2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 刘玉, 李帆, 戴蕙芸, 周润龙, 王梦怡, 甘世豪, 徐瑶
- LIU Yu, LI Fan, DAI Huiyun, ZHOU Runlong, WANG Mengyi, GAN Shihao, XU Yao
- 定点突变优化信号肽对嵌合抗原受体T细胞功能的影响
- Effect of signal peptide optimized by site-directed mutagenesis on the function of chimeric antigen receptor T cells
- 生物工程学报, 2024, 40(2): 573-584
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(2): 573-584
- 10.13345/j.cjb.230506
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文章历史
- Received: July 13, 2023
- Accepted: November 20, 2023
引用本文
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2. 武汉波睿达生物科技有限公司, 湖北 武汉 430075
2. Wuhan Bio-Raid Biotechnology Co., Ltd., Wuhan 430075, Hubei, China
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)免疫治疗技术是一种新型的肿瘤精准靶向疗法，近年来，国内外陆续上市的CAR-T细胞产品在血液肿瘤领域取得了显著疗效。CAR-T技术是指利用基因工程技术，在T细胞内导入一个可以将嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)表达于其表面的融合基因，使T细胞具备肿瘤靶向能力，通过不断增殖并释放细胞因子、颗粒酶、穿孔素等，杀伤肿瘤细胞[1-2]。抗原(靶点)的选择一直是CAR-T领域的研究重点，如果仅仅有合适的抗原，缺乏共刺激信号，T细胞往往会未老先衰，起不到抗肿瘤的作用。在CAR-T的结构中，任何一个元件都起着关键作用。按照每个元件所处的位置，CAR主要分为3个功能区域，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域[3-4]。其中，负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(single-chain variable fragment, scFv)是CAR胞外结构域的重要组成部分，scFv的N端包含一段长度约25−30个氨基酸的信号肽序列(signal peptide, SP)，其对CAR基因的表达、分泌和膜定位至关重要[5]。因此，SP序列的优化是提高CAR-T细胞功能的重要手段。
科学家们通过对SP的结构研究发现，位于SP氮端(N)的正电荷氨基酸或疏水区域长度增加有利于新生肽段的跨膜转运，进而显著促进蛋白质的分泌水平[6]。Huang等研究表明，通过信号肽的氨基酸突变增加其疏水性，能够显著提高目标蛋白对转运通道的亲和力，可以取代双精氨酸基序(正电荷)，靶向下游通路发挥调节作用[7]。基于此，可以通过增加信号肽N端的正电荷数或疏水核心长度，提高信号肽介导的CAR在T细胞膜上的表达效率，进一步增强CAR-T的肿瘤杀伤活性。
靶向B细胞标志物CD19的CAR-T细胞的临床试验已显示出对多种血液系统恶性肿瘤的明显疗效，包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)[8-10]、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)[11-12]和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)[13-14]，但CAR-T治疗后复发依然是亟待解决的现实问题。本研究围绕CAR结构优化改造为切入点，利用定点突变技术，在野生型重组质粒SP-wtY-CD19-CAR的基础上，构建2种信号肽N端正电荷数增加的突变型质粒，研究SP结构优化对CAR在T细胞表面表达的影响，进一步揭示其对CAR-T细胞杀伤功能的调控作用。