多万，死亡病例76.9万[1]，相当于全球每13例因癌症死亡中就有1例死于胃癌。胃癌的主要治疗手段是以手术、放疗和化疗为主的综合治疗[62]，但临床中存在诸多的限制而影响其疗效，以X射线和内镜超声等为主的胃癌诊断方法对早期胃癌的诊断缺乏足够的特异性和准确性[63]。由于PALT可以筛选到与肿瘤表面标志物特异性结合的多肽，使得其应用于胃癌领域的研究不断增多，尤其在早期检测和靶向治疗方面均取得了诸多进展。
在胃癌病人体内的血管内皮细胞、外膜细胞、平滑肌细胞及细胞外基质中，通常会表达某些十分稀少且难以检测的分子标志物。2012年Zhang[64]为了诊断早期胃癌，利用PALT对人胃癌细胞系BGC823与人胃正常粘膜上皮细胞GES-1进行对照筛选获得了可以与胃癌细胞特异性结合的多肽AAD；酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试验数据显示多肽AAD与BGC823细胞结合的A值(在490 nm处用酶标仪测定的吸光度，OD490)为1.15±0.09，与GES-1细胞结合的A值为0.123±0.035，证明了多肽AAD选择性地与BGC823细胞结合而不与正常胃粘膜细胞GES-1结合；之后用多肽免疫荧光试验测定AAD与新鲜胃癌组织的选择性结合情况，荧光图像显示AAD与肿瘤细胞膜、细胞质结合，但不与正常胃粘膜结合，免疫组织化学对AAD的结合分析出多肽与弥漫性胃癌存在特异性结合。研究还对37例胃癌、15例邻近胃粘膜、12例乳腺癌和15例结肠直肠癌组织进行半定量图像分析，测定AAD含量，结果发现AAD在胃癌组织中含量最高，具有统计学意义[64]。以上结果说明新多肽AAD与胃癌具有特异结合活性，可用于区分肿瘤和正常胃粘膜组织，为胃镜检查发现早期肿瘤提供了可能。同样，2017年Sahin等[65]采用弥漫性胃腺癌细胞MKN-45作为靶细胞，从噬菌体展示文库中进行5轮筛选得到与MKN-45细胞特异性结合的抗体DE532，并根据DE532中氨基酸的偏好性重新设计得到抗体DE-Obs，结果发现DE-Obs具有与MKN-45细胞更强的亲和力，但不与正常人胃细胞HFE-145中结合，说明通过PALT得到的这2个抗体均可以与MKN-45人胃癌细胞的特异性结合，可以作为胃癌研究诊断和治疗潜在药物。
2019年Mehdipour等[66]为了寻找与胃癌腹膜转移相关的潜在肿瘤生物标志物，利用半合成的人scFv噬菌体展示文库对MKN-45靶细胞进行阳性筛选，通过ELISA和流式细胞仪对纯化的scFv进行特异性分析，证实其中3个克隆(B12、F10和G1)与MKN-45细胞可以特异性结合，而与肠胃腺癌AGS和正常细胞NIH-3T3无结合；试验用流式细胞术检测了所选择的scFv片段在药物靶向传递中的潜在应用，F10和G1单链抗体的肿瘤细胞摄取率分别为57%和35%，而阴性对照的细胞仅有8.4%。采用免疫沉淀法对G1沉淀和F10沉淀靶蛋白进行质谱分析，数据表明HSP90a (HSP90AA1)、HSP90b (HSP90AB1)和c-Met可作为MKN-45胃癌细胞系转移型的其他候选生物标志物。试验得到的MKN-45特异性单链抗体片段及其同源抗原将有利于弥漫性胃腺癌的筛选和靶向治疗，此外，c-Met、HSP90a和HSP90b在肿瘤生长、胃癌转移和不良预后中起着关键作用，是弥漫型胃腺癌细胞系MKN-45的潜在分子生物标志物[66]。
