生物工程学报  2024, Vol. 40 Issue (7): 2150-2161 |
表1(Table 1)
引用本文
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猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)是一种新发猪肠道冠状病毒，各个年龄段的猪皆可感染，其中哺乳仔猪感染后临床症状最为严重，主要表现为急性呕吐、腹泻、脱水死亡[1]。PDCoV感染哺乳仔猪后的临床表现与猪流行性腹泻和传染性胃肠炎一致，致死率一般比两者较低，但PDCoV与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)或猪传染性胃肠炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)的混合感染可导致更加严重的临床症状和更高的致死率，严重危害全球生猪养殖业[2-3]。2012年，Woo等[4]在中国香港分离出一株新型感染猪的冠状病毒HKU15，被确定为猪德尔塔冠状病毒，这是PDCoV被首次报道。紧接着，2014年，美国俄亥俄州暴发由PDCoV引起的重大疫情，在猪腹泻样本中PDCoV阳性检出率达90%以上[5]。随后，美国、加拿大、韩国、中国及其他国家都相继暴发了严重的PDCoV疫情，PDCoV呈现全球蔓延的趋势[6-9]。
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的急性、高度接触性猪肠道传染病[10]。自1971年英国首次发生PED以来，该病在许多欧洲国家，如比利时、捷克、匈牙利、法国、意大利等相继暴发[11]。1986年，我国首次报道了PED，随后PED在全国各地扩散，特别是2010年末，PEDV在我国暴发并引起了有史以来最严重的PED疫情[12]。PEDV发病率高，幼年猪感染率高达100%，7日龄以下仔猪感染死亡率为80%−100%，给世界各国养猪业均造成了严重的经济损失，受到世界猪养殖国家的高度重视。近年来新型PEDV流行变异株(2a/2b亚型)的不断出现，又给PED的防控带来了新的挑战[12-13]。新型PEDV变异株相比于以往流行毒株，对仔猪致病性明显增强，且现有多数市售的、以经典毒株CV777为基础所研制的商品化疫苗无法有效保护仔猪抵抗新型2a/2b亚型变异毒株的攻击[14-16]。
PDCoV和PEDV都属于冠状病毒属成员，是单股正链RNA病毒。基因组长度为25−28 kb，包含5ʹUTR、3ʹUTR和8个开放阅读框(open reading frame, ORF)，分别编码2个多聚蛋白pp1a、pp1b，4个结构蛋白S、M、E、N，以及2个非结构蛋白NSP6、NSP7[17]。S蛋白为I型膜糖蛋白，呈纤突状存在于病毒粒子表面，在识别、结合宿主受体和诱导宿主产生中和抗体方面具有关键性作用。S蛋白包含S1和S2两个亚基[18]，S1亚基通过受体结合域(receptor binding domain, RBD)与细胞受体相结合，触发S蛋白构象改变，使S2亚基上的膜融合肽暴露，从而引发病毒与细胞膜的融合[19]。多项研究表明，S1亚基的RBD是冠状病毒主要的中和表位优势区，是宿主体液免疫的主要诱导因子，大多数针对冠状病毒感染的有效中和抗体靶向RBD[20-23]，因此RBD可作为亚单位疫苗研发的靶标抗原。
PDCoV和PEDV是我国当前引起仔猪病毒性腹泻的两个最重要的病原，Zhang等[24]研究表明，在河南省腹泻猪中，PEDV和PDCoV的共同感染率可达60.4%，在临床中PEDV和PDCoV的混合感染已经成为仔猪病毒性腹泻发生的常态。因此，以PEDV新型2a/2b亚型变异毒株和PDCoV流行毒株为基础，研制新型、高效、安全的疫苗是控制仔猪腹泻疫病发展的最有效、最经济手段，也是目前我国生猪疫病防控中的一项重大实际需求。本研究将PDCoV RBD与PEDV RBD进行串联，利用哺乳动物细胞ExpiCHO表达系统表达纯化出pdRBD-peRBD融合蛋白，并免疫小鼠，评价其免疫原性，所得结果将有助于PDCoV和PEDV二联新型亚单位疫苗的研发。
1 材料与方法 1.1 主要材料PDCoV毒株CH/XJYN/2016 (GenBank: MN064712)和PEDV GIIa毒株CH/HBXT/2018 (GenBank: MH816969.1)由本实验室分离、传代并保存；大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；EndoFree Plasmid Maxi Kit购于凯杰生物工程(深圳)有限公司；辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG购自Abcam公司；ExpiCHO-S细胞、ExpiCHOTM表达培养基、ExpiFectamineTM CHO转染试剂盒和OptiPROTM SFM购于赛默飞世尔科技公司；小鼠细胞因子检测试剂盒购于深圳达科为生物技术有限公司；FITC标记anti-mouse CD3、PE标记anti-mouse CD4和APC标记anti-mouse CD8抗体购自BioLegend公司。