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 细胞株本研究使用的细胞系包括HEK293T、K562、NALM-6，均购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，稳定过表达CD19抗原的K562细胞系(K562-CD19)由武汉波睿达生物科技有限公司赠予所得，大肠杆菌感受态细胞(DH5α)购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.1.2 主要试剂慢病毒表达载体pTK-Kan由武汉波睿达生物科技有限公司惠赠，3个慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G均购自Addgene公司，质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒均购自Axygen公司，细胞培养相关试剂包括DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和胰酶(trypsin-EDTA, 0.25%)均购自Gibco公司，7-氨基放线菌素D (7-aminoactinomycin D, 7-AAD)试剂购自BD Bioscience公司，CD19蛋白抗原(PE-Labeled Human CD19 Protein)购自北京百普赛斯生物科技有限公司，钙黄绿素购自上海阿拉丁生化科技有限公司，人干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和干扰素-α (interferon-α, TNF-α) ELISA试剂盒(96-test)购于达科为生物科技有限公司。本研究所涉及的引物合成及测序均由武汉擎科生物科技有限公司完成。
1.2 信号肽序列定点突变位点的选择本研究选择的SP序列来自白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2) (human)，其野生型SP序列为：5′-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT-3′，对应的编码氨基酸序列为：MYRMQLL SCIALSLALVTNS[15]。为了增加信号肽N端的正电荷数，可在信号肽的N端引入带正电荷的保守序列。因此，本研究选择在信号肽N端的酪氨酸(Y)处进行突变，并选择带正电荷的极性氨基酸赖氨酸(K)或精氨酸(R)作为突变氨基酸。精氨酸(R)的核苷酸序列可以用AGG、AGA、CGU、CGC、CGA和CCG表示，而赖氨酸(K)对应的核苷酸序列为AAA和AAG。本研究最终选择了AAA和AGA作为突变序列，以完成赖氨酸(K)和精氨酸(R)的定点突变(表 1)。
| Type of signal petide | SP amino acid sequence |
| SP-wtY | MYRMQLLSCIALSLALVTNS |
| SP mutation 1 (SP-muK) | MKRMQLLSCIALSLALVTNS |
| SP mutation 2 (SP-muR) | MRRMQLLSCIALSLALVTNS |
| The bold and underlined letters showed the wild-type and mutated amino acids. | |
设计引物F-muK、F-muR分别为引入点突变的上游引物，CAR-R为共同下游引物。本实验室前期已成功构建含野生型SP的SP-wtY-CD19-CAR载体，本研究在此基础上，分别使用上游引物F-muK、F-muR和下游引物CAR-R (表 2)配对进行PCR扩增，获得了含有SP突变1 (SP-muK)和SP突变2 (SP-muR)的CD19-CAR片段，其带有相同的同源臂。选择BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性酶切识别位点作为克隆位点，利用同源重组技术将其克隆至慢病毒表达载体pTK-Kan上，转化后挑选单菌落进行菌落PCR、双酶切鉴定，同时进行测序，将测序正确的菌液保存，并通过质粒提取最终获得含有SP-muK和SP-muR的CD19-CAR片段的目的载体，即SP-muK-CD19-CAR和SP-muR-CD19-CAR，用于后续的慢病毒包装。
| Name of primer | Sequence (5′→3′) |
| F-muK | GGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGAAAAGGATGCAACTCCTGTCTTGC |
| F-muR | GGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGAGAAGGATGCAACTCCTGTCTTGC |
| CAR-R | GGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTTAGCGAGGGGGCAGGGCC |
K562细胞系、K562-CD19细胞系以及NALM-6细胞系均培养于含10% FBS的RPMI-1640培养基中，HEK293T细胞使用含10% FBS的DMEM培养基进行持续培养；关于原代T细胞的培养，本研究使用新鲜配制的TexMACSTM GMP培养基(包含1 000 U/mL IL2、1:1 000的比例稀释1 mol/L的HEPES和1:1 000稀释的谷氨酰胺)，在培养过程中，通过观察细胞状态及生长密度确定是否补充或替换新鲜培养基，使细胞密度维持在(2−3)×106 cells/mL之间，期间定时显微观察并拍照记录生长状态。以上所有细胞均置于细胞培养箱中持续培养，培养条件为37 ℃和5% CO2。