血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)又称为激酶插入区受体(kinase insert domain receptor, KDR)，它可与VEGF相结合从而促进内皮细胞增殖和肿瘤内的新生血管生成。2002年Lu等[67]针对KDR在人天然Fab噬菌体展示文库进行筛选，得到了3种对KDR具有高亲和力的克隆D2C6、D2H2和D1H4，Kd为2−4 nmol/L；研究人员通过分析以上抗体序列发现它们具有相同的VH片段，进而重新构建了具有相同VH片段的噬菌体展示文库，并筛选得到了克隆1121，它作为KDR/VEGF相互作用的阻断剂IC50值为1 nmol/L，比原本3个抗体更有效；同时1121 Fab对KDR的结合能力比3个亲本Fab都更强，Kd为0.1 nmol/L，甚至比原本配体VEGF还要高约8−9倍。将1121Fab转换成IgG1型的抗体IMC-1121后依然具有与KDR很高的亲和力，K为50 pmol/L，而且IC50值为0.8 nmol/L，是最强的KDR结合剂和最有效的KDR/VEGF相互作用阻断剂[68]。2014年Fuchs等[69]对雷莫卢单抗(ramucirumab)的有效性和安全性进行了评估，355名晚期胃癌患者被随机分配到治疗组(n=238)或安慰剂组(n=117)。在278例患者死亡中，有179例(75%)接受雷莫卢单抗治疗，99例(85%)患者服用安慰剂；试验测定接受雷莫卢单抗治疗的患者的中位总生存期为5.2个月，接受安慰剂的患者为3.8个月；6个月后治疗组总生存率预计为41.8%，安慰剂组为31.6%；12个月生存率预计为17.6%和11.8%，证明雷莫卢单抗治疗可以显著改善患者的总生存期。治疗组中高血压的发生率为16%，高于安慰剂组的8%，但是仅有少数服用雷莫卢单抗的患者出现三级高血压，且其他不良反应方面二者发生率基本相似(94%和88%)[69]。2014年雷莫卢单抗被FDA批准用于治疗晚期转移性胃癌和晚期非小细胞肺癌，商标为Cyramza。
通过PALT构建的抗体库可以利用特异性结合的能力，提高治疗效率并减少传统方法带来的副作用，在癌症诊断和靶向治疗方面都具有极高的应用潜力，利用PALT对胃癌进行治疗的研究不断增多，尤其在早期检测和靶向治疗方面均取得了诸多进展，目前已经可以使用已筛选出的抗体氨基酸特征设计新型抗体，设计的抗体中每个氨基酸的顺序和重复次数可影响亲和力等功能。
3.4 肝癌肝癌(hepatocellular carcinoma)是人类最常见、最致命、恶性程度极高的肿瘤之一。2020年全球肝癌新发病例90.6多万，死亡83万，在大多数地区，男性的发病率和死亡率都比女性高2−3倍，在男性死亡率中排名第二[1]。肝癌根据肿瘤来源不同可以分为原发性肝癌和继发性肝癌2种。目前肝癌的治疗手段主要是以手术为主的综合治疗，但是由于诊断过晚，其术后的复发和转移率很高，预后极差，被诊断为肝癌的患者的一年生存率不到50%[70]。目前，抗血管生成是肝癌的主要治疗手段[71]，但存在细胞毒性等缺陷促使人们寻求更有效的治疗手段。
早在2007年Zhang等[72]利用噬菌体展示文库对人肝癌细胞株(HepG2)和正常肝细胞株(L02)进行筛选，经过4轮淘筛筛选出抗体HCBP1，使用肝癌细胞HepG2进行体外试验，通过ELISA法、免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色等方法，证明了抗体HCBP1可以较好地与HepG2结合，而不与L02或其他类型的癌细胞HeLa结合；体内试验通过对携带HepG2的小鼠注射抗体库，在肿瘤组织中噬菌体浓度是非肿瘤器官如脑、肺、心脏和非肿瘤肝脏组织的2.2−10.5倍，发现抗体HCBP1仅定位于肝肿瘤块中，而不与脑、肺、心脏或非肿瘤肝组织结合，说明抗体HCBP1特异性结合肝癌细胞。2011年，Zhang等[73]同样使用原发性肝癌患者的血清，利用噬菌体展示文库来筛选早期原发性肝癌潜在的血清生物标志物，最后得到了血清标记结合多肽HC1；ELISA结果显示，早期肝细胞癌的HC1噬菌体克隆的阳性反应率为91.4%，而健康对照组为10.0%；与健康对照组比较，HC1检测早期肝癌的敏感性为91.4%，特异性为90.0%，阳性预测值(positive predictive value, PPV)为90.1%，准确性为90.7%，说明多肽HCl可以有效地诊断早期原发性肝癌，因此可以作为早期原发性肝癌的候选血清生物标志物。