1.2 方法 1.2.1 真核表达质粒的构建及大量提取为了使蛋白能够更好地分泌表达，本研究选择在融合蛋白氨基端添加人源分泌红蛋白家族1D成员1 (secretoglobin family 1D member 1)的信号肽序列(MRLSVCLLLLTLALCCYRANA)，在羧基端添加6×His标签序列。将设计的基因序列交由武汉金开瑞生物公司进行优化合成，并构建至pCDNA3.1(+)真核表达载体中(图 1A)。
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| 图 1 pCDNA3.1-pdRBD-peRBD的构建及鉴定 Fig. 1 Construction and identification of pCDNA3.1-pdRBD-peRBD. A: Schematic diagram of inserting pdRBD-peRBD gene into eukaryotic expression vector pCDNA3.1 (+). B: The identification of recombinant plasmid pCDNA3.1-pdRBD-peRBD by restriction enzyme digestion (lane M: DL5000 DNA Marker; lane 1: Recombinant plasmid DNA; lane 2: Recombinant plasmid digested by BamH I and Xho I). |
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将构建的真核表达质粒转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，接种于含有50 μg/mL氨苄霉素的200 mL LB液体培养基中，在37 ℃恒温摇床培养箱中过夜培养。次日用EndoFree Plasmid Maxi Kit大量提取重组质粒(具体实验步骤参考试剂盒说明书)，并用NanoDrop 2000分光光度计测定重组质粒的浓度，稀释至1 000 ng/μL，分装保存。
1.2.2 蛋白的表达纯化将提取的质粒按照ExpiCHO表达系统操作手册转染ExpiCHO-S细胞，在32 ℃培养箱含5% CO2的湿化空气条件下振荡培养10−12 d。随后用冷冻离心机将培养液以4 000−5 000 r/min离心30 min，上清液用0.22 μm过滤器过滤。将过滤后的上清液与用Buffer A (20 mmol/L Tris, 300 mmol/L NaCl, PH 8.0)处理过的Ni-NTA Agarose (Qiagen)于4 ℃混匀结合2 h，然后用5% Buffer B (20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱未结合的目的蛋白和非特异性结合的杂蛋白，再用100% Buffer B洗脱目的蛋白。收集纯度高的蛋白样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并将其稀释至1 mg/mL，装入透析袋中，置于100倍蛋白溶液体积的透析Buffer (1×PBS, PH 7.2)中缓慢搅拌透析24 h，12 h时更换一次透析液。收集透析好的蛋白溶液，重新测定蛋白浓度，用0.22 μm滤器过滤并分装，短时间于4 ℃保存，长时间于−80 ℃保存备用。
1.2.3 蛋白免疫印迹分析纯化的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转印硝酸纤维素膜进行免疫印迹分析，以PEDV或PDCoV阳性猪血清为一抗(1:1 000稀释)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记山羊抗猪IgG (1:10 000稀释)为二抗，用化学发光底物超敏增强化学发光液(enhanced chemiluminescence, ECL)进行显影。
