生物工程学报  2024, Vol. 40 Issue (2): 473-484 |
表1(Table 1) 表2(Table 2)
引用本文
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以腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)作为载体的基因治疗药物已经有多种上市，数千项临床项目正在进行中，说明AAV的市场价值巨大[1-3]。但是，AAV的生产成本极高，使得其药物价格高昂，给患者以及社会医疗体系带来了极大的负担[4]，目前已有包括zolgensma[5]、hemgenix[6]在内的多种药物定价超过200万美元/人份。
目前生产AAV的最主要方式是三质粒共转染哺乳动物细胞的形式[7]，但是生产符合《药品生产质量管理规范》(Good Manufacturing Practice of Medical Products, GMP) (https://www.samr.gov.cn/zw/zfxxgk/fdzdgknr/bgt/art/2023/art_d5e1dbaa8f284277a5f6c3e2fc840d00.html)规定的质粒成本极高，整个转染流程较为复杂且难度高，导致对操作人员的技术要求高，生产规模难以放大[8]。因此，AAV的工业化生产仍然面临着巨大挑战。
杆状病毒昆虫细胞表达系统具有表达量高、成本低以及易放大等优点，因此也被用于AAV的生产。不过，杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的过程是一个典型的病毒感染过程，随着感染时间的增加，昆虫细胞会因为被病毒感染而发生细胞凋亡[9]，也会引起蛋白的降解[10]。因此，在使用杆状病毒表达系统进行外源蛋白生产时，表达时间不适宜过长。目前，常用的杆状病毒表达载体进行了一些基因的缺失，包括chiA和v-cath等，上述缺失型杆状病毒表现出了更为稳定、高效的蛋白表达能力[11-12]。但是，更多基因的缺失还没有进行过试验，潜力有待验证。
本实验室前期进行了杆状病毒系列缺失株的构建和筛选工作，发现部分基因的组合缺失不会影响杆状病毒的包装和扩增能力，在感染阶段对细胞死亡的诱导作用明显减缓，并在外源蛋白表达上表现出了一定的优势[13-14]。基于上述研究基础，本研究选取实验室已建立的2个缺失型杆状病毒株Bac4.0-1及Bac5.0-2，使用双病毒感染路线进行AAV生产，以探索建立更为稳定、高效的AAV生产技术。
1 材料与方法 1.1 菌株及质粒所用的菌株为大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、含有野生型杆状病毒质粒的DH10Bac，为本实验室保有；含有多基因缺失型杆状病毒质粒的Bac4.0-1和Bac5.0-2，为本实验室构建保种；所用的质粒Bacmid、pFastBac1，为本实验室保有。草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf9细胞和HEK293T细胞来自实验室保种。AAV的cap基因、rep基因和带有反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)的重组AAV基因组来自金斯瑞公司合成并连接到pFastBac1质粒上。
1.2 主要试剂DNA聚合酶PrimeSTAR® Max DNA Polymerase购自宝日医生物技术(北京)有限公司。无缝克隆试剂盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司。DNA Marker Ⅲ和质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。卡那霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside, IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基β-d-吡喃半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-galactopyranoside, X-gal)购自Inalco公司。质粒大提试剂盒NucleoBondTM Xtra Midi购自MACHEREY-NAGEL公司。SF-SFM昆虫细胞培养基购自苏州沃美生物有限公司。DMEM培养基购自Gbico公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Biosera公司。转染试剂Cellfectin® Reagent Ⅱ购自Invitrogen公司。台盼蓝试剂购自Merck公司。Western及IP细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。抗AAV2 VP1/VP2/VP3多克隆抗体(DPAB2423)和抗AAV2 REP单克隆抗体(Clone A227.8) (DMAB6346)购自北京安必奇生物科技有限公司。过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)多克隆抗体和过氧化酶标记的山羊抗兔IgG (H+L)多克隆抗体购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。MonAmpTM SYBR® Green qPCR Mix购自莫纳生物科技有限公司。
