α-1抗胰蛋白酶(α-1 antitrypsin, AAT)是一种由SERPINA1基因编码的重要蛋白酶抑制剂，它主要在肝脏细胞中合成，并迅速从肝脏分泌到血液中，然后传输到肺部。在肺部，AAT的主要功能是通过抑制肺中性粒细胞弹性蛋白酶的破坏作用，保护肺组织^[1-2]。AAT蛋白的全长由418个氨基酸组成，其中N端含有1个由24个氨基酸组成的信号肽序列，用于在蛋白合成时将其引导到正确的位置。该蛋白的抑制功能主要依赖于其C端的中心环松散结构域(central ring loose domain, RCL) (图 1)。在催化过程中，RCL会插入到蛋白酶活性中心，从而抑制其水解活性^[3]。

α-1抗胰蛋白酶缺乏症(α-1 antitrypsin deficiency, AATD)是由于SERPINA1基因的突变导致的遗传性疾病，这些突变会引起AAT蛋白的表达水平和功能改变，进而导致与肺部和肝脏相关的疾病。其中，AAT的Z型突变(ATZ)是AATD症状最为严重的一种突变类型。它涉及该蛋白质第342位点的谷氨酸-赖氨酸替代^[4]，这种变化会使AAT蛋白的结构改变，导致其在肝细胞内聚集^[4-6]。在肝脏细胞中突变体蛋白ATZ的聚集可能导致细胞的不可逆损伤，最终引发肝硬化，这也是AATD肝脏疾病的典型特征。

针对AATD的治疗策略之一是通过促进ATZ蛋白的细胞内降解来减轻病症。在ATZ降解过程中，细胞内的两个主要降解系统发挥重要作用：蛋白酶体和自噬溶酶体。一般认为蛋白酶体主要负责可溶性的ATZ蛋白的降解，而自噬溶酶体参与对不可溶的ATZ蛋白聚集体的清除。泛素化修饰是ATZ有效降解的先决条件，现已证明有多种泛素连接酶参与了ATZ的泛素化修饰和降解调控，其中包括E3泛素连接酶gp78^[7]和跨膜E3泛素连接酶SYVN1/HRD1^[8]。

STIP1同源性和U-Box结构蛋白1 (STIP1 homology and U-Box structural protein 1, STUB1)是一个高度保守的蛋白质，包含3个结构域：N端的3个TPR (triple tandem tetrapeptide repeat)结构域、高电荷中间线圈(coiled-coil)结构域和C末端的U-Box结构域(图 1)^[9]。已有实验证实STUB1具有E3泛素连接酶活性，并能催化多种蛋白质的泛素化修饰，包括内切酶微管相关蛋白Tau、自噬转录因子TFEB、信号转导和转录激活子SMAD3等，从而促进它们的降解，并影响多种细胞生物学过程^[10-14]。最近的研究表明，过量表达STUB1会显著降低ATZ蛋白水平，而降低STUB1则导致ATZ蛋白过量积累。这提示STUB1可能参与ATZ的泛素化修饰和蛋白质水平调控。然而，由于缺乏ATZ的体外表达和泛素化修饰体系的建立，目前尚不能确认STUB1是否直接参与以及如何催化ATZ的泛素化修饰。

本研究将编码ATZ和STUB1基因的片段克隆至原核表达质粒中，并将这些质粒转化至大肠杆菌中构建异源表达系统。通过优化IPTG浓度和温度，成功实现了蛋白的可溶性表达。随后，利用镍离子亲和层析技术纯化了得到高纯度的ATZ和STUB1蛋白样品。利用这些样品，构建了ATZ在STUB1协助下进行泛素化修饰的反应体系。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种和载体

大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、Escherichia coli strain BL21(DE3)、原核表达载体pET28a均为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

