呼吸道病毒一直以来都是引发全球性疾病大流行的主要因素之一^[1-2]。例如，新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)从2019年暴发至今，全球感染总数已超过5.7亿人^[3]。常见的呼吸道病毒还包括：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒(adenovirus, ADV)和流感病毒(influenza virus, FluV)等^[4-5]。根据临床症状显示，感染呼吸道病毒后，从轻症到重症的表现都非常相似，因此需要对所感染的病毒进行鉴别诊断^[6]。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)是一种基于特异性引物和探针的实验室诊断技术，因其具有超高的灵敏度和特异性，是诊断许多病毒感染的金标准^[7-9]。然而，普通qRT-PCR过程耗时长，荧光定量PCR仪又多为大型精密仪器，对实验环境要求高，因此无法满足临床和基层对核酸检测快速、简便和准确的要求^[10]。

近年来，关于即时检测(point-of-care testing, POCT)的应用越来越多^[11-12]。其中，基于检测核酸的POCT以等温扩增和微流控芯片为主^[13-14]，但是多数POCT需要进行额外的核酸提取^[9]。本实验室发明了一种免提取的呼吸道病毒处理试剂RTU，与常规的病毒转运培养基(viral transport medium, VTM)相比，呼吸道病毒处理试剂(extraction-free respiratory virus treatment reagent, RTU)能灭活包膜病毒，因而能将样本在常温下储存和运输。并且本试剂不仅操作简便，还能在5 min内完成核酸的释放，获取的样本可直接当作模板进行PCR扩增。本实验室还研发了一款小型的荧光定量PCR仪FQ-8A，它采用大温差模块变温技术结合高效Peltier控温，实现了反应体系超快速升降温^[15]。因此，在相同的程序下，FQ-8A比常规荧光定量PCR仪耗时更短，这使得FQ-8A能够作为实现POCT的有效工具。

本研究将通过免提取呼吸道病毒处理试剂和超快速荧光定量PCR仪FQ-8A相结合的方式，构建一套呼吸道病毒核酸快速检测方案，旨在推动快速诊断检测应用于基层、海关、车站等场景，促进快速POCT真正意义上的应用落地。

RSV和ADV4型(ADV4)均由本实验室保存和提供，新冠假病毒购自圣湘生物科技有限公司，人喉癌上皮细胞Hep2由本实验室提供。

临床样本由金域医学检验中心及广州医科大学附属第一医院检验科提供。其中，金域医学检验中心提供RSV相关阳性和阴性冻存样本209例，ADV相关阳性和阴性冻存样本221例。广州医科大学附属第一医院检验科提供102例呼吸道病原体临床样本，包括鼻病毒(rhinovirus, RhV)、3种人冠状病毒(human coronaviruses, HCoV) (HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1)、人副流感病毒1型(human parainfluenza virus type 1, HPIV-1)、肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae, CP)、人肠道病毒(enterovirus, EV)和RSV。

SARS-CoV-2检测试剂购自圣湘生物科技股份有限公司。RhV1/2、3种HCoV、HPIV-1、CP、EV、RSV和ADV检测试剂均由广州呼研所医药科技有限公司提供。磁珠法核酸提取试剂盒分别购自朗司医疗科技有限公司和上海科华生物工程股份有限公司，ABC法核酸提取试剂购自广东和信健康科技有限公司，离心柱法核酸提取试剂购自天根生化科技(北京)有限公司，免提取法呼吸道病毒处理试剂RTU由本课题组自研。以上所有核酸提取试剂，均依据说明书进行核酸提取。

全自动核酸提取仪(朗司医疗科技有限公司)；荧光定量PCR仪ABI-7500 (Applied Biosystems)、FQ-8A [呼研所生物安全科技(广州)股份有限公司]、SLAN-96P (上海宏石医疗科技有限公司)均由本实验室提供。

在处理模拟样本时，将进行5倍梯度稀释的等体积病毒或假病毒培养物与阴性咽拭子分别加入到2 mL RTU和2 mL PBS中。RTU中的样本振荡混匀10 s后静置1 min，从中取出100 μL加入到含0.5 mg螯合树脂的0.5 mL EP管中，放置于80 ℃金属浴中温浴2 min，取出待其恢复室温后使用。PBS中的样本，分别取100 μL用磁珠法、离心柱法和ABC法进行核酸提取，并均使用100 μL洗脱液收集核酸。

在处理RSV病毒培养物时，将25 μL样本加入到100 μL的RTU试剂中，振荡混匀10 s后静置1 min，加入到含0.5 mg螯合树脂的0.5 mL EP管中，放置于80 ℃金属浴中温浴2 min，取出待其恢复室温后使用。随后，另取25 μL样本使用朗司核酸提取仪提取，并使用100 μL洗脱液收集核酸。