1.5 慢病毒包装、浓缩及活滴测定在充分考虑慢病毒包装效率及使用安全性的基础上，选择四质粒系统(第三代慢病毒包装系统)获取慢病毒原液。首先，将4个质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G和pTK-CD19-CAR以12:10:6:5的转染比例，通过聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)共转染至HEK293T细胞中，将转染后的细胞置于CO2细胞培养箱中继续培养72 h后，离心收集培养基上清，然后，采用超速离心法得到病毒浓缩液。慢病毒活滴测定采用梯度感染HEK293T细胞进行，首先按照5×105 cells/well的密度在6孔板中培养HEK293T细胞，待细胞生长至70%左右时，向孔板中分别加入0.5、1、2、5、10 µL的病毒浓缩液，同时加入终浓度为5 µg/mL的聚凝胺(polybrene)，病毒感染72 h后，利用CD19抗原试剂(PE-Labeled Human CD19 Protein)与感染后细胞共孵育，通过流式细胞术检测每组转染效率，从而计算病毒活滴数。本研究中每个病毒添加梯度设置2个平行重复，该实验重复3次。
1.6 通过慢病毒转导构建CD19-CAR-T细胞体外培养原代T细胞约16−24 h后，取少量细胞溶液检测细胞密度，根据实验研究所需细胞数量，使用移液器量取相应悬液铺于六孔板中，在病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI)为5的条件下，将带有CD19-CAR结构的病毒浓缩液缓慢加入细胞悬液中，同时加入polybrene使其最终浓度达到5 µg/mL，随后将六孔板置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，孵育4 h后，补充T细胞培养基，使CAR-T细胞密度处于1×106−3×106 cells/mL之间持续培养。
1.7 流式细胞术检测CD19-CAR-T细胞的转导效率采用流式细胞术检测CD19-CAR在T细胞表面的表达情况，慢病毒转导T细胞6 d后，取5×105个CAR-T细胞于流式管中。首先，向每管中加入1−2 mL的流式缓冲液(含PBS和FBS)，充分混匀后，300×g离心5 min，该步骤重复2次，去除上清液。然后，使用配置好的流式抗体(流式缓冲液溶解)溶液重悬细胞，并置于4 ℃避光孵育30 min，加入1−2 mL缓冲液终止反应，300×g离心5 min，去除上清，重复洗涤2次后，再加入2 µL的7-AAD抗体(1:100)以检测细胞活率，将细胞沉淀重悬于0.2 mL的流式缓冲液中，在3 h以内上机进行流式检测。
1.8 钙黄绿素释放法检测CD19-CAR-T细胞的体外杀伤功能钙黄绿素释放法是用来评估CAR-T细胞对肿瘤杀伤作用的重要研究方法。通过使用一种胞浆荧光标记物钙黄绿素AM (calcein-AM)，实现对肿瘤靶细胞的标记，然后通过与效应细胞共孵育进而检测荧光强度。本研究的效应细胞分别为3种CAR-T细胞(SP-wtY-CD19、SP-muR-CD19、SP-muK-CD19)，同时，选择CD19抗原高表达的NALM-6和K562-CD19 (CD19稳定过表达细胞系)为阳性靶细胞，而不表达CD19的K562细胞为阴性对照组。首先，将各组的靶细胞进行calcein-AM标记后，每孔加入密度为1×105 cells/mL的细胞100 µL于96孔细胞培养板中，然后，将CAR-T效应细胞以25:1、5:1和1:1的效靶比分别加入靶细胞中进行共孵育，其中，阳性对照组中直接加入细胞裂解液，阴性对照组中加入PBS，各组均设置4个复孔，在37 ℃细胞培养箱内孵育3 h后，将共孵育细胞置于荧光显微镜下观察钙黄绿素的释放情况，并拍照记录；随后将96孔板在常温下700×g离心10 min，仅收集每孔的上清液至新的96孔板中，在激发光波长485/20 nm、发射波长530/25 nm的参数条件下，采用酶标仪读取每组的荧光值。最终，CAR-T细胞的体外杀伤能力采用靶细胞损伤百分比表示，计算公式如下：肿瘤细胞杀伤比率(%)=(实验组荧光值−阴性对照组荧光值)/(最大释放组荧光值−阴性对照组荧光值)×100%，在本研究中每个分组设4个平行复孔，该实验重复3次。
1.9 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测CD19-CAR-T的细胞因子分泌水平IFN-γ和TNF-α是2个常用来评估CAR-T细胞潜在功能的重要指标。在本实验中，分别取5×103个阳性靶细胞NALM-6和阴性靶细胞K562接种于96孔板中，另设不加入靶细胞的孔为空白对照组，每孔添加体积均为100 µL。然后，按照效靶比为10:1的条件，在上述实验组及对照组中加入5×104个T细胞或3种不同信号肽的CD19-CAR-T细胞，每个样本做3个复孔，将96孔板置于37 ℃细胞培养箱中孵育24 h。然后，将96孔板在常温下700 g/min离心10 min，收集100 µL上清液，按ELISA试剂盒说明书操作检测上清液中干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和干扰素-α (interferon-α, TNF-α)的分泌水平，将实验操作后的孔板放入酶标仪中在450 nm波长处测量光密度值(optical density, OD)。此外，根据试剂盒的说明制作标准曲线，进而定量计算细胞因子的分泌水平。