2020年Liu等[74]利用PALT对肝癌靶点GPC3进行筛选获得一个新的人源单抗32A9；试验首先测定了32A9与GPC3-Fc蛋白的结合活性，亲和力约为1.24 nmol/L，接下来又测定了32A9与GPC3阳性细胞的结合活性，亲和力约为6.25 nmol/L，说明32A9与人GPC3具有良好的结合活性和特异性；随后在体内试验中测定32A9的抗肿瘤活性，对接种Huh-7细胞的小鼠进行静脉注射10 mg/kg的32A9抗体和等体积的PBS进行对照，治疗2周后，注射32A9的治疗组肿瘤体积明显小于对照组(P < 0.001)，减少了约65%，表明32A9具有良好的抗肿瘤活性。研究人员进一步将32A9单链抗体和去免疫的假单胞菌外毒素(mPE24)融合，构建了一种新的抗GPC3的免疫毒素32A9-mPE24，在体外试验测定其细胞毒性，用32A9-mPE24处理细胞发现其可以选择性地抑制GPC3阳性癌细胞的生长，IC50值为0.68 nmol/L；在体内外试验中32A9-mPE24显示出作为裸抗和免疫毒素的双重抗肿瘤效力，可显著抑制肝癌移植瘤的生长[74]。
原发性肝癌是危害我国人民的主要恶性肿瘤，自1994年以来，肝癌已经成为我国部分农村最常见的癌症，在部分城市仅次于肺癌。专家认为，我国肝癌流行情况仍然十分严重，肝癌发病的总体水平还将继续提高[75]，研究如何早期诊断和治疗肝癌有着重要意义，急需寻找一种具有高灵敏度和高特异性的能够用于早期诊断肝癌的新标志物，因此合理运用PALT可以帮助寻找新的可用于肝癌早期诊断的抗体及抗原。
3.5 结直肠癌结直肠癌(colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤。2020年全球结直肠癌新发病例190多万，发病率排名全球第三。我国近10年结直肠癌发病率和死亡率均呈逐年上升趋势[1]。结直肠癌在早期筛查和诊断上存在诸多困难，导致多数患者到中晚期才被确诊[76]，因此寻求敏感度高、特异性强的生物标志物用于结直肠癌早期诊断已成为研究热点[77]。
2018年Hou等[78]利用PALT筛选出一种可以与结直肠癌肿瘤细胞特异性结合的抗体CBP-DWS，用于早期结肠癌成像检测；体外试验使用的细胞是人结肠癌细胞系COLO320HSR、HCT116、SW480、HT29、LoVo和正常人肠上皮细胞系NCM460，在体外进行的COLO320HSR细胞结合试验中，抗体CBP-DWS的结合能力较强，其积分光密度值(integrated optical density, IOD)是对照抗体的8倍左右，并且在其他4种细胞系HCT116、HT29、SW480和LoVo中也都观察到了类似的结合趋势以及强烈的荧光信号，证明抗体CBP-DWS能够大量结合到结肠癌细胞系和组织上，且与正常的人肠上皮细胞株和正常的结肠周围组织几乎没有结合；生物信息学分析进一步表明，这种抗体还可以靶向作用于受体磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3, GPC3)。据此有望开发结直肠癌的检测探针和治疗药物载体。
近年来，人表皮生长因子样结构域蛋白6 (epidermal growth factor-like domain 6, EGFL6)已被报道与癌症的发展有关。2021年Sung等[79]发现EGFL6在I−IV期患者肿瘤组织中高表达，在非肿瘤组织中不表达。作者利用PALT针对靶点EGFL6制备了抗体EGFL6-E5-IgG，研究其治疗结直肠癌的潜在效果；体外试验使用的是人结肠直肠癌细胞系HCT-116和HT-29，以及小鼠结肠癌细胞系CT-26；结果显示，EGFL6-E5-IgG与抗原的亲和力为1.91×10−8 nmol/L，EGFL6-E5-IgG在荷瘤小鼠中可显著抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率(tumor growth inhibition value, TGI)为36.2% (P < 0.01)，体重没有显著变化；同时，EGFL6-E5-IgG还具有抗癌、抗转移和抗血管生成能力，且对伤口愈合无影响，证明了EGFL6-E5-IgG具有成为结直肠癌治疗剂的潜力。