1.2.4 小鼠免疫试验40只4−6周龄的无特定病原体雌性BALB/c小鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供，所有动物试验程序均由兰州兽医研究所的机构动物护理和使用委员会批准(批准号：LVRIAEC-2023-065)。将小鼠随机分为4组(10只/组)，第一组免疫剂量为10 μg/只，第二组免疫剂量为20 μg/只，第三组免疫剂量为30 μg/只，第四组注射等体积的PBS作为对照组；每组小鼠分别在第0、14和28天各免疫一次，免疫时用PBS稀释抗原，并与等体积的佐剂混合，进行后腿肌肉注射。首免和第一次加强免疫使用完全弗氏佐剂(Freund’s complete adjuvant, FCA)，第二次加强免疫使用不完全弗氏佐剂(Freund’s imcomplete adjuvant, FIA) (表 1)。
| Groups | Primary immunization | Boost immunization | Booster immunization |
| Group 1 | 10 μg+FCA | 10 μg+FCA | 10 μg+FIA |
| Group 2 | 20 μg+FCA | 20 μg+FCA | 20 μg+FIA |
| Group 3 | 30 μg+FCA | 30 μg+FCA | 30 μg+FIA |
| Group 4 | PBS | PBS | PBS |
在首免后第0、14、28和42天通过小鼠外眦静脉采血，采集后的血样在37 ℃放置1 h后置于4 ℃过夜，使得血清充分析出。次日，3 000 r/min离心10 min，分离血清。用间接ELISA方法测定血清中特异性抗体水平。具体操作如下：将纯化的pdRBD-peRBD融合蛋白用50 mmol/L的碳酸盐缓冲液(PH 9.6)稀释至2 μg/mL，包被96孔微孔板，每孔加入100 μL，4 ℃过夜包被；弃去包被液，PBST洗板3次，滤纸上拍干，加入用PBST配制的含5%脱脂奶粉的封闭液200 μL/孔，37 ℃孵育2 h；弃去封闭液，PBST洗板3次，滤纸上拍干，每孔加入100 μL从1:100开始2倍倍比稀释的免疫小鼠血清作为一抗，37 ℃孵育1 h；弃去孔中液体，PBST洗3次，滤纸上拍干，每孔加入100 μL HRP标记山羊抗小鼠IgG (1:10 000稀释)，37 ℃孵育1 h；弃去孔中液体，PBST洗3次，滤纸上拍干，每孔加入100 μL TMB底物溶液，37 ℃避光反应10 min；每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定在波长450 nm处的吸光光度值(OD450)，以P/N > 2.1的血清最大稀释倍数为被检血清特异性抗体的效价。
1.2.6 血清中和试验用固定病毒-稀释血清的方法测定血清的中和抗体滴度。具体操作如下：提前准备铺满70%−80% LLC-PK或Vero-CCL-81细胞的96孔板；将血清置于56 ℃水浴锅中灭活30 min，然后在96孔微量培养板中将血清进行2倍连续倍比稀释(1:2, 1:4, 1:8, 1:16)，每个稀释度设4孔重复。在上述各孔内加入等体积的稀释好的病毒液(200 TCID50)，混匀后置于37 ℃、5% CO2培养箱中作用1 h；同时设病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照设置200 TCID50 (全部病变)、20 TCID50、2 TCID50、0.2 TCID50 (不病变) 4个不同浓度的对照；用PBS洗涤细胞3次，然后在铺满96孔板70%−80%的细胞中每孔加入100 µL病毒-血清混合液，置于37 ℃、5% CO2培养箱作用1 h；孵育完成后，弃去孔中液体，PBS洗涤3次，每孔加入200 μL维持培养基(含20 μg/mL胰酶)，逐日观察，连续观察5–7 d并记录细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)。中和滴度定义为中和病毒感染50%所需血清稀释度的倒数。
1.2.7 流式细胞术分析首次免疫后第42天取小鼠脾脏，并用动物淋巴细胞分离液试剂盒分离制备淋巴细胞悬液。吸取1×106个制备的脾细胞悬液，设空白组、单标组和实验组。离心沉淀细胞，并去除上清。用100 μL稀释的抗体(CD3-FITC、CD4-PE和CD8-APC)重悬实验组细胞，用100 μL PBS缓冲液重悬空白组细胞，单标组分别加入PBS稀释的CD3-FITC、CD4-PE或CD8-APC抗体100 μL。轻轻混匀，4 ℃避光放置30 min。用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞，2 000 r/min离心3 min，去除上清，用PBS缓冲液重悬细胞后，使用Beckman CytoFLEX LX 5L19C进行流式细胞术检测，通过CytExpert流式分析软件分析检测结果。
