生物工程学报  2024, Vol. 40 Issue (12): 4546-4556 |
表1(Table 1)
引用本文
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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的猪的一种高度传染性疾病，主要造成母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难、高死亡率及免疫机能障碍，在世界范围内广泛流行，困扰全球养猪业的持续健康发展。PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞，感染后肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、单核细胞趋化蛋白1 (macrophage chemoattractant protein-1, MCP-1)、白介素6 (interleukin-6, IL-6)和白介素8 (interleukin-8, IL-8)等多种炎症因子大量表达，使猪机体炎症调节失衡，目前PRRSV没有特效治疗药物，PRRSV活疫苗和灭活疫苗分别存在对异源毒株效果较差和不能有效介导细胞免疫等问题，因此充分了解PRRSV的复制机制有助于进行疾病防控[1-3]。
病毒复制改变了宿主细胞的代谢过程，包括糖酵解、脂肪酸合成和谷氨酰胺分解[4]，不同病毒诱导宿主细胞代谢途径有一定差异，葡萄糖作为细胞供能和大分子物质合成重要碳源，在细胞代谢重构中的作用重大。葡萄糖主要通过2种途径分解代谢：糖酵解和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)，目前研究发现宿主细胞糖代谢改变在病毒复制过程中起重要作用，如新型冠状病毒[5-6]、Seneca virus A[7]、鸡新城疫病毒[8]诱导糖酵解过程升高都会促进病毒复制。另有研究发现PRRSV通过低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1)[9]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶[10]改变了宿主细胞糖代谢过程，然而目前对猪原代肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)糖酵解与PRRSV复制之间的关系的研究较少，因此本研究将PRRSV感染PAMs，利用不同种类糖酵解酶的抑制剂，研究抑制糖酵解对PRRSV复制的影响，探究糖酵解在PRRSV复制过程中的作用，进一步揭示PRRSV感染增殖的机制。
1 材料与方法 1.1 材料Marc145细胞、PRRSV病毒(GenBank登录号：KP860909)、shHIF1α慢病毒(滴度1×108 TU/mL)由本实验室保存；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Biological Industries (BI)；Total RNA Extraction Reagent、HiScript Ⅲ RT SuperMix和SYBR Green Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；β-actin鼠抗单克隆抗体(1:1 000稀释)购自Cell Signaling Technology公司；HIF-1α鼠抗单克隆抗体(1:1 000稀释)抗体购自Abcam公司；HK2兔多克隆抗体(1:1 000稀释)、PFKFB3兔多克隆抗体(1:1 000稀释)、PKM2兔多克隆抗体(1:1 000稀释)、PDK3兔多克隆抗体(1:1 000稀释)购自北京博奥森公司；山羊抗兔IgG-HRP、SDS-PAGE凝胶制试剂盒和超敏增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；2-脱氧-d-葡萄糖(2-deoxy-d-glucose, 2-DG)、6-磷酸果糖-2-激酶(6-phosphofructo-2-kinase, PFK)抑制剂PFK-015、草氨酸钠(oxamate)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1激动剂PS48均购自Med Chem Express公司；ATP含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖和乳酸检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2 方法 1.2.1 猪原代肺泡巨噬细胞的制备和处理30日龄健康断奶仔猪自由采食饮水饲养3 d消除机体应激反应，根据文献[11]中的方法采用肺泡灌洗法无菌分离收集PAMs，用10% FBS和1%青-链霉素的培养液调整细胞浓度至1×106个/mL备用。PAMs以原液感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1感染PRRSV，2 h后换成含2% FBS和1%青-链霉素的维持液，感染不同时间后收集细胞；或使用不同浓度糖酵解抑制剂的维持液处理，在感染后24 h收获细胞，用于后续试验。本研究经龙岩学院伦理委员会审核批准(审查批号：LY2024012X)。