试剂：胰蛋白胨[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、酵母提取物[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、氯化钠(上海麦克林生化科技有限公司)、胶回收试剂盒[凯杰生物工程(深圳)有限公司]、α-1抗胰蛋白酶抗体(上海碧云天生物技术有限公司)、His tag抗体(上海碧云天生物技术有限公司)、泛素抗体(上海碧云天生物技术有限公司)、二抗羊抗兔[艾比玛特生物医药(上海)有限公司]、蛋白Marker (北京索莱宝科技有限公司)、考马斯亮蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司)、限制性内切酶[赛默飞世尔科技(中国)公司]、PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、质粒提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]、IPTG (上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、E1激活酶UBE1 (上海碧云天生物技术有限公司)、E2结合酶UBE2B (北京索莱宝科技有限公司)、DM5000 DNA Ladder (北京吉普赛生物技术有限公司)、ATP (北京索莱宝科技有限公司)、泛素(上海源叶生物科技有限公司)。

仪器：水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、PCR仪(艾本德股份公司)、水平脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、超净工作台(苏州泰安科技有限公司)、离心机(艾本德股份公司)、纯水仪[密理博(中国)有限公司]、37 ℃恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 质粒构建及转化

PCR扩增：分别设计ATZ和STUB1包含酶切位点的引物从表达载体上扩增ATZ和STUB1片段。设计上下游引物，见表 1。

质粒转化：构建pET28a-STUB1-His和pET28a-ATZ-His质粒，转化大肠杆菌E. coli DH5α菌株。将目的片段与载体按照5:1的比例混合，然后加入5 μL Gibson组装酶，混匀后在PCR仪中以50 ℃进行连接催化反应1 h。接着，取出感受态细胞并在冰上解冻，将连接产物全部转移到感受态细胞中，轻轻混匀。随后，在冰上孵育30 min，然后在42 ℃水浴中热激90 s，最后在冰上放置2 min。在超净工作台上，将500 μL不含氨苄青霉素的液体培养基加入感受态细胞中。将培养基置于摇床上，以37 ℃、220 r/min的转速复苏1 h。复苏后，3 000 r/min离心2 min，去除300 μL上清。将余下的液体混匀后，取60 μL均匀涂布在培养板上，然后静置片刻。将培养板倒置放入37 ℃恒温培养箱中，进行过夜培养，时长为15 h。第2天，挑选单个克隆菌落，将其放在摇床上，以37 ℃、220 r/min的速度培养。从每个管中取出2 μL菌液进行PCR鉴定。将PCR产物与核酸上样缓冲液混合后进行电泳鉴定，最后挑选连接成功的菌株，送样进行测序。

1.2.2 蛋白表达与纯化

准备1 L摇瓶洗净备用，每瓶中加入400 mL培养基高温灭菌。取40 μL菌液放入50 mL离心管加卡那霉素(kanamycin)培养基10 mL过夜摇菌16 h。次日加4 mL菌液到400 mL含有卡那霉素培养基中，混匀。37 ℃、220 r/min摇床上孵育2.5 h。此时菌液浑浊，往摇瓶中加0.6 mmol/L IPTG诱导蛋白表达，16 ℃、220 r/min过夜培养12−16 h离心收集菌体并超声破碎。细胞裂解液用His-tag亲和纯化方法纯化上清，用低浓度咪唑缓冲液清除杂蛋白，高浓度500 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。分别取20 μL过柱前上清、过柱后上清与纯化浓缩后的目的蛋白进行SDS-PAGE分析，鉴定目的蛋白的纯化情况。

1.2.3 考马斯亮蓝染色

电泳结束后将蛋白胶取出放入容器中，加入50 mL双蒸水/去离子水高温加热3 min至沸腾停止，弃去水溶液。倒去废液，加入配制好的25 mL快速工作染色液混匀，高温加热至沸腾状态30−60 s。停止加热后继续在脱色摇床上摇动5−10 min，弃去染色液，此时蛋白条带可见。加入50 mL双蒸水进行脱色，高温加热至沸腾状态30−60 s。倒去废液，重新加入ddH₂O洗脱煮沸，如条带不清晰可多洗脱几次。继续在脱色摇床上摇动5−10 min，换水即可完成脱色。取出蛋白胶置于干净白色底盘观察条带并拍照。

