三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌的一种独特临床病理分类亚型，以雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)和人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor-2, Her-2)表达阴性为特征，恶性程度高，侵袭能力强，复发率高，预后差^[1]。因缺乏ER、PR和Her-2的表达，TNBC对激素受体的内分泌治疗和Her-2的靶向治疗不敏感，导致其治疗选择十分有限^[2]。三阴性乳腺癌发病率约占所有乳腺癌的15%−20%，但高达83%的乳腺癌相关死亡由三阴性乳腺癌导致，危害性很大^[3]。为改善三阴性乳腺癌患者的预后，实现精准治疗，Jiang等^[4]基于大样本三阴性乳腺癌患者基因、转录分子特征和临床数据分析，提出了三阴性乳腺癌“复旦分型”，并揭示了各个亚型的靶向治疗策略，大大提高了治疗有效率(objective response rate, ORR)^[5]。然而大部分三阴性乳腺癌对这些已有的精准治疗策略不敏感，使得三阴性乳腺癌依然是一个临床治疗难题，亟待研究。

蛋白磷酸化几乎与包括受体介导的信号转导、分化、增殖、转化和代谢等细胞全部的生理或病理过程密切相关，磷酸化蛋白质及其调控酶的失调会导致细胞各项生命活动的异常，从而导致发生癌变^[6]。Zagorac等^[7]运用高通量磷酸化蛋白质组学，阐明了与TNBC相关的磷酸化位点和激酶，并提出了一个基于靶点的TNBC临床分类系统，发现了6种和TNBC患者预后相关的激酶，为筛选TNBC临床治疗候选药物提供依据。因此通过对失调磷酸化蛋白及其调控酶的研究，可揭示三阴性乳腺癌的发病机制，发现特异性肿瘤标志物，建立基于蛋白质组特征分子组合的诊断模型，进而发现潜在药物靶点，阐明药物耐受机制。笔者就近年来磷酸化蛋白质组学技术在三阴性乳腺癌分子机制和诊治研究中的进展进行综述。

1 三阴性乳腺癌研究进展

三阴性乳腺癌是一种高度异质性的疾病，也是目前乳腺癌中最难治疗的一种，其死亡率高，易复发。因缺乏相关受体的表达，三阴性乳腺癌对激素和靶向治疗都不敏感，治疗方法十分有限^[8]。尽管其对化疗有一定的敏感性，然而在常规化疗治疗后，三阴性乳腺癌患者预后仍较差。根据文献报道，Ⅲ−Ⅳ期三阴性乳腺癌患者的5年生存率仅为13%^[9]，且目前尚无明确的内分泌及靶向治疗方案。

1.1 三阴性乳腺癌分子分型的研究进展

激素受体阳性或HER-2阳性的乳腺癌患者可以接受抗激素治疗或靶向治疗，而三阴性乳腺癌因其分子机制不明确，仍限于以细胞毒性化疗药物为主要的治疗手段。为了改善三阴性乳腺癌患者的诊疗现状，近年来对三阴性乳腺癌的分子分型的研究逐渐深入。2011年，Lehmann等^[10]检测了587名三阴性乳腺癌患者的共2 188组基因组的表达谱，将三阴性乳腺癌细分为6种亚型：基底细胞样1型(basal-like1, BL1)、基底细胞样2型(basal-like2, BL2)、免疫调节亚型(immunomodulatory, IM)、间质型(mesenchymal, M)、间质干细胞样亚型(mesenchymal stem-like, MSL)和管腔雄激素受体亚型(luminal androgen receptor, LAR)。2015年，Burstein等^[11]分析了198例TNBC患者的mRNA和DNA表达特征，并使用公共数据集进行验证，成功鉴定了4种不同的三阴性乳腺癌亚型：雄激素受体型(LAR)、间充质型(mesenchymal, MES)、基底样免疫抑制型(basal-like immune-suppressed, BLIS)以及基底样免疫激活型(basal-like immune-activated, BLIA)。2019年，Jiang等^[4]基于复旦大学肿瘤中心的465例原发性三阴性乳腺癌患者的基因、转录分子特征和临床数据分析，提出了三阴性乳腺癌“复旦分型”，将TNBC分为免疫调节型(IM)、腔面雄激素受体型(LAR)、基底样免疫抑制型(BLIS)和间质型(MES)。该分型纳入病例全部来源于东亚人群，证明了在东亚人群中LAR亚型的占比较高，PIK3CA基因的突变频率也较高，从而更好地显示出中国三阴性乳腺癌患者的基因表型特征。然而由于三阴性乳腺癌的内部异质性高，其基因表型并不稳定，基于基因表达谱的分子分型无法对TNBC进行系统全面的描述，因此仍需研究者们从更多维度，包括代谢组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组等，对三阴性乳腺癌进行更加准确的分型。