1.2.8 血清中细胞因子水平检测利用细胞因子ELISA试剂盒检测初次免疫第42天后所采集的各免疫组小鼠血清中干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)和IL-4的表达水平(具体实验步骤参考试剂盒说明书)。
1.2.9 统计分析使用GraphPad Prism软件对试验数据进行单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)确定组间差异。各组保护率采用Fisher精确检验或卡方检验进行统计学分析(P > 0.05表示各组间无显著性差异，*P < 0.05表示为各组间的统计学差异，**P <0.01表示各组间有显著性统计学差异，而***P <0.001表示各组间有极显著性统计学差异)。
2 结果与分析 2.1 重组质粒的鉴定用BamH I和Xho I限制性核酸内切酶对构建的重组质粒pCDNA3.1-pdRBD-peRBD进行双酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳分离核酸。结果显示，第二泳道呈现两条清晰的条带，其中较大的条带为载体，大小为5 372 bp，较小条带为目的pdRBD-peRBD串联基因，大小为951 bp，与预期相符(图 1B)。
2.2 重组蛋白的表达纯化和鉴定重组质粒转染ExpiCHO-S细胞，按高滴度实验方案培养10 d后，离心收取细胞培养上清液，经镍柱亲和层析纯化获得重组蛋白，进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色清晰可见一条纯度较高目的蛋白条带，蛋白分子量大小约为43 kDa，与预期一致(图 2A)。为了进一步确定重组蛋白的特异性，分别用PDCoV阳性猪血清和PEDV阳性猪血清对pdRBD-peRBD融合蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明，融合蛋白不仅能被PDCoV阳性猪血清识别也能被PEDV阳性猪血清所识别(图 2B、2C)。
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| 图 2 pdRBD-peRBD融合蛋白的纯化与鉴定 Fig. 2 Purification and identification of pdRBD-peRBD fusion protein. A: SDS-PAGE analysis of pdRBD-peRBD fusion protein. B: The pdRBD-peRBD fusion protein could be recognized by PDCoV positive serum (lane 1: PDCoV positive serum; lane 2: Negative control serum). C: The pdRBD-peRBD fusion protein can be recognized by PEDV positive serum (lane 1: PEDV positive serum; lane 2: Negative control serum). |
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为了评估pdRBD-peRBD融合蛋白作为亚单位疫苗的潜力，对小鼠进行了免疫试验。免疫后，使用间接ELISA方法检测融合蛋白在小鼠体内诱导的特异性抗体水平。结果显示，pdRBD-peRBD融合蛋白初次免疫后第14天即诱导了高水平的特异性IgG抗体，在第一次加强免疫后，抗体水平有所升高，与PBS对照组相比，统计学差异极显著(P <0.001)。不同剂量组间抗体水平没有明显差异，说明10 μg的免疫剂量即可达到较好的免疫效果(图 3)。
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| 图 3 小鼠血清中特异性IgG抗体水平 Fig. 3 The level of specific IgG antibody in the serum of mice. ***: P < 0.001 (extremely significant difference). |
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用固定病毒-稀释血清的方法测定血清中和抗体滴度，结果显示，pdRBD-peRBD融合蛋白既诱导了高水平的PDCoV中和抗体，又诱导了高水平的PEDV中和抗体。与PBS组相比差异显著(P <0.001)，但不同剂量组间中和抗体水平没有明显差异(P >0.05)。其中10 μg剂量组PDCoV中和抗体为1:179.25，PEDV中和抗体为1:141.21，20 μg剂量组PDCoV和PEDV中和抗体分别为1:255.30和1:222.50，30 μg剂量组PDCoV和PEDV中和抗体分别为1:230.00和1:174.13 (图 4)。