1.2.2 qPCR检测mRNA表达按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，并反转录为cDNA进行扩增反应，以β-actin为内参基因，检测多种目的基因mRNA表达水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。采用2−ΔΔCt法计算目的基因的mRNA相对表达量。引物序列见表 1。
| Gene name | Primer sequences (5′→3′) | Product length (bp) |
| PRRSV-F PRRSV-R |
ACCTCCAGATGCCGTTTGT | 78 |
| ATGTGCCGTTGACCGTAGT | ||
| IFN-β-F | GCTCCACTACTCAAGTGCTGAAGGCTC | 348 |
| IFN-β-R | GCTCCACTACTCAAGTGCTGAAG | |
| IFITM3-F IFITM3-R |
GCTGCCCTTCCACCAACG | 132 |
| ACTGAGTCGATCATCCTTCTCC | ||
| ISG15-F ISG15-R |
ACCTGTCGCCAAAGCCCAC | 48 |
| TCTTCACCTTCAGTTCCCTACCCAT | ||
| β-actin-F | AGGAAGGAGGGCTGGAAGAG | 175 |
| β-actin-R | TGCGGGACATCAAGGAGA |
收集PAMs用RIPA裂解液获得细胞蛋白样品，测定浓度，蛋白质经Western blotting进行分析，4 ℃冰箱过夜孵育目的蛋白一抗，37 ℃恒温箱孵育辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗2 h，洗膜后曝光观察分析，结果用Image J对结果条带进行灰度分析。
1.2.4 病毒TCID50测定收集的细胞上清液用无血清培养液10倍倍比稀释为10−1至10−8，接种到96孔板融合度为85%的Marc145细胞，每个稀释度设置4个重复，每孔100 μL，在37 ℃ CO2培养箱中接种2 h后换成维持液，继续放在37 ℃ CO2培养箱中培养72 h，观察并统计细胞病变，用Reed-Muench法计算病毒的半数组织细胞感染剂量(50% tissue culture in fectivedose, TCID50)。
1.2.5 RNAi将PAMs接种12孔板，每孔1×106个，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜，−80 ℃冻存的shHIF-1α慢病毒(HIF-1α-559-CCGUGCGAC CAUGAGGAAATT)在冰上融化后使用，按照MOI=5接种，病毒感染时，加入1/2体积新鲜培养液，慢病毒感染4 h后补足至培养体积。
1.2.6 葡萄糖、乳酸和ATP检测葡萄糖、乳酸和ATP检测试剂盒用于检测PAMs上清液和细胞中的葡萄糖、ATP和乳酸含量。使用葡萄糖测定试剂盒在505 nm处通过吸收检测细胞上清液含量；使用乳酸测定试剂盒在570 nm下测量培养上清液中的乳酸产量；使用ATP测定试剂盒在340 nm处通过吸收检测细胞内ATP含量。
1.3 数据统计分析试验数据用GraphPad Prism 5.0软件进行分析：组间差异性采用单因素方差分析确定，结果以平均值±标准差(x±s)表示；P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著；ns表示无显著差异。
2 结果与分析 2.1 PRRSV感染促进肺泡巨噬细胞糖酵解为检测PAMs感染PRRSV后葡萄糖代谢的变化，将MOI=1的PRRSV感染PAMs后不同时间，收集细胞和上清液，结果显示，与空白对照组相比，PRRSV感染24 h后上清液中葡萄糖浓度显著降低(P<0.05) (图 1A)；在乳酸含量方面，与空白对照组相比，PRRSV感染12 h后上清液中乳酸浓度显著升高(P<0.05)，24 h后极显著升高(P<0.01) (图 1B)，表明感染PRRSV的PAMs对葡萄糖利用增加，诱导乳酸产生。相较于三羧酸循环(TCA循环)，葡萄糖若仅通过糖酵解途径进行代谢，则在相同的质量下，所产生的ATP数量显著较少。结果显示，与空白对照组相比，PRRSV感染的PAMs细胞在24 h的细胞内ATP水平显著降低(P<0.01) (图 1C)。使用Western blotting方法进一步检测糖酵解关键限速酶的蛋白水平，结果如图 1D所示，HK2、PFKFB3和PKM2在感染后12 h或24 h显著升高，而PDK3的表达无明显变化。以上结果表明PAMs感染PRRSV后糖酵解水平升高。