作为世界上第三常见的恶性肿瘤，结直肠癌的发病率和死亡率都极高。约一半的结肠癌患者将发展为转移性结肠癌，约25%的患者在确诊后已经发生转移[80]。目前使用贝伐单抗治疗结直肠癌具有诸多不良反应，如可能会增加穿孔、出血和创面愈合并发症等[81]。此外，结肠癌患者接受支架置入治疗恶性肠阻塞也有较高的结肠穿孔风险[82]。因此，通过PALT筛选出特异性抗体来治疗结直肠癌将有助于减轻严重的不良反应并发挥有效的治疗效果。
3.6 前列腺癌前列腺癌(prostate cancer)是男性泌尿系统和生殖系统常见的癌症。2020年全球新发前列腺癌140万，死亡37.5万，是男性癌症死亡的第五大原因[1]。目前治疗前列腺癌的手段主要包括手术治疗、放射治疗和内分泌治疗，但由于其早期诊断技术有限，大多数前列腺癌病人诊断时已是进展期，不适宜进行根治性手术。由于传统治疗方法都存在明显的局限性，人们越来越多地把希望寄托于肿瘤的靶向治疗[83]。
Mintz等[84]利用PALT对前列腺癌病人血清中的循环抗体进行3轮筛选，发现几乎所有的抗体所识别的多肽都包含有N (X) S (T) DKS (T)的氨基酸序列；研究人员将CNVSDKSC的氨基酸序列与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)结合形成融合蛋白，并通过ELISA试验研究了108名前列腺癌患者和71名健康对照者血清与上述融合蛋白的结合情况。结果显示，79%的前列腺癌晚期患者的血清能够与该融合蛋白发生阳性反应，远高于健康对照者的7%。在此基础上，作者运用生化模拟和同源搜索等方法，鉴定了葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein-78 kDa, GRP78)为CNVSDKSC氨基酸序列对应的靶蛋白，并利用抗原抗体结合试验证明了抗CNVSDKSC的抗体同样可以识别GRP78蛋白[84]。综上所述，基于PALT鉴定的GRP78是前列腺癌的潜在生物标志物。
2013年Shen等[85]利用PALT从噬菌体展示文库中筛选出了2种对前列腺癌特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)具有高度亲和力的562肽(SHSFSVGSGDHSPFT)和563肽(GRFLTGGTGRLLRIS)，它们可以结合PSMA并诱导内化。数据显示，562肽和563肽的IC50值分别为661 mmol/L和708 mmol/L，而当562肽形成四聚体后其具有更小的IC50值(311 mmol/L)，能以更高的亲和力结合PSMA，从而可以进一步用于开发前列腺癌的成像检测和免疫治疗靶点。Han等[86]针对域外B纤连蛋白(EDB-FN)，开发了一种具有CTVRTSADC (ZD2)序列的环状非肽，可以用于局部特异性靶向治疗和前列腺癌成像；这种ZD2肽，在体内表现出对前列腺癌的特异性和靶向性，有望应用于前列腺癌的成像。
随着人口老龄化、饮食和生活习惯的改变，我国前列腺癌发病人数逐年增加，多以中晚期为主[87]，且发病年龄也日趋年轻化[88]。国际上对前列腺癌诊断方法的差异很可能是造成世界各地前列腺癌发病率差距悬殊的主要因素。在美国、加拿大和澳大利亚等国家，由于广泛采用前列腺特异抗原检测，可以检测出早期癌症，因而发病率逐年下降[89]。如果我国在诊疗前期也能够及时利用相关抗体进行早期诊断，前列腺癌患者的存活率有望大大提高。