1.2.4 蛋白质Western blotting分析

将蛋白样品和分子量标记物加入8%或12% SDS聚丙烯酰胺凝胶的孔中，使用80 V电泳分离胶30 min，然后使用120 V电泳浓缩胶70 min。接着，将蛋白胶转移到经甲醇激活的PVDF膜上，使用200 mA电泳转膜120 min。5%脱脂奶粉封闭膜，封闭时间为2 h。加入不同的一抗抗体后，将其在4 ℃孵育过夜，然后使用TBST缓冲液洗脱3次，每次10 min。加入二抗抗体后，在室温下孵育1 h，二抗均按1:5 000稀释比例稀释。然后，使用TBST洗脱液洗脱3次，每次10 min。滴加显影液后，使用化学发光成像仪显影，并使用ImageJ软件对图像进行灰度分析。

1.2.5 质谱分析

从SDS-PAGE凝胶中切下目的条带，放入1.5 mL离心管中。加入10 mmol/L DTT在97 ℃下还原10 min，加入40 mmol/L 2-氯乙酰胺室温下烷基化半胱氨酸上的巯基，反应30 min，后加入乙腈真空干燥20 min。丢弃上清液，加入适量30 ng/L胰蛋白酶消化蛋白，再补加碳酸氢盐缓冲液37 ℃过夜孵育。消化后的肽段加入0.1% (FA)溶液，超声10 min，真空浓缩样品。移动A相含0.1% (体积分数)甲酸和水，流动相B含0.1% (体积分数)甲酸和100%乙腈，流动相B以5%−95%梯度分离多肽，30 min内肽在色谱柱(75 µm×25 cm，1.9 µm C18-AQparticles)上以350 nL/min的流速分离。质谱仪在DDA-PASEF模式下工作。利用MaxQuant v1.6.2.0软件对质谱数据进行处理，并将质谱结果与目的蛋白的理论氨基酸序列进行比较。

1.2.6 体外泛素化试验

反应在50 μL混合物中进行，其中含有2 μg His标记的STUB1和2 μg的ATZ蛋白、50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、2.5 mmol/L MgCl₂、10 mmol/L DTT、5 mmol/L ATP、10 mg泛素、500 ng激活酶UBE1和200 ng结合酶UBE2B。反应在37 ℃下进行2 h，之后取出样品进行蛋白质印迹分析。

2 结果与分析 2.1 pET28a-ATZ-His和pET28a-STUB1-His重组质粒的构建

获得高纯度ATZ和STUB1蛋白是实现ATZ的蛋白体外泛素化体系的前提条件。为了获得ATZ的重组表达质粒，首先以前期工作构建的ATZ表达载体(未发表工作)为模板，使用特异性引物(表 1)进行PCR扩增以获得相应的DNA片段。扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，发现条带大小在1 500 bp左右(图 2A泳道1)，与ATZ序列理论分子量1 257 bp大小相符合，表明扩增的条带为目的基因条带。同样以STUB1的cDNA为模板进行PCR扩增获得其DNA片段(909 bp) (图 2A泳道2)。将以上DNA片段克隆连接到pET28a载体上构成重组质粒pET28a-ATZ-His和pET28a-STUB1-His (图 2B‒2D)，并经过DNA测序验证其正确性。

2.2 ATZ蛋白诱导与表达条件的摸索

将重组蛋白表达质粒pET28a-ATZ-His转化进入E. coli BL21(DE3)细胞中。通过调整诱导条件，发现在当温度为16 ℃、IPTG浓度为0.6 mmol/L时，能够获得目的蛋白ATZ-His的最大可溶性表达。对比诱导前后细胞裂解物中的蛋白成分，发现添加IPTG能够诱导产生分子量约为50 kDa的蛋白(图 3A)。值得注意的是，在细胞裂解物的不可溶性组分中也发现了相应的蛋白条带，表明该蛋白表达后部分可形成包涵体(图 3B)，这可能与ATZ蛋白本身易于聚集的构象特征相关^[4-6]。通过对细胞裂解物上清组分使用His-tag抗体进行免疫印迹实验分析，同样在分子量约为50 kDa的位置发现了一个特异性条带，此结果进一步证实了重组蛋白ATZ-His的表达成功(图 3C)。