1.10 数据分析本研究的数据统计及组间差异分析均采用GraphPad Prism 8.0.1软件完成，研究数据使用平均值±标准误(x±s)表示，组间的显著性分析采用Student’s t检验。*：P < 0.05或**：P < 0.01分别表示显著性或极显著性差异。
2 结果与分析 2.1 成功构建SP-muK-CD19-CAR和SP-muR-CD19-CAR重组质粒首先利用基因合成技术，成功获得含野生型SP片段的CAR序列，将其命名为SP-wtY-CD19-CAR，然后，利用设计的定点突变上游引物F-muK或F-muR，分别与下游引物CAR-R配对(表 2)，PCR扩增得到包含SP-muK或SP-muR的CD19-CAR片段(图 1A)，凝胶电泳结果显示扩增条带为1 593 bp，符合预期。根据过表达载体序列特征，利用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切技术，将慢病毒表达载体pTK-Kan切割为线性载体，结果如图 1B所示，双酶切显示线性载体片段大小为10 205 bp，与预期结果一致，对该片段进行胶回收备用。
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| 图 1 PCR及pTK-Kan载体双酶切结果和双酶切产物鉴定电泳结果 Fig. 1 Double digestion of the PCR products and pTK-Kan vector and the associated electrophoresis diagram. 1: Marker; 2−3: CD19-CAR PCR amplification fragments containing SP-muK and SP-muR, respectively; 4−5: pTK-Kan vector double enzyme fragment; 6−7: SP-muK-CD19-CAR and SP-muR-CD19-CAR recombinant lentiviral expression vectors were double digested to verify the bands. |
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将回收得到的SP-muK-CD19-CAR和SP-muR-CD19-CAR片段分别和线性载体进行同源重组、转化、菌落PCR及双酶切鉴定，同时进行测序验证，将正确的重组质粒中提后保存待用。双酶切鉴定结果如图 1C所示，由于CD19-CAR分子的重链VH序列中含有BamH Ⅰ酶切位点，因此，酶切后可见两条大小分别为1 052bp和541 bp的片段，与序列分析结果一致。此外，为了进一步确定重组载体的序列信息，本研究将2个重组载体SP-muK-CD19-CAR和SP-muR-CD19-CAR进行测序，结果如图 2A、2B所示，测序图谱无杂峰，插入序列完全符合设计，表明SP-muK-CD19-CAR和SP-muR-CD19-CAR重组质粒构建成功。
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| 图 2 突变位点测序分析图 Fig. 2 The sequencing diagram analyzing the mutation site. A: SP-muK sequencing analysis diagram. B: SP-muR sequencing analysis diagram. |
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采用四质粒系统成功包装慢病毒，然后通过设置不同的慢病毒体积梯度(0.2、0.5、1 µL)感染293T细胞，以确定病毒活性滴度。根据流式细胞术检测结果判断，选择病毒添加量为0.5 µL时计算SP-wtY、SP-muK和SP-muR的慢病毒滴度。如图 3A所示，3种慢病毒(SP-wtY、SP-muK、SP-muR)的转染效率分别为33.9%、35.5%、36.8%，定点突变组SP-muK [(3.6±0.10)× 108 TU/mL]和SP-muR [(3.8±0.13)×108 TU/mL]慢病毒的滴度显著高于野生型SP-wtY组[(3.2±0.14)×108 TU/mL] (图 3B，P < 0.05)。由此可见，3个慢病毒已成功包装，且2个信号肽突变组的活滴均显著高于未突变组。
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| 图 3 慢病毒制备及活滴检测 Fig. 3 Lentivirus production and titer detection. A: The CD19-CAR expression on HEK-293T cells transfected by three different lentivirus. B: Activity titers of three lentiviruses. *: P < 0.05. |