在处理临床样本时，取等体积同一样本分别加入到2 mL RTU和2 mL VTM中。RTU中的样本振荡混匀10 s后静置1 min，从中取出100 μL加入到含0.5 mg螯合树脂的0.5 mL EP管中，放置于80 ℃金属浴中温浴2 min，取出待其恢复室温后使用。VTM中的样本，取100 μL用ABC法进行核酸提取，并使用100 μL洗脱液收集核酸。

分别使用SLAN-96P、ABI-7500和FQ-8A进行qRT-PCR实验。圣湘新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂在SLAN-96P上扩增程序为：50 ℃ 30 min；95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s采集荧光，共循环45次。RSV检测试剂在SLAN-96P或ABI-7500上进行扩增，扩增程序为：48 ℃ 5 min；94 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 35 s采集荧光信号，共40个循环；在FQ-8A上使用优化的扩增程序：48 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，94 ℃ 1 s，55 ℃ 14 s，收集荧光信号，循环40次。ADV检测试剂在SLAN-96P或ABI-7500上程序设置为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 35 s，收集荧光信号，循环40次；在FQ-8A上使用优化的扩增程序：94 ℃ 20 s，94 ℃ 1 s，65 ℃ 14 s，收集荧光信号，循环40次。各试剂均使用TaqMan探针法进行qRT-PCR反应，反应体系参照各产品说明书，当模板使用RTU处理样本时，模板体积为整个反应体系的1/10，若要求上样体积大于1/10，则只加入总体积1/10的RTU样本，其余的部分用DEPC水补充。

圣湘新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒中，FAM检测orf1ab基因，ROX检测n基因，HEX/VIC检测内标rnase p基因。若FAM或ROX通道检测到典型的扩增曲线，且C_t≤40，则报告为2019-nCoV病毒阳性；若FAM或ROX通道检测不到典型的扩增曲线，或C_t > 40，同时HEX/VIC通道有扩增曲线，且C_t≤40，则报告结果为阴性。RSV或ADV检测试剂盒中，FAM分别检测RSV或ADV的病毒基因，若FAM通道检测到典型的扩增曲线，且C_t≤35，则报告为RSV或ADV病毒阳性。

使用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析。两组间做比较时，使用t检验分析显著性差异，P < 0.05为差异具有统计学意义。评估仪器和检测体系的性能，分别计算它们的灵敏度和特异性，用Cohen Kappa系数(k)来评价两种方法之间的一致性水平，其中k=1，两次的结果完全一致；k=–1，两次的结果完全不一致；k > 0时有统计学意义，k值越大一致性越好^[16]。

将RSV病毒培养物进行梯度稀释后，分别用RTU和全自动核酸提取仪获得目标核酸，并通过qRT-PCR检测各稀释度下的C_t值。结果显示RTU或全自动核酸提取仪获取的核酸在不同浓度下均有明显的梯度曲线(图 1A)。在提取原浓度的RSV病毒时，RTU提取效果相较于全自动核酸提取仪高约3个C_t，但随着RSV的梯度稀释，RTU的提取效果逐渐与全自动核酸提取仪持平，当RSV稀释到5⁵倍时，两种方法均检测不到C_t值(图 1B)。绘制回归曲线看到，全自动核酸提取仪得到的回归直线拟合度更好，RTU得到的高浓度C_t值分布回归直线两端，中低浓度C_t值则坐落于直线上(图 1C)。说明RTU处理中低浓度样本时，与全自动核酸提取仪的检测灵敏度相当。

图 1 RTU的灵敏度验证 Fig. 1 RTU sensitivity verification. RSV was diluted by 5 times gradient using PBS, and each gradient was separately treated by RTU or nucleic acid extraction instrument. Three samples were extracted from each gradient, Ct values were used to judge the treatment effect of RTU. A: Fluorescence amplification curve of RSV. B: Comparison of Ct values of RSV in different dilution. C: Standard curves of 5-fold diluted RSV treated with RTU and nucleic acid extraction instrument. The statistical significances were calculated by t test, ns: P > 0.05; *: P < 0.05; ***: P < 0.001. 使用PBS对RSV进行5倍梯度稀释，每个梯度分别使用RTU或全自动核酸提取仪提取，每个梯度各提取3个样本，通过Ct值来判读RTU处理效果. A：检测RSV的荧光扩增曲线图. B：不同稀释度下检测RSV的Ct值比较. C：RTU和核酸提取仪处理5倍梯度稀释RSV的标准曲线. 使用t检验进行统计学分析，ns: P > 0.05；*: P < 0.05；***: P < 0.001