1.2 三阴性乳腺癌耐药机制的研究进展

虽然三阴性乳腺癌在早期诊断和治疗方面已取得了较大进展，但许多患者在用药过程中逐渐出现了耐药性，这大大限制了三阴性乳腺癌的治疗效果。目前，在三阴性乳腺癌中已经发现了7种耐药机制^[12]，包括：(1) ABC转运蛋白将各种化疗药物泵出肿瘤细胞，其中多重耐药蛋白-1 (multidrug-resistant protein-1, MRP1)能产生对长春花生物碱、蒽环类和大剂量甲氨蝶呤等药物的耐药性，乳腺癌抗性蛋白(ABCG2)使得多柔比星等药物外流；(2) β-微管蛋白Ⅲ亚群的过表达导致紫杉醇抗性；(3) DNA修复酶的突变诱导细胞对表柔比星、多柔比星和米托蒽醌耐药；(4) p53、bcl-2、bcl-x的改变与环磷酰胺、多柔比星、甲氨蝶呤等药物的耐药性相关，这类细胞凋亡相关基因的变化大大减弱了化疗药物引起的细胞凋亡；(5) 谷胱甘肽/谷胱甘肽-s-转移酶(glutathione s-transferase, GST)和醛脱氢酶1A1 (aldehyde dehydrogenas 1A1, ALDH1A1)调节化疗药物在人体内的分解，其中GST的活性增加可加快对顺铂等药物的分解，ALDH1A1的过表达会减弱环磷酰胺的活性；(6) 核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路诱导细胞耐药，激活的NF-κB通路被抑制会产生紫杉醇耐药；(7) 人驱动蛋白家族成员14 (kinesin family member 14, KIF14)介导的AKT磷酸化促进对多西他赛的显著耐药性。另外，由于不同含氧量的环境会直接改变肿瘤细胞增殖的环境酸碱度，而酸性环境会降低化疗药物疗效，因此，低氧环境会加速肿瘤细胞衰老，进而促使细胞耐药，是影响TNBC化疗效果的一个关键微环境因素^[13]。

1.3 三阴性乳腺癌转移机制的研究进展

与其他乳腺癌亚型相比，三阴性乳腺癌的癌细胞具有高度的异质性，并且可以通过上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程使得肿瘤发生转移扩散^[14]。EMT是指肿瘤干细胞由静息状态变为迁移状态，随血流向远处迁移的过程。当肿瘤干细胞迁移至新的位置后，经过“间充质-上皮转化”这一逆向过程使得新定殖的细胞恢复上皮特征，并启动新的肿瘤生长^[15]。三阴性乳腺癌细胞无论在分子还是功能上都表现出肿瘤干细胞的特征，这可能是导致三阴性乳腺癌患者预后差的诸多因素之一。三阴性乳腺癌的远处转移风险较高，这不仅严重威胁到TNBC患者的生存预后，而且其转移机制复杂，涵盖肿瘤发生、发展的方方面面，包括微环境改变、肿瘤血管生成、癌细胞迁移、免疫系统逃逸和异质性改变等，因此TNBC的转移机制亟待进一步研究。