1.3 仪器细胞培养箱购自上海剑革电子科技有限公司。荧光显微镜购自Motic公司。化学发光仪购自上海天能生命科学有限公司。qPCR仪购自杭州朗基科学仪器有限公司。电转仪购自伯乐生命医学产品公司。透射电镜(JEOL)为华东理工大学分析测试中心设备。
1.4 杆状病毒包装及扩增分别装载了AAV的包装元件cap基因、rep基因和带有ITR的重组AAV基因组的pFastBac1载体质粒上，按照Bac-to-Bac®系统操作手册进行转座反应制备重组杆状病毒质粒。经过蓝白斑筛选和测序验证后，得到带有AAV包装元件的重组杆状病毒质粒菌株，其中包含cap、rep基因的杆状病毒称为BacX-RC，包含ITR的重组基因组的杆状病毒称为BacX-ITR，X代表杆状病毒载体名称，包含野生型(wild type, WT)、Bac4.0-1和Bac5.0-2这3种。将测序正确的菌株保种，并使用质粒大提试剂盒提取杆状病毒质粒。
使用细胞存活率大于95%的悬浮培养的Sf9细胞，进行细胞铺板，在6孔板中按9×105 cells/孔进行接种，混合均匀后于27 ℃静置培养2 h。转染前先配制转染混合液，A液：向EP管中加入100 μL SF-SFM培养基和1 μg杆状病毒质粒DNA，轻轻混匀；B液：向EP管中加入100 μL SF-SFM培养基和6 μL Cellfectin® Ⅱ Reagent转染试剂，轻轻混匀；将A液和B液混匀，室温下孵育30 min后，加入800 μL培养基，混匀。吸出6孔板中的培养基，用SF-SFM培养基洗涤2次，加入转染混合液，27 ℃静置培养5 h，吸去转染混合液，加入完全培养基(含有2.5% FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的SF-SFM培养基)。27 ℃继续培养72 h，持续观察细胞状态，当Sf9细胞出现明显肿大，并且荧光显微镜下大部分细胞发出绿色荧光时，收获上清，获得的病毒为P1代重组病毒。
向新鲜铺板的Sf9细胞中加入100 μL P1代重组杆状病毒进行感染，27 ℃培养制备P2代重组病毒。P2代病毒进行Sf9细胞的再次感染获得P3代重组病毒。
1.5 TCID50法检测重组杆状病毒滴度对P3代杆状病毒进行滴度检测。Sf9细胞按照3×104 cells/孔的细胞密度铺至96孔板，27 ℃静置培养2 h；P3代重组病毒进行连续梯度稀释至10−11；吸去孔板内培养基，每孔中加入100 μL稀释好的病毒液，每个稀释梯度加入8个孔，一个稀释梯度3个平行，未加病毒液的细胞作为对照；感染后连续7 d观察孔内感染情况直至不再有新的孔内出现绿色荧光，记录有荧光的孔数，计算每个稀释度的阳性孔比率。本研究采用Karber法计算病毒滴度：lgTCID50=L−D(S−0.5)，式中L为最高稀释度的对数，D为稀释度对数之间的差，S为阳性孔比率总和。
病毒滴度通常使用PFU/mL表示，PFU (plaque forming unit)为空斑形成单位，TCID50与PFU换算关系为1个TCID50约等于0.7个PFU，由此可换算出PFU/mL表示的病毒滴度。
1.6 重组杆状病毒感染昆虫细胞的能力检测将收获的6种重组杆状病毒进行感染能力检测。选择细胞活力95%以上Sf9悬浮细胞，感染前按照细胞密度1.6×106 cells/mL进行接种。感染复数(multiplicity of infection, MOI)即感染时病毒和细胞的比例，按照MOI=1进行病毒感染，不同时间点取样进行细胞状态检测。使用台盼蓝染色法区分活细胞和死细胞，显微镜下进行计数，统计细胞存活率。对BacX-RC感染的样品，1 000×g离心5 min，细胞沉淀用2 mL的Western及IP细胞裂解液破碎，12 000×g离心10 min除去细胞碎片，上清进行Western blotting检测，测定VP蛋白和REP蛋白的表达水平。
1.7 双杆状病毒共感染包装AAV使用双杆状病毒共感染Sf9悬浮细胞进行AAV包装生产。选择细胞活力95%以上的连续传代细胞，感染前按照细胞密度1.6×106 cells/mL进行接种，使用250 mL摇瓶接种50 mL体积。将BacX-RC和BacX-ITR两种杆状病毒按照1:1的比例进行共感染，按照总MOI分别为0.01、0.1、1和5进行感染实验。在不同时间点收获细胞，将细胞破碎后离心，取上清进行Western blotting检测。
1.8 qPCR检测AAV基因组滴度AAV样品使用核酸酶进行游离核酸的消化。在50 μL反应体系中，核酸酶用量为0.1 U，37 ℃反应30 min后，70 ℃孵育30 min使核酸酶失活，95 ℃孵育5 min进行AAV衣壳的热裂解获得AAV基因组。
采用qPCR法，以AAV载体装载的mCherry作为靶基因进行AAV基因组滴度测定。按照说明书配制qPCR反应体系，使用已知浓度的pFastBac1-ITR质粒作为标准品，梯度稀释后进行qPCR反应。根据分子量和浓度算出qPCR反应体系中的分子个数为N，使用Ct值和lgN进行线性回归得到标准曲线。将待测样品的Ct值代入标准曲线，得到该样品所含的分子数，根据样品的稀释倍数进行换算，得到AAV病毒基因组的滴度。使用的引物见表 1。