2.3 突变体蛋白ATZ的纯化与鉴定

根据上述最佳诱导条件，扩大ATZ蛋白表达体系的培养与诱导，随后对诱导后产生的可溶性细胞裂解物进行了镍离子柱亲和层析纯化。对纯化过程中所有蛋白质样品进行SDS-PAGE分析，成功地获得了分子量约为50 kDa的目标蛋白，与重组蛋白ATZ-His的理论分子量47 kDa相吻合(图 4A)。为了确认纯化所得的蛋白是ATZ，切取目标蛋白条带，将蛋白消化成小肽，并进行质谱检测分析。质谱检测的结果显示，包括“YHSEAFTVNFGDTEEAKK”和“DTEEEDFHV DQVTTVK” (图 4B)多个氨基酸肽段与ATZ-His蛋白的序列完全匹配(图 4C)。这一结果证明重组蛋白ATZ-His的成功纯化。

2.4 E3泛素连接酶STUB1蛋白的表达、纯化与鉴定

采用如前所述的诱导条件，对STUB1蛋白进行了大规模的表达和纯化。在纯化过程中，对所有样品进行了SDS-PAGE分析，并进行了考马斯亮蓝染色。结果显示，经过纯化后的蛋白质样品成分单一，其蛋白质分子量约为35 kDa，这与重组蛋白STUB1-His的理论分子量35.4 kDa基本一致(图 5A)。将纯化后的蛋白样品切胶回收并结合胰蛋白酶消化之后进行蛋白质谱分析，在样品中检测到包括HDKYMADMDELFSQVDEK和VGHFDPVTR (图 5C)等在内的多个短肽片段，这些短肽的氨基酸序列与STUB1蛋白的部分氨基酸序列完全吻合，由此可以证实STUB1的蛋白表达与纯化取得成功。

2.5 ATZ泛素化修饰体系的建立

前期的研究工作已经证明细胞内STUB1影响ATZ蛋白的泛素化修饰过程，并促进其随后的降解。作为一种E3连接酶，理论上STUB1具有直接催化ATZ泛素化修饰的能力。蛋白质泛素化修饰是一个复杂的过程，涉及E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶在消耗ATP的条件下将泛素分子添加到蛋白质分子上。为了验证STUB1是否直接催化ATZ的泛素化修饰，将泛素、ATP、E1泛素激活酶UBE1、E2泛素结合酶UBE2B以及STUB1与底物蛋白ATZ混合加入到一个50 μL的反应体系中。37 ℃反应2 h后，取出反应后的样品进行蛋白质印迹检测。结果显示，在ATP、泛素激活酶E1和泛素结合酶E2的共同作用下，ATZ发生了泛素化修饰，因为通过蛋白质印迹可以检测到ATZ蛋白分子量的增加，而这正是由于蛋白发生泛素化修饰所引起的(图 6A泳道2，图 6B泳道3)。此外，体外实验也证实，ATZ的泛素化过程依赖于STUB1和泛素相关蛋白的共同作用，因为无论是单独添加E1和E2 (图 6A泳道1)还是单独添加STUB1 (图 6B泳道2)都无法实现ATZ的泛素化修饰。