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| 图 1 PRRSV诱导PAMs糖代谢变化 Fig. 1 PRRSV infection induces glycolysis in PAMs. The content of glucose (A) and lactate (B) in the supernatant, and intracellular ATP content in PAMs (C). D: The expression of HK2, PFKFB3, PKM2, PDK3 and PRRSV M protein were analyzed by Western blotting. E: Gray value analysis of HK2, PFKFB3 and PKM2. M: Mock; P: PRRSV. *: P<0.05, **: P<0.01. 上清液中葡萄糖(A)、乳酸(B)和PAMS细胞内ATP含量(C)变化. D：Western blotting检测HK2、PFKFB3、PKM2、PDK3和PRRSV M的蛋白表达量. E：HK2、PFKFB3和PKM2的灰度值分析. *：P<0.05，**：P<0.01 |
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为验证PAMs糖酵解过程对PRRSV复制的必要性，使用糖酵解抑制剂降低糖酵解水平后检测PRRSV。2-DG是葡萄糖的类似物和己糖激酶的竞争性抑制剂，PFK-015是一种特异性的PFKFB3抑制剂，oxamate是一种特殊的乳酸脱氢酶抑制剂，分别用不同浓度的2-DG、PFK-015和oxamate处理PAMs，CCK-8法检测不同抑制剂对细胞毒性，结果如图 2A所示，所用浓度的药物对细胞均无毒性。使用Western blotting方法检测PRRSV蛋白水平，结果如 图 2B所示，2-DG、PFK-015和oxamate均以剂量依赖的方式降低PRRSV M蛋白表达。与之相似，2-DG、PFK-015和oxamate处理24 h后，细胞上清液中的病毒滴度也显著降低(图 2C) (P<0.05)，PAMs内病毒RNA显著减少(图 2D) (P<0.05)，表明抑制糖酵解过程会降低PAMs内病毒复制。
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| 图 2 抑制糖酵解过程减弱PRRSV复制 Fig. 2 Glycolytic inhibitors impair PRRSV replication. A: The effects of different inhibitors on PAMs cell viability. B: The effects of different inhibitors on PRRSV M protein expression level. C: The effects of different inhibitors on PRRSV viral titer. D: The effects of different inhibitors on PRRSV M gene expression. *: P<0.05; **: P<0.01. A：不同抑制剂对PAMs细胞活力影响. B：不同抑制剂对PRRSV M蛋白表达水平影响. C：不同抑制剂对病毒滴度的影响. D：不同抑制剂对PRRSV M基因表达的影响. *：P<0.05；**：P<0.01 |
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HIF-1α是决定葡萄糖是通过氧化磷酸化还是糖酵解过程的关键因子，通过激活糖酵解相关调节酶如HK2、PFKFB3和PKM2的转录来上调糖酵解途径，通过敲低HIF-1α通路下调PAMs细胞糖酵解，然后检测其对PRRSV复制的影响。检测PAMs感染PRRSV后HIF-1α表达情况，结果如图 3A所示，与Mock组(未感染PRRSV)相比，PAMs感染PRRSV后细胞内HIF-1α含量显著升高(P<0.05)。PRRSV感染激活PAMs内HIF-1α表达，为验证HIF-1α对PRRSV复制的作用，通过敲低HIF-1α下调PAMs的糖酵解，然后检测其对PRRSV复制的影响。利用慢病毒介导的RNAi技术建立shHIF-1α，感染PAMs 48 h后再接种PRRSV 24 h后收取细胞和上清液，与shctrl组PAMs相比，shHIF-1α PAMs中的HIF-1α蛋白显著降低(图 3B)；与PRRSV感染的shctrl组相比，PRRSV感染的shHIF-1α细胞中的PRRSV M蛋白显著降低(图 3B)；与PRRSV感染的shctrl组相比，PRRSV感染的shHIF-1α PAMs细胞上清液中的乳酸浓度显著降低，表明PRRSV诱导的糖酵解过程受HIF-1α的调控(图 3C)。结果表明HIF-1α信号通路在PRRSV复制过程中起重要作用。