3.7 膀胱癌膀胱癌(bladder cancer)是指发生在膀胱粘膜表面的恶性肿瘤[90]。2020年全球新发膀胱癌57.3万，男女比约为4:1，是男性第六常见的癌症[1]。传统的白光膀胱镜在检查微小肿瘤、原位癌时敏感性较低，有一定漏诊率，因此医学上迫切需要发现新的生物标志物用于膀胱癌的无创性诊断，同时开展更深入的研究以寻找新的靶点，为膀胱癌的精准治疗提供理论依据。
2005年Martínez-Torrecuadrada等[91]对成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)进行了研究，指出成纤维细胞生长因子受体3 (fibroblast growth factor receptor, FGFR3)可能是泌尿系肿瘤治疗的潜在靶点，并针对该靶点筛选得到了人源scFv抗体3C和7D；体外试验中使用膀胱癌细胞系RT112测定2种的亲和力，抗体3C和7D的亲和力分别为25.0 nmol/L和40.9 nmol/L；随后对RT112细胞染色后进行流式细胞术分析，当使用3B、3C、2D和7D纯化的抗体片段时，3C和7D出现了强烈的免疫荧光染色，其中大部分是活的RT112细胞，而其他抗体染色的细胞百分较低，表明抗体对表位的可及性不同；使用抗体3C和7D对RT112细胞进行的免疫沉淀试验中，产生了一条显著的条带，该条带能被FGFR3特异性识别，证实了这2种抗体识别FGFR3的能力；最后从形态学的角度发现使用3C和7D处理48 h后的细胞形态发生明显变化并且生长减慢，其中7D对细胞有着更为突出的空泡化作用。综上所述这2种抗体对癌细胞均有很好的识别效果，有望作为新型抗肿瘤药物应用于膀胱癌治疗领域。
2017年Sweeney等[92]利用PALT筛选出了抗体Cyc6，该抗体与介孔二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticle, MSN)结合后对膀胱癌细胞表现出特异性，并且在小鼠和人类等多个物种中具有同源性；体外试验使用全细胞的荧光显微镜和提取细胞膜蛋白的荧光研究来评估Cyc6的特异性。结合4 h后，膀胱癌细胞MB49的结合程度明显高于正常细胞NIH3T3；试验数据显示，在MRI中测量的分段肿瘤体积分别为7.4、9.5、15.9 mm3，其中具有7.4 mm3肿瘤的小鼠接受了FITC-Gd2O3-MSN滴注，另外2只小鼠接受了Cyc6-FITC-Gd2O3-MSN滴注，24 h后的MRI扫描结果显示，用Cyc6功能化的MSN小鼠中具有明显的低信号；在体外试验中，Cyc6与MSN结合后，提高了与膀胱癌细胞的结合效率和特异性；而在体内模型中，将MSN注入小鼠的膀胱，增强了MRI信号，提高了肿瘤边界的检测。上述研究先通过PALT筛选抗体、再结合其他技术进一步增加靶向性的这一思路可实际用于膀胱癌肿瘤治疗监测和药物输送。
阿特珠单抗(Atezolizumab)是一种靶向PD-L1的人源化IgG1单克隆抗体。阿特珠单抗可与PD-L1结合并阻止PD-L1与其受体PD-1和B7-1之间的相互作用，避免肿瘤细胞PD-L1表达后使效应T细胞失活，从而防止T细胞耗竭，体现出抗肿瘤活性。阿特珠单抗在Ⅰ期的临床治疗的数据显示[93]，尽管有57%的膀胱癌患者出现了与阿特珠单抗相关的不良反应，但是仅有4%的患者出现了三级不良反应，其他不良反应多为疲劳和食欲下降。