| Primer name | Primer sequence (5′→3′) |
| MCHERRY-F | AAGGGCGAGGAAGATAACATG |
| MCHERRY-R | GCCCTCAATCTCAAATTCGTG |
使用生长状态较好的HEK293T细胞，在转染前1 d进行铺板，六孔板细胞量为2×105 cells/孔，感染前细胞汇合度约为50%，在感染时细胞密度较稀。将得到的病毒液进行梯度稀释，分别感染HEK293T细胞，统计不同稀释度荧光数量，根据稀释度计算出AAV的感染性滴度。对得到的AAV病毒液进行稀释，稀释至2×108 VG/mL，每孔加入1 mL的稀释AAV病毒液，感染6 h后更换为含有10% FBS的DMEM培养基，培养7 d后观察荧光情况。
1.10 透射电镜将待测AAV样品取10 μL滴加到铜网上，静置20 min，使样品沉降到铜网上，使用滤纸沿边缘吸去多余液体，滴加10 μL的1%磷钨酸溶液负染60 s，使用滤纸沿边缘吸去多余液体，将铜网放置于透射电镜下观察AAV形态，观测电压为80 kV。
1.11 数据分析数据以x±s表示，使用GraphPad Prism 8软件进行数据处理，两组间显著性分析比较采用t检验。
2 结果与分析 2.1 AAV生产用杆状病毒构建及包装本研究选取实验室已建立的2种多基因缺失型杆状病毒进行AAV生产体系建立。缺失了1−4区域的杆状病毒命名为Bac4.0-1，缺失1−5区域的杆状病毒命名为Bac5.0-2 (表 2)。将带有AAV的包装元件cap基因、rep基因和带有ITR的重组基因组的pFastBac1穿梭质粒上，分别转座至不同的杆状病毒质粒上，阳性单克隆进行质粒抽提，转染昆虫细胞制备重组杆状病毒，扩增收获P3代重组杆状病毒，分别是BacWT-RC、Bac4.0-1-RC、Bac5.0-2-RC、BacWT-ITR、Bac4.0-1-ITR和Bac5.0-2-ITR共6种，可用于AAV的生产(图 1A)。
| Region | Knockout genes | Complemented genes |
| 1 | Ac42−44 | − |
| 2 | Ac55−61 | − |
| 3 | Ac15−22 | Ac17−19 |
| 4 | Ac69−72 | Ac71 |
| 5 | Ac84−91 | Ac89−90 |
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| 图 1 AAV生产用杆状病毒的构建和包装 Fig. 1 Construction and packaging of baculovirus for AAV production. A: Schematic of AAV production process. B, C: Baculovirus titer assay results. D, E: Cell viability assay after baculovirus infection. F: VP protein expression detection. 1: BacWT-RC; 2: Bac4.0-1-RC; 3: Bac5.0-2-RC; M: Marker. G: Rep protein expression detection. 1: BacWT-RC; 2: Bac4.0-1-RC; 3: Bac5.0-2-RC; M: Marker. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001. |
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为探究多基因缺失对杆状病毒自身的复制和包装能力的影响，对P3代重组杆状病毒进行滴度检测。结果显示，BacWT-RC的滴度为3.18×108 PFU/mL，Bac4.0-1-RC的滴度为4.65×108 PFU/mL，Bac5.0-2-RC的滴度为4.34×108 PFU/mL，BacWT-ITR的滴度为2.98×108 PFU/mL，Bac4.0-1-ITR的滴度为2.34×108 PFU/mL，Bac5.0-2-ITR的滴度为2.64×108 PFU/mL，各重组杆状病毒的滴度没有显著性差异(图 1B、1C)。以上实验结果表明，Bac4.0-1和Bac5.0-2缺失型杆状病毒具有和野生型杆状病毒一样的复制和包装能力。
在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，缺失型杆状病毒可以减慢病毒感染导致的细胞死亡。通过检测病毒感染后不同时期的细胞状态，可以发现昆虫细胞感染病毒后会发生裂解死亡，使得细胞存活率不断降低。相比于昆虫细胞感染野生型杆状病毒的存活率，两种缺失型杆状病毒感染后的存活率在第2、3、4天均更高，但更长的感染时间会使得所有被感染的昆虫细胞存活率下降至10%左右(图 1D、1E)。杆状病毒表达系统表达外源蛋白时细胞存活率不能过低，一般存活率在50%左右收获外源蛋白，缺失型杆状病毒感染的细胞后存活率下降至50%经历的时间更长，可以延长外源蛋白的表达时间。因此，这两个多基因缺失型杆状病毒在AAV包装生产中可能会有更大优势。