1.4 三阴性乳腺癌治疗靶点的研究进展

三阴性乳腺癌的临床治疗仍以蒽环类药物为主，如紫杉醇类化疗药物与蒽环类药物联用，则效果更佳，但总体而言，化疗敏感性较低。随着临床对三阴性乳腺癌研究的不断深入，针对TNBC的靶向药物研究及临床试验也陆续开展(表 1)。雄激素受体抑制剂、PI3K/蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian/mechanistic targets of rapamycin, mTOR)抑制剂、血管生成抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶4/6 (cyclin dependent kinase 4/6, CDK4/6)抑制剂、多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制剂以及新型抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates, ADC)等相关研究成果相继发表，为三阴性乳腺癌治疗手段的进步奠定了基础。

Gucalp等^[16]在Ⅱ期临床研究中共纳入51例雄激素受体阳性、ER/PR阴性的晚期乳腺癌患者使用雄激素受体抑制剂比卡鲁胺，结果显示患者耐受性良好，比卡鲁胺治疗后6个月的临床获益率(clinical benefit rate, CBR)为19%，中位无进展生存期(progression-free survival, PFS)为12周。Lehmann等^[17]发现PIK3CA抑制剂可以抑制PI3K活性增加的肿瘤发展，抑制雄激素的表达可以绕过PTEN途径抑制肿瘤细胞生长和增殖能力，使用PI3K抑制剂联合雄激素受体拮抗剂治疗可以加速AR阳性的TNBC细胞凋亡。尽管目前靶向药物的临床试验大多是针对整个TNBC群体，对药物疗效的探究仍有待深入开展，但靶向治疗仍可能是短期内最有希望提高三阴性乳腺癌患者生存预后的重要手段，值得期待。

几十年来，研究人员通过对基因组学的相关研究发现了多种在癌症中存在的基因突变，这些突变在肿瘤的发生发展中至关重要，指导了精准治疗方案的设计。这种针对每位TNBC患者的个性化疗法比传统化疗更有效，也是近年来三阴性乳腺癌治疗取得较大进展的主要原因。对于三阴性乳腺癌的靶向治疗，虽然已有许多相关通路的报道，然而，到目前为止还未出现有说服力的Ⅲ期临床试验数据的支持，因此三阴性乳腺癌的靶向治疗仍然在探索的路上。

只有对TNBC的发病机制不断深入了解，才有可能探索更为有效、精准的治疗策略。在肿瘤发生发展过程中，失调的蛋白激酶介导的磷酸化信号通路发生异常，激酶活性的异常改变在经过一系列激酶级联放大反应后，会导致多条癌症相关信号通路激活或相应抑癌信号通路失活。因此，磷酸化蛋白质组学技术可用于识别TNBC中异常激活的信号通路，从而探究TNBC肿瘤进展中的潜在分子机制和治疗靶点。

2 磷酸化蛋白质组学研究进展

蛋白质磷酸化是最常见的蛋白质翻译后修饰之一，可调节蛋白质的活性以及众多细胞生命过程中的蛋白质-蛋白质相互作用^[18]。随着特定磷酸多肽富集技术和高灵敏度质谱仪的发展，磷酸化蛋白质组学技术日趋成熟，对该技术步骤进行优化与改进的相关报道逐渐增多，包括样品制备、多肽富集、质谱(mass spectrometry, MS)检测及数据分析等多个步骤。

2.1 磷酸化蛋白质组学样品制备研究进展

在蛋白质组学研究中，样品制备是其中至关重要且易被忽视的步骤。特别是在磷酸化蛋白质组学中，是否有效地进行样品制备会直接影响最终检测结果^[19]。提取蛋白质后，通常使用胰蛋白酶对蛋白质进行水解，胰蛋白酶切割特异性高，可切割赖氨酸和精氨酸的羧基末端肽，使得肽段末端带上碱性氨基酸，可对磷酸化多肽特异性富集后进行质谱检测^[20]。因此，蛋白质的不完全消化和非特异性水解可能导致蛋白质丰度被低估，不仅影响单个蛋白质的定量，还会影响整个研究的准确性和重现性^[21]。