接下来研究人员对阿特珠单抗进行了Ⅱ期研究(IMVigor210)[93]，第一组针对不适合用顺铂治疗的晚期膀胱癌患者，其总体缓释率(overall response rate, ORR)为23%，完全缓解率(complete response, CR)为9%，中位应答时间为2.1个月，中位总生存期(median overall survival, OS)为15.9个月，而中位无进展生存期(progress free survival, PFS)仅为2.7个月；第二组针对适合铂类化疗患者进行研究，不良反应率为69%，但只有16%的患者出现3−4级严重不良反应，并且没有出现与治疗相关的死亡病例；在高表达PD-L1的患者体内ORR为26%，CR为11%。2016年，FDA批准阿特珠单抗用于辅助铂类化疗膀胱癌，2017年FDA加速批准阿特珠单抗用于无法采用顺铂治疗的晚期膀胱癌患者的初始治疗，以商品名Tecentriq销售。
目前，膀胱癌的临床诊疗在医疗实践过程中仍存在许多问题，如侵入性检查导致的创伤、尿细胞学检查引起的尿路感染以及手术无法确保肿瘤全部切除等，甚至有越来越多的数据表明在多种技术改进后膀胱癌的复发率并没有明显降低[94]。而膀胱癌的早期诊断有望提升患者的生存率，因此医学上迫切需要开发新的非侵入性的检查方法以及更敏感的生物标志物和治疗靶点，近年来PALT的应用为无创性诊断和治疗膀胱癌提供了可能。
3.8 白血病白血病(leukemia)，亦称血癌，是一类起源于造血干细胞的恶性疾病。2020年全球白血病新发47.4万，死亡31.1万[1]。临床上治疗白血病的主要方法有骨髓移植和化疗等，但都存在易复发和易耐药等问题。数据显示，20岁以上急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)和急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者的5年生存率仅为25%和37%[95]，且有一半以上的患者最终复发[96]。PALT作为一种开发新抗体的有效技术，有望在白血病的临床诊断和药物研发上得到应用。
2015年Fitting等[97]利用噬菌体展示文库筛选出了一种scFv (EMI405)，结果发现分离纯化的EMI405可以特异性地结合在AML细胞和AML骨髓活检标本表面，并于15 min内被Kasumi-1细胞内化。为了进一步获得抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate, ADC)，作者将EMI405序列插入到含有假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A (exotoxin A, ETA')基因的原核表达载体，从而大规模生产具有免疫毒性的scFv-ETA'融合蛋白；采用XTT比色法检测细胞增殖活性，测得EMI405 (scFv)-ETA′的IC50值为(265.2±0.2) nmol/L，且对细胞生长的抑制呈剂量依赖性；而Kasumi-1细胞的活力既不受非特异性蛋白425 (scFv)-ETA'的影响，也不受非内化EMI408的影响；此外，EMI405对阴性对照KG-1细胞的活力无影响，证实了其靶向细胞毒性。在研究免疫毒素融合蛋白EMI405 (scFv)-ETA'诱导细胞凋亡时，检测了Kasumi-1样品中半胱天冬酶底物的信号水平；结果显示，96 h后Kasumi-1细胞的凋亡率为33.0%±1.4%，而KG-1细胞的凋亡率为0.6%±0.1%，Kasumi-1细胞在48 h和72 h时的凋亡百分比分别为4.2%±2.1%和15.9%±0.6%，表明细胞的凋亡呈时间依赖性增加。该研究将有助于人们开发新的肿瘤特异性内化抗体片段，为AML患者提供一种前所未有的免疫治疗策略。
2021年Weber等[98]针对AML的Kasumi-1细胞系构建了噬菌体展示文库，并筛选出AB11、AB22、AB24和AB35共4种抗体；流式细胞术分析结果显示，通过增加内化时间，抗体AB11、AB22、AB24和AB35都表现为荧光信号减少；共聚焦成像的结果表明，细胞膜在初始时显示出明亮的荧光信号，而240 min后荧光信号微弱，进一步证实了这4种抗体的内化活性；此外，当筛选的轮数为3轮时，发现原始细胞的计数对于噬菌体抗体选择的结果起重要的作用，并且能够分离出4种对AML原始细胞高亲和力的抗体。未来还需要使用此类抗体来验证其对恶性细胞的杀伤效果，从而进一步在临床治疗中发挥作用。