分别收获BacWT-RC、Bac4.0-1-RC和Bac5.0-2-RC这3种病毒感染后的细胞进行破碎，检测上清中蛋白表达情况。结果显示3种重组病毒所装载的cap基因编码的VP1、VP2和VP3这3种衣壳蛋白均可以正常表达(图 1F)，rep基因编码的Rep78和Rep52蛋白也可以正常表达(图 1G)。
上述实验结果表明，两种多基因缺失型杆状病毒具有正常的病毒复制增殖能力，在感染过程中可以延缓宿主细胞的死亡，并且能够正常表达AAV包装所需的蛋白，将进一步进行生产条件优化。
2.2 AAV生产条件优化为了提高AAV的产量，首先需要对3种杆状病毒包装AAV的生产条件进行优化。分别按照总MOI=0.01、0.1、1和5进行感染，Bac-RC: Bac-ITR=1:1。并且分别在感染第1、2、3、4、5、6天后收获样品进行VP蛋白表达测试，优化生产条件。
对各蛋白印迹进行灰度分析，野生型杆状病毒感染第3天的样品作为对照组，各感染条件下的VP3蛋白条带灰度值除以对照样品进行标准化。从结果可以看出，在感染早期，随着MOI增加蛋白表达量增加，但随着感染时间的延长后蛋白表达量下降；野生型杆状病毒在感染后4 d左右即可达到表达量最大值，感染时间延长后表达量有所下降；多基因缺失型杆状病毒最大表达量出现在感染后第4天到第5天，并且表达量与野生型相比有一定提高(图 2)。以上结果表明，多基因缺失型杆状病毒能够延长表达时间进而提高表达效果；并且各杆状病毒载体进行VP3蛋白表达最优的生产条件分别是：Bac4.0-1按MOI=1感染，第4天收获；Bac5.0-2按MOI=1感染，第4天收获；BacWT按MOI=0.01感染，第4天收获。
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| 图 2 缺失型及野生型杆状病毒进行AAV生产条件优化 Fig. 2 Optimization of the deletion strain and wild type for AAV production conditions. A: VP protein expression was measured by WB under different conditions. Lane 1−4 are the results of Bac4.0-1 multiplicity of infection of 0.01, 0.1, 1, and 5; 5−8 are the results of Bac5.0-2 multiplicity of infection of 0.01, 0.1, 1, and 5; 9−12 are the results of BacWT multiplicity of infection of 0.01, 0.1, 1, and 5, respectively, m is the protein marker and c1 and c2 are the control at different concentrations. B: Gray density value scans were quantified by VP3 as a ratio to c2. |
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为探究多基因缺失型杆状病毒对AAV产量的影响，按照优化后的感染条件进行了AAV的生产，并且对AAV的基因组滴度和感染性滴度进行了检测。结果显示，以优化后的生产条件进行AAV的生产可以得到的基因组滴度为：野生型4.76×1010 VG/mL，Bac4.0-1缺失型1.63×1011 VG/mL，Bac5.0-2缺失型1.02×1011 VG/mL，两种多基因缺失型杆状病毒所生产的AAV基因组滴度较野生型提升了240%和110% (图 3A)。各杆状病毒载体所生产的AAV感染性滴度分别是：野生型6.77×107 TU/mL，Bac4.0-1缺失型2.50×108 TU/mL，Bac5.0-2缺失型1.44×108 TU/mL，两种多基因缺失型杆状病毒所生产的AAV感染性滴度较野生型提升了270%和110% (图 3B)。因此，多基因缺失型杆状病毒显著提高了AAV的产量，与WT相比，在AAV生产上具有明显优势。
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| 图 3 AAV生产能力检测 Fig. 3 AAV production capacity assay. Comparison of AAV viral genome titers (A) and AAV infectious titers (B) between multiple gene deleted strain and wild-type strain. *: P < 0.05; ***: P < 0.001; ****: P < 0.000 1; ns: Not significant (P > 0.05). |