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| 图 3 HIF-1α信号通路影响PRRSV复制 Fig. 3 PRRSV replication is impaired by knocking down HIF-1α pathway. A: The levels of HIF-1α in PAMs infected with PRRSV. B: The expression of PRRSV M protein in PAMs transfected with HIF-1α shRNA. C: The levels of lactate in PAMs supernatant transfected with HIF-1α shRNA. M: Mock; P: PRRSV. *: P<0.05; **: P<0.01. A：PAMs感染PRRSV后HIF-1α表达水平. B：抑制HIF-1α表达对PRRSV M蛋白表达影响. C：抑制HIF-1α表达对乳酸含量影响. *：P<0.05；**：P<0.01 |
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为了进一步验证PAMs细胞糖酵解对PRRSV复制的影响，测定了糖酵解增强剂对PRRSV复制产生的影响。PS48是一种PDK1激活剂，能够将葡萄糖代谢从TCA循环转移到糖酵解。PAMs细胞以MOI=1感染PRRSV，24 h后收获细胞和细胞上清液。结果如图 4A–4C所示，PS48提高细胞内PRRSV M蛋白、病毒mRNA水平和病毒滴度，表明增强糖酵解能促进PRRSV的复制。
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| 图 4 提高糖酵解过程促进PRRSV复制 Fig. 4 Enhancing the glycolytic pathway further promotes PRRSV replication. The effects of PS48 affects the expression of PRRSV M protein (A), PRRSV M gene (B), and viral titer (C) in PAMs cells. *: P<0.05. PS48对PAMs细胞PRRSV M蛋白表达(A)、PRRSV M基因表达(B)、病毒滴度(C)的影响 |
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干扰素在抗PRRSV感染过程中发挥了重要作用，然而PRRSV的感染能够抑制干扰素的产生，从而引起猪机体出现明显的免疫抑制现象。干扰素的抗病毒机制是通过诱导机体组织细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制。本研究证明PRRSV感染促使糖酵解，为进一步验证糖酵解和干扰素的关系，检测抑制或增强糖酵解过程时，PRRSV感染的PAMs细胞中的干扰素产生和干扰素刺激基因(interferon stimulated gene, ISG)水平。结果如图 5所示，PRRSV显著抑制IFN-β的表达(P<0.01)；PRRSV感染2-DG或oxamate抑制糖酵解的PAMs后，干扰素表达升高，ISG15 mRNA转录水平显著升高(P<0.05或P<0.01)，IFITM3 mRNA转录水平升高但无统计学差异；PS48处理使IFN-β、IFITM3和ISG15 mRNA转录水平进一步降低。这些结果表明，PRRSV调控干扰素表达与糖酵解过程密切相关。
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| 图 5 糖酵解对IFN-β mRNA (A)、ISG15 mRNA (B) and IFITM3 mRNA (C)表达的影响 Fig. 5 Effect of glycolysis on IFN-β mRNA (A), ISG15 mRNA (B) and IFITM3 mRNA (C) expression. **: P<0.01 vs. control. #: P<0.05; ##: P<0.01 vs. PRRSV. |