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分别使用含野生型和2种突变型信号肽序列的慢病毒感染T细胞后，通过流式细胞术检测CD19-CAR在T细胞表面的表达，即转导效率。结果显示，3组慢病毒(SP-wtY、SP-muK、SP-muR)感染的T细胞成功表达CD19-CAR的比例分别为(21.43±0.87)%、(26.03±1.00)%、(30.33±1.25)% (图 4A、4B)，且突变组极显著高于SP-wtY组(P < 0.01)。此外，还进一步分析了含3种信号肽的CD19-CAR在T细胞膜表面表达的平均荧光强度(图 4C)，结果显示，SP-muK-CD19和SP-muR-CD19在细胞表面的表达量极显著高于SP-wtY-CD19细胞组(P < 0.01)，说明信号肽经突变优化后能显著提高T细胞的转染效率，增强CD19-CAR基因表达。
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| 图 4 三种CD19-CAR分子在T细胞中的转染效率 Fig. 4 Transfection efficiency of three CD19-CAR molecules in T cells. A: Expression efficiency of CD19-CAR molecules in T cells of three different groups. B: The expression efficiency of CD19-CAR in T cells was detected by flow cytometry. C: Average fluorescence intensity of CD19-CAR expression with three different signal peptides on T cell membrane surface. **: P < 0.01. |
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为了体外评价CAR-T细胞的杀伤功能，通过流式细胞术检测候选靶细胞的CD19表达水平，结果如图 5A所示，K562-CD19细胞表面CD19的表达率为99.5%，且NALM-6细胞为99.3%，可作为杀伤实验的阳性靶细胞；然而，K562细胞的CD19阳性表达率仅为0.3%，可作为阴性靶细胞。
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| 图 5 三种CD19-CAR-T细胞对CD19阳性靶细胞的杀伤效应 Fig. 5 Killing effects of three kinds of CD19-CAR-T cells on CD19 positive target cells. A: The surface expression of CD19 in K562, K562-CD19, and NALM-6 cells was detected by flow cytometry. B: Fluorescence detection of three CD19-CAR-T cells on NALM-6 cell cytotoxicity. Scale bar: 100 μm. C: Detection of cytotoxicity of three CD19-CAR-T cells on K562, K562-CD19, and NALM-6 cells by calcein-AM release assay. *: P < 0.05, **: P < 0.01. |
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在效应细胞与靶细胞的比例分别为25:1、5:1、1:1的条件下进行钙黄绿素释放实验，结果显示，效靶比为25:1的3组细胞共孵育前后荧光成像结果显示，杀伤前细胞光滑圆润，杀伤后细胞破碎缩小，钙黄绿素从细胞中释放出来，且SP-muR-CD19组杀伤作用更强(图 5B)。此外，酶标仪量化结果显示(图 5C)，效靶比为25:1的CAR-T细胞杀伤效果最好，其中SP-muR-CD19组对K562-CD19肿瘤细胞的杀伤作用[(43.33±2.49)%]显著高于SP-muK-CD19 [(37.33±2.05)%]和SP-wtY-CD19 [(31.57±2.48)%]细胞(P < 0.05)。同样地，在NALM-6肿瘤细胞组，SP-muR-CD19细胞的杀伤作用[(29.29±1.11)%]依然显著高于SP-muK-CD19 [(25.06±1.00)%]和SP-wtY-CD19 [(20.53±1.71)%]细胞(P < 0.05)。且三者对CD19阴性肿瘤细胞K562无杀伤作用，且组间无显著差异[效靶比25:1时，(3.79±0.55)% vs. (2.24±0.37)%，(2.98±0.81)%；P > 0.05]。总之，细胞毒性实验表明，信号肽突变后的2组CAR-T细胞均优于未突变组，且SP-muR-CD19细胞杀伤提升效果更为显著。