Dickhut等^[19]研究发现，蛋白质磷酸化会影响蛋白质水解消化，与未修饰的肽段相比，只有不到10%的磷酸化肽段可被胰蛋白酶切割，这种磷酸化序列对胰蛋白酶切割的抗性可能是由于精氨酸或赖氨酸与磷酸氨基酸的潜在静电相互作用导致胰蛋白酶切割位点的可及性受损，但增加胰酶浓度可提高酶切效率。Huesgen等^[22]研究发现，赖氨酸精氨酸N端蛋白酶(LysargiNase)与胰蛋白酶(trypsin)相比，可将磷酸化位点的覆盖率提高23%。由于LysargiNase可切割赖氨酸和精氨酸的N端，在质谱离子碎裂中，可产生以b离子为主的碎片离子，而trypsin酶切肽段主要产生以y离子为主的碎片离子，因此LysargiNase能鉴定到一些无法被trypsin鉴定到的位点，二者可互为补充^[23]。胰蛋白酶替代酶的开发可大幅提升蛋白质翻译后修饰的研究水平，优化蛋白质样品制备技术将成为未来磷酸化蛋白质组学的重要研究内容。

2.2 磷酸化蛋白质组学多肽富集研究进展

人类基因组编码的19 700余种蛋白质中超过2/3会被磷酸化^[24]。尽管磷酸化蛋白的数目相对较多，但磷酸化蛋白在细胞内的化学计量值和丰度较低^[25-26]，难以在复杂样本中被质谱技术检测到。大量非磷酸化蛋白的存在对识别磷酸化蛋白造成了巨大挑战，因此需要发展特异性的富集方法进行样品前处理，以提高磷酸化肽段含量。目前，磷酸化肽段的富集方法包括基于亲和色谱的固定化金属离子亲和色谱法(immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)和金属氧化物亲和色谱法(metal oxide affinity chromatography, MOAC)，抗体富集法^[27]以及强阳/阴离子交换色谱法(strong cation/anion exchange chromatography, SCX/SAX)^[28-29]。

IMAC通过带正电荷的金属阳离子与带负电荷的磷酸基团之间的亲和力富集磷酸化肽段，MOAC利用金属氧化物与磷酸基团之间的亲和力富集磷酸化肽段，这两种方法的富集特异性较高，IMAC主要富集多磷酸化肽段，MOAC主要富集单磷酸化肽段^[30]。Thingholm等^[31]研究发现，将IMAC与MOAC结合成IMAC顺序洗脱法(sequential elution from IMAC, SIMAC)可将磷酸化肽段富集效率提高到2倍。使用亲和色谱法可有效对丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段进行富集，但由于酪氨酸磷酸化肽段丰度较低，常规方法的富集能力非常有限。酪氨酸侧链上的芳香环使得其抗原决定簇比丝氨酸和苏氨酸的更大，因此磷酸化酪氨酸可与抗体产生更强的特异性结合。但一种抗体通常只能结合一种磷酸化氨基酸，且抗体成本较高，限制了其广泛使用。因此目前主要使用基于SH2 (Src homology)超亲体的微量样品的酪氨酸磷酸化蛋白质组技术对酪氨酸磷酸化肽段进行富集，但该方法还需要进一步优化^[32]。

SCX/SAX方法利用酶切肽段与阴/阳离子固定相之间的相互作用富集肽段。SCX法富集磷酸化肽段需在强酸条件下进行，而SAX法则在中性或碱性条件下进行，二者洗脱顺序相反。然而，SCX/SAX方法特异性并不高，现在通常作为多肽的预分离手段，将复杂样品初步分离得到较为相似的组分，可提高磷酸化肽段的富集效率和鉴定数目^[33]。总之，随着磷酸化肽段富集技术的不断发展，极大提高了磷酸化蛋白组学的研究效率，但目前尚无某种磷酸化富集方法能够完全描绘磷酸化蛋白组，为了提高对磷酸化肽段的鉴定效率，还需对富集方法进行深入探索。