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为了探究多基因缺失型杆状病毒对所生产的AAV质量的影响，用所得AAV按MOI=1 000进行HEK293T细胞转导实验，通过荧光强度测定，进行相对转导活性的比较。结果显示，多基因缺失型杆状病毒生产的AAV荧光表达强度与WT相近，AAV荧光表达强度均接近1，3种病毒生产的AAV活性无明显差异(图 4A)。荧光显微镜下观察被转导的细胞，可见明显红色荧光，并且表达水平相近(图 4B)。对不同杆状病毒生产的AAV进行基因组测序，均测得完整的重组AAV基因组，说明3种病毒均可包装出完整的AAV。使用透射电镜观察病毒粒子形态，发现3种病毒生产的AAV均可见实心球形病毒颗粒，形态无明显差别(图 4C)。以上结果表明，Bac4.0-1和Bac5.0-2两种多基因缺失型杆状病毒能够生产正常形态的AAV，并且质量与WT相近，可以应用于AAV的实际生产中。
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| 图 4 AAV质量检测 Fig. 4 AAV production capacity assay. A: Relative transduction efficiencies of AAV in multiple-gene deleted strain and wild-type strain. ns: Not significant (P > 0.05). B: Deletion strains and wild type for HEK293T cell transduction results, scale bar=40 μm. C: Virion morphology was observed at 200 000× magnification by transmission electron microscopy, the red dashed lines show the morphological outline of AAV, scale bar=50 nm. |
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近年来随着基因治疗领域的快速发展，AAV作为最主要的递送载体之一，有巨大的生产需求缺口，杆状病毒表达系统在规模化生产AAV上有一定优势，因此有越来越多的人开始使用杆状病毒感染昆虫细胞来进行AAV生产[15-17]。
重组AAV颗粒的组装需要同时具备ITR、cap、rep和辅助病毒4个部分。ITR部分为包装进AAV衣壳的重组基因组，两端为AAV的ITR序列，中间野生型AAV病毒基因组上的cap、rep基因被去除掉，替换为外源基因的表达盒，实现外源基因的递送。cap基因表达病毒的衣壳蛋白，rep基因表达病毒的非结构蛋白。辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和杆状病毒等提供辅助功能，本研究所使用的杆状病毒载体可以提供辅助功能，因此同时具备ITR、cap、rep即可进行AAV的组装。基于此，研究人员对杆状病毒表达系统进行了多次的优化，开发了三病毒、双病毒和单病毒等生产路线以及感染稳转昆虫细胞系的路线[18]。双病毒路线是较为常用的生产路线，一方面是减少了病毒的使用种类，使得单个细胞可以在更低的MOI下感染含有包装AAV所需的所有元件的杆状病毒，另一方面可以更加灵活调整各个元件的表达比例，使AAV的包装效果更好。
本研究使用多基因缺失型的杆状病毒载体，装载AAV包装所需要的元件，采用双病毒共感染昆虫细胞的方式进行AAV生产。多基因缺失的杆状病毒具有正常的病毒包装扩增能力，并且能够在感染过程中延缓宿主细胞的死亡，一定程度上延长了外源蛋白的表达时间。本研究中所使用的两种多基因缺失型病毒，缺失的基因均为非必需基因，并且已经证实了这些基因的缺失不会对杆状病毒的复制包装能力产生影响，宿主细胞死亡速率的延缓可能与这些基因有关，但是已有的研究尚未证实这些非必需基因的功能，这些基因如何影响病毒感染过程中细胞活性，还有待进一步研究。使用多基因缺失型以及野生型杆状病毒进行AAV优化生产，通过对AAV衣壳蛋白表达水平和AAV的滴度两方面指标的评价检测，多基因缺失型的杆状病毒都具有更好的表达效果，并且AAV的基因组滴度较WT可提升240%，具有一定的应用潜力。
目前杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的产量在1×1010−3×1011 VG/mL之间[19-20]，哺乳动物细胞中进行AAV生产比较高的产量在1×1011 VG/mL左右[21-23]，本研究建立的多基因缺失型杆状病毒共感染昆虫细胞的AAV生产体系的产量处于相对较高的水平。
关于杆状病毒基因组的优化，本研究只选择了前期测试结果较好的Bac4.0-1和Bac5.0-2两个版本，其他版本的测试结果与野生型相当或更低，因此未进行其他版本的AAV生产测试[13]。多基因缺失型杆状病毒的使用一定程度上提升了杆状病毒昆虫细胞表达系统的AAV生产效率，为解决当前基因治疗领域AAV病毒载体生产这一难题提供了参考。
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