3 讨论与结论

α-1抗胰蛋白酶的Z型突变不仅导致AAT功能丧失和合成水平下降，从而引发肺炎和呼吸障碍等肺部疾病，同时，ATZ蛋白的聚集还会导致肝脏细胞死亡，从而引发肝炎、肝硬化甚至肝癌等致命疾病。在针对AATD的肺部疾病方面，临床上已经开发了一些可行的治疗手段，例如通过静脉注射向患者体内补充正常的活性AAT蛋白^{[3, 15]}。然而，这种方法并不适用于由ATZ蛋白聚集引起的肝脏损伤。迄今为止，除了肝脏移植等外科手术方法，尚无有效治疗AATD相关肝病的方法。考虑到ATZ聚集体在AATD肝病的发病机制中的重要作用，减少折叠错误的ATZ合成或提高其溶解度可能是延缓聚集进展、减轻肝损伤的可行策略。因此全球范围内不同的课题组尝试了不同的策略，包括抑制突变体的合成、增加功能活性AAT的分泌、阻断聚合形成，以及诱导蛋白质聚集体的降解^{[6, 16-17]}。

显然，促进ATZ快速降解是治疗AATD的有效策略之一。蛋白酶体降解通路是真核细胞内负责蛋白质降解调控的主要通路，而泛素化修饰是蛋白质快速降解的前提。在泛素化过程中，泛素分子会在一系列的泛素修饰相关酶(E1、E2、E3)的加成作用下被共价地结合到目标蛋白分子上^[18]。在哺乳动物细胞中，泛素E1和E2种类有限，而E3连接酶却有400多种，这些不同的E3连接酶具有不同的底物偏好性，负责对不同类型的蛋白的泛素化修饰并促进其降解。因此，确认目标蛋白与其相互作用的E3连接酶是研究其蛋白降解机理的关键。

大量证据表明，在ATZ的降解过程中，多个E3连接酶参与了其泛素化修饰。早在2006年，Shen等^[7]发现E3连接酶gp78促进了ATZ的泛素化修饰和降解。随后，Feng等和Wang等又发现E3连接酶HRD1参与诱导ATZ的泛素化修饰和自噬依赖性的降解^{[8, 19-20]}。最近，本课题组发现STUB1具有促进ATZ的泛素化修饰的能力，因此，它也成为第三个能够调控ATZ降解的E3连接酶。这一发现进一步展示了ATZ在胞内降解调控方面的复杂性。

值得强调的是，目前有关ATZ的泛素化修饰证据都是基于对细胞内表达ATZ的实验得出的。由于细胞内存在众多蛋白质，且其相互作用极为复杂，这给对ATZ的泛素修饰过程进行精细解析的研究带来了一定的挑战。就STUB1而言，在细胞内，STUB1本身拥有双重功能，既是分子伴侣又是E3泛素连接酶^[12-13]，因此其底物范围非常广泛。已有实验证据表明被STUB1催化的底物有很多种，还有数据显示许多其他潜在底物尚未被鉴定出来^[10-12]。本研究前期通过细胞内过表达或降低STUB1蛋白质水平的实验，证实STUB1参与了ATZ泛素化修饰的催化过程。然而，由于复杂的胞内环境，这些实验无法排除STUB1通过催化其他分子间接影响ATZ泛素修饰的可能性。因此，有必要利用纯化的蛋白质来构建体外的泛素化修饰体系。本研究使用纯化的ATZ蛋白和泛素修饰相关蛋白，在体外建立泛素化修饰反应体系。在这个体外体系中，只包含少数几种成分明确的蛋白，如泛素激活酶E1、泛素转移酶E2和泛素连接酶STUB1。因此，当在反应体系中观察到ATZ的泛素化修饰结果时，可以明确这一催化过程是由STUB1介导的，从而进一步证明了STUB1直接作用于ATZ并催化其修饰的事实。

综上所述，本研究成功地验证了在体外研究ATZ泛素化修饰的可行性，并确认了STUB1催化ATZ泛素化修饰的潜力。推测这一体外催化系统还可以被扩展应用于研究包括gp78和HRD1在内的其他E3泛素连接酶，为进一步解析ATZ蛋白的降解调控机制提供有力支持。

致谢: 感谢中国科学院天津工业生物技术研究所曹琦琛和韩曼曼在质谱分析过程中的帮助。