图选项

用RTU、ABC法、磁珠法和离心柱法提取含不同浓度的呼吸道病毒的咽拭子样本。通过qRT-PCR检测到的Ct值分析发现，对于RSV咽拭子样本，在各个浓度下，RTU和离心柱法的处理效果均较好，磁珠法和ABC法的效果则略差一些(图 2A)。对于ADV4咽拭子样本，这4种提取方法在各浓度下的处理效果均接近一致(图 2B)。对于SARS-CoV-2假病毒咽拭子样本，在各浓度下，仍然是RTU与离心柱法的处理效果相对更好，磁珠法略差于离心柱法，而ABC法效果相对最差(图 2C)。此外，使用RTU提取时，耗时低于5 min，而使用全自动核酸提取仪(磁珠法)所消耗的时间为22 min，ABC法和离心柱法所耗时间则更长。因此，RTU能在极短的时间内完成不同呼吸道病毒样本的处理，并且整体效果上甚至更优于3种常规核酸提取方法。

图 2 RTU处理不同类型病毒的效果 Fig. 2 The effect of the RTU on different types of viruses. Throat swabs containing RSV, ADV4 and SARS-CoV-2 pseudoviruses were homogenized and placed into RTU or PBS solutions. Nucleic acid was extracted by RTU, ABC, magnetic beads and centrifugal column methods, respectively. 4 extraction methods were used for each gradient virus concentration sample, and 3 replicated were performed. A: Comparison of the effect of different extraction methods in RSV-containing throat swabs, FAM channel for RSV detection. B: Comparison of the effect of different extraction methods in pharyngeal swab containing ADV. FAM channel was used to detect ADV4. C: Comparison of the effect of different extraction methods in pharyngeal swabs containing SARS-CoV-2 pseudovirus. FAM channel was used to detect the orf1ab gene, and ROX channel was used to detect the n gene. The statistical significances were calculated by t test, ns: P > 0.05; *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001. 将含有等量RSV、ADV4和SARS-CoV-2假病毒的咽拭子分别放入到RTU和PBS溶液中，再分别使用RTU、ABC法、磁珠法和离心柱法提取核酸. 每个梯度浓度的病毒样本均使用4种方法重复提取3次. A：比较不同提取方法处理RSV咽拭子样本，FAM通道检测RSV. B：比较不同提取方法处理ADV咽拭子样本，FAM通道检测ADV. C：比较不同提取方法处理SARS-CoV-2假病毒咽拭子样本，FAM通道检测orf1ab基因，ROX通道检测n基因. 使用t检验进行统计学分析，ns: P > 0.05；*: P < 0.05；**: P < 0.01；***: P < 0.001

图选项

RSV临床样本在FQ-8A上的检测分析。对209例冻存的RSV相关阳性和阴性样本使用上海科华提取试剂提取后，使用相同的模板和检测试剂分别在FQ-8A和ABI-7500上进行扩增。结果显示，FQ-8A的灵敏度为100%，特异性为92.31%，总体符合率为97.13%；两者一致性kappa系数为0.938 (P < 0.001)，表明结果具有高度一致性(表 1)。此外，超快速荧光定量PCR仪FQ-8A检测到的C_t值较小于ABI-7500检测到的C_t值，根据判读结果，在ABI-7500上为临界值或阴性的结果在FQ-8A上可能为阳性，这也提示FQ-8A具有更高的阳性检出率。

ADV临床样本在FQ-8A上的检测分析。对221例冻存的ADV相关阳性和阴性样本使用上海科华提取试剂提取后，使用相同的模板和检测试剂分别在FQ-8A和ABI-7500上进行扩增。结果显示，FQ-8A的灵敏度为99.22%，特异性为88.04%，总体符合率为94.57%；两者一致性kappa系数为0.887 (P < 0.001)，其中FQ-8A仅有1例阳性未检出，总的来说二者结果一致性较高(表 2)。但FQ-8A上所需检测时间较ABI-7500显著减少，说明FQ-8A更适合对临床样本进行快速的病毒基因检测(表 3)。

本研究将RTU与FQ-8A相结合，构建呼吸道病毒核酸快速检测方案。对RTU和FQ-8A组成快速检测方案，与ABC法和ABI-7500组成的常规检测方案进行比较。在采集的102例患者咽拭子样本中，使用快速检测方案检测出阳性样本为22例，阴性样本为80例；常规检测方案检测出阳性样本为24例，阴性样本为78例(国家微生物科学数据中心，登录号：NMDCX0000181)。其中，快速检测未检出的2例阳性为临界值样本，快速检测方案的C_t值普遍高于常规检测方案的C_t值。呼吸道病毒核酸快速检测方案灵敏度为91.70%，特异度为100%，总体符合率为98.04%，经统计分析，kappa值为0.944 (P < 0.001)，两者结果具有良好的一致性(表 4)。从样本处理到扩增结果，常规检测方案所需时间至少为2 h，但快速检测方案耗时仅为35 min (图 3)。这也说明，依赖于RTU和FQ-8A的快速检测方案能在30 min左右完成呼吸道病毒临床样本的快速鉴定。