2.3 磷酸化蛋白质组学定量检测研究进展

研究蛋白质组学的目的是对生物系统中的所有蛋白质进行全面鉴定和定量，以揭示蛋白质在生理和病理过程中的作用。在过去的几十年里，液相色谱-质谱(liquid chromatography mass spectrometry, LC‐MS)的发展推动了基于质谱的蛋白质组定量方法的巨大进步。基于LC-MS的蛋白质组学中最广泛使用的策略是自下而上的蛋白质组学^[34]，即蛋白质首先被水解成多肽，使用反相高效液相色谱(reversed‐phase high‐ erformance liquid chromatography, RP-HPLC)分离多肽，再对肽段进行分析。MS1水平上可以确定多肽的分子量，而相应的碎片离子是经碰撞池中破碎后在MS2水平上获得的。人们通过将MS1中测定的母离子和MS2中的碎片离子与相应蛋白质序列酶切产生的理论质量进行匹配，可以鉴定出样品中的肽，并利用这些信息将肽分配给相应的蛋白质，从而实现对它们的定性和定量。

准确量化动态变化的蛋白质组成是理解生物系统功能的基础。根据是否使用同位素标记，现有的基于质谱的蛋白质组定量方法可分为无标记蛋白质组学^[35-36]和标记的蛋白质组学^[37]。由于无标记方法不需要用同位素标记衍生化，可以在任何类型的质谱仪上实现，因此得到了广泛的应用，并取得了良好的效果^[38]。但无标记蛋白质组学每次LC-MS运行只能分析一个样品，且在精确度方面无法校正分析变异性，在通量方面有较大局限性。而同位素往往具有相同的理化性质、不同的质量，因此稳定同位素标记是一个更加理想的选择。1999年，Gygi等^[39]首次使用了同位素编码亲和标签(isotope-coded affinity tag, iCAT)，Oda等^[40]发现了¹⁵N代谢标记法。此后，又出现了细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labeling by amino acids, SILAC)^[41]、相对和绝对定量等重标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)^[42]、串联质量标记(tandem mass tags, TMT)^[43]和等重肽末端标记(isobaric peptide termini labeling, IPTL)^[44-45]等一系列多重定量方法。差异标记的多肽可以通过质谱进行解析，并且标记的样品在LC-MS之前就被混合在一起，因此可以实现多个样品的同时分析，避免了实验过程中样品损失和技术误差等引起的信号变化^[46]。

目前，SILAC、TMT和非标记定量技术(lable-free quantitation, LFQ)是基于MS的定量磷酸化蛋白质组学中最常用的技术。Mertins等^[47]将iTRAQ标记技术与磷酸化富集技术相结合对磷酸化肽段进行定量分析，该方法可以对多个条件下的样品进行比较分析，被用于磷酸化定量蛋白质组学分析。Zhang等^[48]比较了LFQ、SILAC、TMT技术在肿瘤组织中的磷酸化蛋白质组定量数据，发现TMT技术重复性和稳定性较好；SILAC技术的准确性和稳定性均较好，但对同位素试剂的依赖性限制了其应用范围；而LFQ技术可鉴定到最多的磷酸化肽段，但稳定性差。因此磷酸化蛋白质组学中定量方法的选择至关重要。数据分析时还需要利用蛋白质组的数据对磷酸化蛋白质组数据进行标准化，该方法可以帮助在确定位点磷酸化水平差异时不受本底蛋白质水平变化的影响^[49]。为了避免蛋白质水解消化过程中发生漏切等情况造成实验误差，最终还需要人工对定量结果进行核查^[50]。