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病毒依赖宿主细胞代谢来提供其复制所需的能量来驱动其复制、装配和释放，在病毒感染过程中宿主细胞运用多种方式抵御病毒的入侵，包括自身代谢方式改变、自身的免疫防御等，因此对病毒-宿主相互作用的更好理解可能为防控病毒感染提供新的潜在方法。本研究的结果揭示了糖酵解促进PRRSV复制，在PRRSV感染过程中起重要作用，这可能成为潜在的抗PRRSV新方法。
先前的研究结果显示，某些病毒增强宿主细胞的糖酵解，以促进病毒复制。Codo等[6]研究发现新型冠状病毒感染的单核细胞通过诱导的mtROS产生稳定HIF-1α，从而上调糖酵解基因和表达大量的促炎细胞因子，而糖酵解过程是新型冠状病毒复制所必需的。Zhou等[12]研究发现HBV激活糖酵解来阻止视黄酸诱导基因Ⅰ (retinoic acid-inducible gene-Ⅰ, RIG-Ⅰ)诱导的干扰素产生，糖酵解抑制剂DCA减少HBV复制。Li等[13]研究发现猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)感染后会提高糖酵解水平，增加乳酸和丙酮酸的含量，沉默糖酵解代谢的限速酶HK2可以诱导自噬，但减少干扰素信号通路、核转录因子κB (nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)信号通路，并抑制CSFV感染诱导的细胞凋亡。本研究发现PRRSV感染PAMs后，葡萄糖摄取量增加，细胞上清液中乳酸量显著升高，细胞内ATP产生量减少，糖酵解关键酶HK2、PFKFB3和PKM2含量升高，表明PRRSV感染后提高PAMs糖酵解水平。使用糖酵解的抑制剂2-DG、PFK-015和oxamate后，均能抑制PRRSV在PAMs内的复制；而糖酵解增强剂PS48增强PRRSV mRNA和蛋白的表达，这些结果表明糖酵解在PRRSV复制过程中起重要作用。
HIF-1α是一种主要的转录激活因子，允许细胞适应缺氧，对组织细胞适应缺氧具有调节作用，HIF-1α的作用几乎涵盖了生理学的全部方面，包括细胞能量代谢、胚胎发育、免疫应答等方面，同时，HIF-1α在炎症方面也起到至关重要的调控作用[14]。在正常氧气环境条件下，HIF-1α被3种脯氨酰羟化酶域(prolyl hydroxylase domain, PHD)羟基化，然后被含有冯·希佩尔-林道肿瘤抑制因子(von Hippel Lindau tumor suppressor protein, pVHL)的E3连接酶识别，导致其多泛素化和降解，在低氧条件下，PHD活性的抑制减少了HIF-1α的羟基化，使其稳定[15]。HIF-1α在病毒诱导炎症中起重要作用，病毒感染后细胞内HIF-1α稳定性增加，降解减少，转运进入细胞核，激活HIF-1α通路，使细胞糖酵解水平升高，巨噬细胞向M1型极化，诱导多种促炎细胞因子表达，如TNF-α、IL-6和IL-1β等，促进病毒复制[16-20]。本研究发现PRRSV感染导致PAMs内HIF-1α蛋白含量升高，可能与HIF-1α的泛素化降低从而引起其在细胞内积累有关。为进一步验证HIF-1α在PRRSV感染中的作用，使用HIF-1α的慢病毒降低其在细胞内含量，结果发现PRRSV感染后细胞上清液中乳酸含量显著降低，病毒蛋白表达量也显著降低，表明PRRSV诱导的糖酵解部分依赖于HIF-1α信号通路。
干扰素是限制病毒基因表达和复制的一道重要防线，研究表明糖代谢与机体免疫系统活动密切相关，一方面激活的免疫系统将代谢系统重新编程为增强的分解代谢活动，另一方面提高代谢满足免疫细胞增加的能量需求[21-23]。当RNA病毒进入细胞，模式识别受体RIG-Ⅰ与线粒体的诱导线粒体抗病毒信号转导蛋白(mitochondria antiviral signaling protein, MAVS)结合产生反应，诱导IFN的产生；病毒感染细胞后，通过提高己糖激酶、乳酸含量，促进细胞糖代谢由氧化磷酸化转为糖酵解，己糖激酶和乳酸竞争性结合MAVS，促进MAVS与RIG-Ⅰ解离，从而抑制干扰素表达[12, 24-25]。本研究结果显示，PRRSV感染PAMs后抑制干扰素表达，PAMs糖酵解水平升高，抑制PAMs糖酵解过程后PRRSV诱导的干扰素呈显著降低升高，增强糖酵解后抑制干扰素表达，这表明糖酵解对PRRSV复制的影响与干扰素信号密切相关。
4 结论PRRSV感染PAMs可以激活HIF-1α信号通路，促进宿主细胞的糖酵解，并为病毒的快速复制提供支持，抑制PAMs糖酵解过程能显著降低PRRSV复制水平。因此，研究PAMS细胞代谢与PRRSV复制相互作用关系，对阐明PRRSV感染机制具有重要意义，为PRRSV防控提供了新的方向。
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