2.5 不同类型的CD19-CAR-T细胞对细胞因子IFN-γ和TNF-α释放的影响为了进一步探究3种CAR结构对细胞因子释放的影响，采用ELISA技术检测不同的CAR-T细胞类型与肿瘤细胞共孵育后细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌水平[16]，当效靶细胞共孵育24 h后，实验结果如图 6所示，与阴性靶细胞组相比，IFN-γ和TNF-α的分泌水平在3种CD19-CAR-T细胞分别与阳性靶细胞共孵育组显著升高。与SP-wtY-CD19组相比，SP-muK-CD19和SP-muR-CD19细胞中IFN-γ [(4 812±365.60) pg/mL vs. (6 424±207.9) pg/mL、(7 620±236.60) pg/mL；P < 0.05]和TNF-α [(6 377±137.20) pg/mL vs. (7 797±64.98) pg/mL、(8 634±151.60) pg/mL；P < 0.05]的分泌水平均显著升高。综上所述，与SP-wtY-CD19和SP-muK-CD19相比，SP-muR-CD19细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平显著升高，与杀瘤结果一致。
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| 图 6 三种CD19-CAR-T细胞与靶细胞共孵育体系中IFN-γ和TNF-α的分泌水平 Fig. 6 The secretion levels of IFN-γ and TNF-α from three co-incubation system of CD19-CAR T cells and target cells. A: IFN-γ secretion levels from three groups were detected by ELISA. B: The secretion level of TNF-α from three groups was detected by ELISA. *: P < 0.05, **: P < 0.01. |
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急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是淋巴细胞在分化早期恶性增殖所致，可侵犯骨髓、血液和其他组织。该疾病发病率高，预后不佳[17]。CAR-T免疫治疗对ALL细胞具有靶向作用，而不损害正常细胞，有望作为ALL治疗的新方案。有研究报道，T细胞表面CAR结构的表达升高有助于促进CAR-T技术的肿瘤治疗效果，这为CAR-T在ALL中的优化治疗提供了新的思路[18]。近年来，靶向CD19的CAR-T细胞在白血病治疗中取得了突破性进展[19]，然而，针对CD19-CAR-T的复发及疗效持久性方面也开展了大量优化研究，其中，关于CAR结构的跨膜区及胞内共刺激分子的研究层出不穷，但围绕scFv的N端SP优化研究相对较少。基于此，本研究采用第三代CAR结构为基础开展信号肽的优化研究，该结构由单链抗体scFv (含SP)、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链组成[20]。前期报道显示，不同的SP序列直接决定其与信号识别颗粒(signal recognition particle, SRP)的亲和力，尤其是N端正电荷增加能够影响SRP的定位与捕获，最终决定新生多肽链向分泌途径进入的效率[21]。因此，本研究通过定点突变提高SP的N端正电荷数，通过一系列实验证实，与野生型相比，突变信号肽后的CAR-T细胞展示出更强的杀伤效应和细胞因子释放水平，且突变为精氨酸组效力更为显著，这可能与SP-muR与SRP的结合效率有关[22]，其具体的分子机制和作用方式还需进一步实验验证。综上所述，研究表明增加信号肽N端的正电荷数，可以提升CAR的表达效率和对CD19阳性靶细胞的杀伤效果。
CAR-T免疫细胞治疗领域发展迅速，新的技术手段迭代创新，如何通过分子生物学前沿创新型方式改造CAR结构，以增强CAR-T细胞持久性、降低细胞耗竭是影响CAR-T技术临床疗效的瓶颈问题。此外，下一代CARS的开发可能会整合多个共刺激结构域，或者使转导T细胞能够分泌特定的细胞因子，可能会增强抗恶性肿瘤的效果，但也可能改变预期的毒性特征[23]。CAR-T细胞疗法越来越多地被评估可用于实体恶性肿瘤，实体恶性肿瘤相关抗原在某些情况下可能在正常组织中同样广泛表达，这可能增加CAR介导的细胞毒性，引起副作用[24]。据报道，CAR-T细胞已应用于霍奇金淋巴瘤[25-26]和一些实体肿瘤的临床试验[27-28]中。随着CAR-T细胞产品生产工艺的不断优化升级，未来必将会有更多靶点的CAR-T细胞产品应用于恶性肿瘤治疗。
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