2.4 磷酸化蛋白质组学质谱数据采集方法研究进展

目前蛋白质组和翻译后修饰分析最常见的策略是使用数据依赖性的采集方法(data-dependent acquisition, DDA)，但该方法偏向于检测高丰度多肽，有一定局限性，会导致数据缺失^[51]。为了解决这一问题，数据非依赖性的采集方法(data-independent acquisition, DIA)逐渐进入了人们的视野，这种采集方法能够系统客观地记录样本中理论上存在的所有多肽的片段信息^[52-53]。据报道，数据非依赖性采集同步累积连续碎裂的离子效率接近100%，可以实现在大规模蛋白质组研究中定量的一致性和准确性，提高蛋白质组数据挖掘的覆盖率和可重复性^[54]。但在传统的以多肽为中心的DIA中，谱图文库中只包含了一个最密集的片段峰子集用于特征提取，可能无法为确定磷酸化位点提供证据。将多种方法结合使用可提高检测效率，如Narumi等^[55]在基于磷酸化蛋白质组学的乳腺癌样本研究中，用DDA法进行了全蛋白质检测，并用靶向检测方法鉴定生物标志物。Bekker-Jensen等^[56]开发了一种算法来精确定位DIA数据集中的磷酸化位点，用于具有较小液相色谱梯度的DIA质谱。结合基于抗体的富集方法，在蛋白酶体抑制剂处理的细胞中约有35 000个不同修饰的多肽被重复识别和定量，与基于DDA的磷酸化蛋白质组学定量方法相比有巨大改进^[57]。

3 磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌研究中的应用

研究发现蛋白质组，特别是磷酸化蛋白质组与TNBC的发生、发展、侵袭和耐药密切相关，可以为TNBC的临床诊断、精准治疗提供新方向(图 1)。

3.1 磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌分型与诊断研究中的应用

2000年，Perou等^[58]首次提出乳腺癌分子分型，将乳腺癌分为正常乳腺样型、Luminal-like型、HER-2阳性型及Basal-like型。由于该分子分型是通过基因表达谱检测分出的乳腺癌亚型，临床诊断难度较高，因此目前临床上常用ER、PR、HER2和Ki67这4种标志物通过免疫组织化学方法进行病理学诊断。而由于TNBC具有高度异质性，需进一步细分，进而针对不同亚型进行个性化的精准治疗，才可能提高患者的生存质量^[59]。但遗憾的是尽管高通量基因组学研究已经揭示了三阴性乳腺癌存在的明显异质性，但尚未发现和其有高度相关的致癌基因。基于磷酸化蛋白质组学的研究是TNBC新型诊治技术研究的新希望。

Gong等^[60]通过对数据集进行蛋白质组网络分析和共表达网络分析，整合来自相同队列的基因组和转录组，发现了三阴性乳腺癌不同亚型的关键信号传导通路和主要调节因子，并根据全部蛋白质组和磷酸化蛋白质组将三阴性乳腺癌分为iP-1、iP-2、iP-3和iP-4共4种整合亚型。这4种不同的整合亚型具有各自不同的分子特征和信号传导通路特征。尽管磷酸化蛋白质组学技术日趋成熟，但经过临床验证的生物标志物数量依然很少，这可能是由于实验设计不合理或统计分析不当所致，因此研究过程中必须进行严格质控，以减小引入数据的变异性^[61]。