图 3 呼吸道病毒核酸快速检测方案 Fig. 3 Rapid scheme for detection nucleic acid of respiratory viruses. After pharyngeal swab samples were collected into RTU preservation solution, 100 μL sample mixture was taken out and added with 0.5 mg resin for heating treatment, one-tenth of the total volume of reaction system was taken out as template, and the rapid amplification procedure was used for amplification on FQ-8A, the whole process took about 35 min. 采集咽拭子样本至RTU保存液中，取出100 μL样本混合液加入0.5 mg树脂并进行加热，取反应体系总体积的1/10作为模板，使用快速扩增程序在FQ-8A上扩增，整个过程用时35 min

图选项

呼吸道病毒如SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒感染(corona virus disease 2019, COVID-19)仍然是严重威胁人类健康的呼吸道疾病之一，准确和尽早地发现SARS-CoV-2的感染对最大限度地减少病毒传播和启动治疗至关重要。在所有的检测方法中，qRT-PCR被认为是鉴定病毒核酸的金标准，而其中“核酸提取”和“核酸扩增”是整个检测的限速步骤^[17]。有报道表明，样本的采集和储存方式^[18]，样本核酸的提取方法甚至选择不同的提取试剂盒，都会影响到qRT-PCR的检测结果，而这也可能导致假阳性或假阴性的出现^[19]。同时，常规qRT-PCR检测需要昂贵的大型仪器、专用的实验室以及专业的操作人员，这些因素都限制了qRT-PCR被更广泛地应用。因此，一种便于携带，对场地和人员操作要求均不高的PCR仪的研发就显得非常重要。同时，构建一套快速准确、灵敏度高、操作简便的核酸检测方案，对快速诊断和疫情防控都具有非常重要的现实意义。

目前，全球对样本的处理普遍采用2种方法，传统核酸提取法和释放剂法^[20-21]。传统核酸提取法如异丙醇沉淀法、离心柱纯化法和磁珠提取法等，虽然能提取到纯度较高的核酸，但操作步骤繁琐、耗时长。释放剂法是一种将保存液、灭活液和裂解液3种功能合一的免提取快速处理方法，释放剂法一般只需要处理5–10 min，但这种方法得到的核酸通常纯度较低，对于较复杂的样本如痰液、肺泡灌洗液等，通常处理效果较差^[22]。本课题组的前期工作中，研发了一种免提取的呼吸道病毒处理试剂RTU。在这里，首先进一步验证了RTU的灵敏度和RTU对不同呼吸道病毒的检测效果。本研究观察到，RTU具有和市售核酸提取仪相当的检测灵敏度，特别当样本是中浓度或低浓度时，RTU的处理效果甚至更好(图 1)。RTU对不同呼吸道病毒样本进行处理时，在各个浓度梯度下，甚至展现出了更优于传统核酸提取方法的效果(图 2)。本研究认为这种更好的效果一方面是RTU更适合处理这种不含抑制剂的纯净样本，另一方面只有当RTU体积远多于样本体积时才能保证样本被充分地裂解(图 1和图 2)。除了处理效果好，RTU还操作简便，所用时间少于5 min，因此能极大地缩短样本处理过程。FQ-8A则是本课题组研发的一款便携式超快速实时荧光定量PCR仪，为验证FQ-8A在临床样本上的检测准确性，本研究比较了ABI-7500和FQ-8A对ADV和RSV临床样本的检测差异性。其中，RSV和ADV的总体符合率分别为97.13%和94.57%，结果表现出了高度一致性(表 1和表 2)，但FQ-8A能大幅减少所用时间(表 3)。接下来，将RTU与FQ-8A结合构建整套快速检测方案，并与常规检测方案一起对不同的临床样本进行检测，其总体符合率为98.04% (表 4)。相比之下，快速检测方案只需要35 min就能完成多种呼吸道病毒感染的筛查(图 3)，能大大缩短患者的等待时间。此外，本研究还发现RTU中的样本易于保存，室温中放置3 d也未见明显降解。FQ-8A则实现了PCR仪的小型化，它的重量为3 kg，占地面积仅为A4纸大小，因此便于携带^[15]。但是，本研究所构建的方案也有一定的缺陷，对于模板量较低的样本，整套方案的检测灵敏度有所降低，但这也是所有检测所面临的一大难题^[23]。同时，本研究所使用的检测试剂均为液体，这就需要在–20 ℃进行储存和运输，未来将考虑替换成冻干型试剂，这样既可以减少上样操作时间，又可以省去冷链运输和储存的成本。

总的来说，本研究构建了一套结果准确、操作简便且易于携带的呼吸道病毒核酸快速检测方案，为推动分子检测应用于社区医院、门诊、药店等基层医疗机构奠定了基础。