现阶段抗体免疫疗法作为治疗白血病一种的新方法，具有毒副作用低、特异性强等优点，已经引起了人们的广泛重视。近年来随着抗体人源化技术的进步，抗体药物在肿瘤临床治疗领域已取得突破性进展，在这一大背景下，基于原发肿瘤细胞的PALT有望成为白血病治疗领域的焦点。
4 总结与展望PALT是一种日渐发展成熟的抗体制备技术[32]，自1985年Smith[8]证明了噬菌体具有展示肽的能力以来，PALT便逐渐朝着简便、有效和易于控制的方向前进，在肿瘤早期诊断和治疗方面展现出很好的应用前景。本文详细介绍了PALT的发展历程和技术原理等内容，并阐述了该技术在肿瘤治疗中发挥的重要作用(表 3)。PALT在肿瘤治疗领域的主要应用方向包括：(1) 靶向治疗，利用PALT筛选得到的抗体或多肽可以发挥治疗肿瘤的作用，例如单抗IgG-69[54]、单抗IgG-H1[58]和EGFL6-E5-IgG[79]等。(2) 偶联毒素，抗体可以通过与杀伤肿瘤的活性物质相偶联，更好地发挥特异性治疗肿瘤的效果，例如抗体R9VHH17[53]、免疫毒素32A9-mPE24[74]。(3) 联合治疗，单抗与不同的肿瘤治疗方法相结合，可以实现更好的治疗效果，例如177Lu-anti-CD55抗体[60]与顺铂联合治疗。此外，PALT不仅可筛选出治疗性抗体外，也可以用于肿瘤生物标志物的筛选与鉴定，例如胃癌的标志物HSP90a、HSP90b和c-Met[66]、多肽AAD[64]和多肽HC1[73]等。
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| Breast cancer | VHH17 IgG-69 |
HER2-TK rhDLL1 |
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| Lung cancer | IgG-H1 177Lu-anti-CD55 Necitumumab |
hYKL-40 CD55 EGFR |
[58] [60] [61] |
| Gastric cancer | AAD DE532, DEObs F10, G1 Ramucirumab |
BGC823/- MKN-45/- MKN-45/HSP90a, HSP90b, c-Met VEGFR2 |
[64] [65] [66] [67] |
| Hepatocellular carcinoma | HCBP1 HC1 32A9 |
HepG2/- Serum GPC3 |
[72] [73] [74] |
| Colorectal cancer | CBP-DWS EGFL6-E5-lgG |
COLO320HSR/- HCT-116/ EGFL6 |
[78] [79] |
| Prostate cancer | CNVSDKSC GRFLTGGTGRLL-RIS, SHSFSVGSGDHSPFT ZD2 |
GRP78 PSMA EDB-FN |
[84] [85] [86] |
| Bladder cancer | 3C, 7D Cyc6 Atezolizumab |
RT112/ FGFR3 MB49/- PD-L1 |
[91] [92] [93] |
| Leukemia | EMI405 AB11, AB22, AB24, AB35 |
Kasumi-1/- Kasumi-1/- |
[97] [98] |