3.2 磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌耐药机制研究中的应用

研究表明大多数复发的三阴性乳腺癌患者会对化疗药物产生多药耐药性(multidrug resistance, MDR)^[62]。为了改善治疗效果，研究TNBC的耐药机制对开发新的治疗策略以预测和克服耐药性非常重要。Kohale等^[63]对发生化疗敏感(chemotherapy sensitive, CS)和耐药(chemotherapy resistant, CR)的三阴性乳腺癌患者PDX模型中酪氨酸磷酸化介导的信号网络进行了定量研究，揭示了药物的多种作用机制，发现丝氨酸家族激酶(Src family kinases, SFKs)抑制剂可以有效抑制肿瘤生长。Deng等^[64]通过比较对4种化疗药物具有极端反应的TNBC细胞系中磷酸化蛋白的变化来筛选失调的信号通路，发现细胞周期素依赖性激酶5 (cyclin-dependent kinase 5, CDK5)、早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein, PML)、激活蛋白-1 (activator protein 1, AP-1)和热休克因子1 (heat shock factor 1, HSF-1)等4种差异磷酸化蛋白，并证明这4种蛋白的磷酸化可能共同促进了耐药细胞的上皮-间质转化过程。Wang等^[65]发现白介素-6 (interleukin-6, IL-6)可通过激活TNBC细胞系MDA-MB-231中的信号传导和转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)来上调缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)的表达，从而增强了TNBC的耐药性。敲低HIF-1α后，凋亡相关分子B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)和BCL2关联X蛋白(BCL2-associated X protein, Bax)的表达以及P-gp和多药耐药关联蛋白1 (multidrug resistanec-associated protein-1, MRP1)的表达降低，从而减弱了肿瘤细胞的耐药性。Wang等^[66]发现，白介素-22 (interleukin-22, IL-22)可以活化JAK-STAT3/MAPK/AKT通路，进而诱导乳腺癌的迁移和耐药。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)介导的细胞活性中至关重要。其中，HGF的激活是肿瘤浸润的一个重要指标，可以增强细胞增殖和侵袭的能力；EGFR通过加速细胞周期G1/S期的转换促进TNBC细胞的多重耐药，也可能通过降低Thr654和Thr669位点的磷酸化水平增加EGFR和HGF的活性进而导致三阴性乳腺的耐药^[67-68]。通过对耐药机制的研究探索，可以针对产生耐药的各种分子及通路，改变肿瘤细胞生长的微环境，减轻耐药，增强疗效，这对三阴性乳腺癌患者的生存质量有重要意义。

3.3 磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌复发转移研究中的应用

目前磷酸化蛋白质组学技术已广泛应用于发现肿瘤中异常激活的信号通路及靶点，进而阐明肿瘤复发转移的分子机制。Zagorac等^[7]选择了治疗3年后复发和超过12年未复发的共34名三阴性乳腺癌患者的肿瘤样本进行磷酸化蛋白质组学检测，通过质谱联合体外实验验证，确定了6种与复发有较高相关性的激酶PRKCE、c-Kit、p-ERK (Thr202/Tyr204)、p-P70S6K (Thr389)、p-PNKP (Ser114/Thr118)和CDK6在TNBC复发患者中高表达，并在另一个样品队列得到了验证，提出了一个基于靶点的TNBC临床分类系统。通过检测这6种蛋白激酶的状态可以预测TNBC的演变，基于这6种激酶靶向药物单独或两两联合，有望推动TNBC临床治疗新型候选药物组合的深入研究。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)作为PI3K/Akt/mTOR信号通路中一个重要的调控基因，不仅可以通过促进细胞周期运行，抑制细胞凋亡促进肿瘤的进展，还可以通过上调基质金属蛋白酶-2 (matrix metal loproteinases-2，MMP-2)的表达水平，提升细胞外基质的分解能力，破坏血管基膜，进而促进肿瘤细胞的远处转移能力^[69]。

3.4 磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌治疗靶点研究中的应用

目前化疗仍是三阴性乳腺癌的主要治疗手段，尚无针对该亚型乳腺癌患者的靶向治疗。随着对磷酸化蛋白质组学的不断探究，已识别出与TNBC相关的磷酸化信号靶点，为有效提高TNBC患者生存率、改善生存质量提供了新的视角。PI3K/AKT/mTOR通路的异常是各种亚型乳腺癌中最常见的基因组异常之一^[70]。Umemura等^[71]研究发现在TNBC中p-AKT的表达水平较非三阴性乳腺癌显著升高，提示三阴性乳腺癌中Akt磷酸化被激活。Walsh等^[72]使用免疫组织化学方法，在89个三阴性乳腺癌患者和99个非三阴性乳腺癌患者中分别检测了mTOR和p-mTOR，结果显示p-mTOR在TNBC中的表达水平明显高于其他亚型乳腺癌，提示mTOR可能是治疗三阴性乳腺癌的新靶点。因此，抑制关键通路中的重要靶点可为三阴性乳腺癌患者带来新的治疗方案。