综上所述，利用PALT制备的抗体在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。相较于目前其他单抗制备技术，PALT具有筛选范围广、抗体制备周期短、全人源化、无需经过机体免疫等复杂步骤、可在体外环境下操作以及噬菌体表型与基因型统一易于筛选等优点。其生产的抗体不仅能够特异性识别抗原决定簇，还可以根据临床需要进行抗体结构调整而不影响抗体治疗效果，具有进行工程化大量生产的优势[99]。所以PALT出现后立即引起了各领域的广泛关注并得到迅速发展。
但PALT也具有一定的局限性。首先，PALT筛选的成功主要依靠噬菌体抗体库的库容(108−1010)大小，因为抗体库的库容决定着能否筛选出与抗原特异性结合的高质量抗体。然而，为分离出高亲和力且特异性结合的抗体需要进行大规模的淘筛。2016年Rahbarnia等[100]针对这一问题开发了一种称为倒置生物淘选的新型筛选策略，可以高效快速地分离高亲和力scFvs。试验对比了2种不同的淘筛策略获得抗体的亲和力和特异性，策略一直接对抗原进行筛选，策略二首先对消除非特异性结合的干扰，再对抗原进行筛选。用于筛选的抗原浓度同为25 mg/mL，策略一中特异性噬菌体滴度为5×106 PFU/mL，策略二中滴度为3.4×l04 PFU/mL，滴度明显小于策略一，表明该方法能够有效排除非特异性结合的干扰，提高了筛选出特异性抗体效率。
其次，PALT一般用于制备如scFv这一类分子量较小的重组抗体，这类抗体虽然具有较强的肿瘤穿透能力，但与完整抗体相比，其半衰期更短，热稳定性较差，可能在未到达特定靶点时就被分解从而无法发挥作用。针对小分子抗体结构不稳定的问题，一种有效的策略是通过各种诱变方式对抗体进行功能改造或性能优化。例如，Schier等[101]对靶向肿瘤抗原c-erbB-2的scFv进行研究，发现野生型抗体在肿瘤细胞表面的半衰期仅为13 min，而来自4个VH CDR3库的突变株抗体的半衰期则长达24 h。Miller等[102]通过结合突变将scFv的中点转变温度(mid-point transition temperature, T50)提升至82 ℃，相较于野生型BHA10抗体提高了33 ℃，有着更高的耐热性能。另一种策略是对抗体进行共价融合，构建诸如含Fc区的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)的稳定结构形式。例如，Fennell等[103]利用4个VL CDR3库的突变株生产出一种能靶向结合可溶性趋化因子CXCL13和细胞表面炎症抗原的scFv-Fc-scFv分子，并已验证该双特异性抗体在100 mg/mL标准药物缓冲液中具有良好的稳定性，适合用于皮下给药。
目前实际生产中通常使用免疫球蛋白形式的抗体，而利用PALT筛选出的scFv或Fab通常被转化为IgG形式进而应用于产品开发。但是转化的过程中，不同形式的抗体之间活性和功能缺乏一致性，有时转化后的IgG与scFv的分子性质和生物物理性质明显不同，对抗体的实际应用造成很大影响。2017年Xiao等[104]开发了一个免疫球蛋白功能筛选平台(SiPF)，它不同于以前的克隆策略，通过PCR扩增噬菌体载体上scFv的基因，得到线性化噬菌体scFv，不会干扰可变区的多样性和配对情况，进而将scFv从噬菌体文库中重新格式化为IgG，以IgG的形式进行抗体的筛选，解决了改变抗体结构所导致的功能失效等问题。
随着现代生活节奏的不断加快和自然环境的变化，恶性肿瘤在人群中的发病率不断上升，亟须开发新型有效的治疗方法。PALT的出现及噬菌体抗体的研制成功已成为生命科学研究的突破性进展之一[105]，其与现有抗体制备技术相比，具有生产周期短、抗体结构可塑性强、抗体产量大、多样性高和可直接生产人源化抗体等优点，会在未来肿瘤的诊断和治疗领域大放异彩。
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