Rontogianni等^[73]运用磷酸化蛋白质组学报道了EGFR和ROCK两种抑制剂对三阴性乳腺癌细胞的双重作用可以增强其自噬作用导致癌细胞死亡，并通过Western blotting和荧光计数进一步验证了以上结论，为相关临床药物治疗提供了有力的理论依据。由于单一组学的表型并不稳定，因此需从多维度出发，对肿瘤进行包括转录组学、代谢组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学等在内的多组学分析，进而筛选肿瘤标志物及潜在治疗靶点。Gong等^[60]以蛋白质组学技术为中心对三阴性乳腺癌患者进行了多组学特征和整合网络分析，从86个肿瘤和70个配对非癌性邻近组织(non-cancerous adjacent tissues, NAT)的磷酸化蛋白质组分析中获得了4 194个蛋白质上的20 069个磷酸位点，最终发现脂肪酸代谢中的系列关键分子，如丝氨酸苏氨酸激酶AKT1和脂肪酸合成酶FASN是TNBC iP-2亚型的可能靶点。Chew等^[74]对18例三阴性乳腺癌和1例Luminal B型乳腺癌患者的PDX模型进行磷酸化蛋白质组学分析，发现有1/3的PDX模型表现出FGFR1、FGFR2或FGFR4的磷酸化增强，进一步利用多组学分析证实了两种抗FGFR药物的靶向作用。Lehmann等^[75]在基于基因组表达谱的分子分型基础上，对各分型三阴性乳腺癌进行了包括磷酸化蛋白质组学在内的多组学综合分析，确定了一种潜在的免疫逃逸机制，解释了针对PD1/PD-L1的免疫检查点抑制剂对大部分TNBC患者无效的原因。磷酸化蛋白质组学作为多组学研究中至关重要的一部分，现已成为筛选标志物和治疗靶点的新方法，将其运用于TNBC的研究越来越多。

4 总结与展望

在过去的几十年中，乳腺癌死亡率稳步下降，这主要归因于乳腺癌治疗方案的不断改善^[60]。但大部分治疗进展仅限于激素受体阳性和Her2阳性乳腺癌，三阴性乳腺癌仍然缺乏特定的靶向药物，化疗仍是目前唯一的治疗选择，然而当肿瘤对常规化疗出现耐药时会导致迅速复发甚至死亡，限制了TNBC患者的治疗效果。因此，筛选出药物敏感的新型生物标志物对于有效治疗三阴性乳腺癌至关重要。

目前，在肿瘤相关研究中磷酸化蛋白质组学的应用主要集中于治疗靶点的发现以及肿瘤分型和耐药机制。然而，磷酸化蛋白质组学在TNBC中的研究还处在起步阶段，目前只有少数的磷酸化蛋白被鉴定为TNBC的重要生物标志物，更多失调的磷酸化蛋白在TNBC中的作用及其在疾病发生发展中的机制尚不清楚。

由于满足磷酸化蛋白质组学研究的高质量人肿瘤样本较难获取，目前与三阴性乳腺癌相关的研究主要通过对细胞系或有限的组织样本进行比较研究来实现。在磷酸化蛋白质组研究方面，由于磷酸化蛋白的丰度和稳定性较低，提高其检测的覆盖率还面临较大挑战。随着蛋白质组学技术的成熟，样品制备技术的不断完善，磷酸化蛋白质组学技术运用于三阴性乳腺癌的研究会越来越多，并将成为筛选治疗靶点、预测疾病预后的新方法。