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| 图 4 小鼠血清中和抗体滴度 Fig. 4 Neutralizing antibody titer in mouse serum. The results are expressed as the x±s. ***: P < 0.001 (extremely significant difference). |
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用流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中的CD4+、CD8+ T细胞百分比，ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的表达水平，结果显示，pdRBD-peRBD融合蛋白免疫组中小鼠脾脏淋巴细胞的CD4+和CD8+ T细胞占比均显著高于PBS对照组(P <0.05)，不同剂量组之间差异不显著(P >0.05)。而在免疫组中CD4+ T细胞占比显著高于CD8+ T细胞(图 5A、5B)。pdRBD-peRBD融合蛋白诱导产生的IL-2、IL-4和IFN-γ的表达水平均显著高于PBS对照组(P <0.01)，其中IL-4的上升水平最高，差异最显著(P <0.001) (图 5C)，表明pdRBD-peRBD融合蛋白诱导了明显的细胞免疫反应。
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| 图 5 免疫后42 d小鼠细胞免疫应答特征及血清中细胞因子表达水平 Fig. 5 The characteristics of cellular immune response and the expression level of cytokines in serum of mice 42 days after immunization. A: Flow cytometry plots showing the distribution of T lymphocyte subsets in the spleen. B: Percentage of CD3+CD4+/CD8+ T lymphocytes. C: Cytokine contents in the serum of mice. The results are expressed as the x±s. NS: P > 0.05 (no obvious difference); *: P < 0.05 (statistical difference); **: P < 0.01 (significant difference); ***: P < 0.001 (extremely significant difference). |
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冠状病毒可引起人和动物的多种疾病，在过去20年中，新型冠状病毒不断出现，在人类社会引发了多次传染病大流行，给人类健康造成巨大威胁[25-26]。对于冠状病毒疫苗的研发策略主要包括传统的灭活疫苗和弱毒疫苗以及新型的基因工程疫苗，基因工程疫苗主要有亚单位疫苗、核酸疫苗(DNA疫苗和RNA疫苗)、病毒活载体疫苗等[27-28]。传统的灭活疫苗具有工艺成熟、研发周期短、成本低、使用安全等优点，但其也有免疫剂量大、易出现过敏反应等缺点。此外，灭活疫苗制作过程中需要保持免疫原性颗粒的完整性以保持疫苗的免疫效果，并且对灭活的工艺要求较高，且生产过程中要求的生物安全等级较高[29]。研究表明，采用化学方法对冠状病毒进行灭活，会改变病毒粒子表面S蛋白的结构，使其大部分处于融合后状态，导致其免疫保护效果不佳[30]。新型基因工程亚单位疫苗具有生产工艺的安全性高、易于大规模生产、疫苗安全性好、稳定性相对较好、易保存和运输等优点[31]。该疫苗研发技术相对成熟，目前已经上市的亚单位疫苗包括乙型肝炎疫苗、流感亚单位疫苗、重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)等[32]。然而，蛋白亚单位疫苗的研发仍存在以下两项挑战：一是利用不同表达系统来表达病原体的部分蛋白作为抗原，最终表达的抗原蛋白可能跟病毒蛋白的天然构象存在差异，这有可能在一定程度上影响疫苗的免疫原性；二是由于仅选取病原体的一部分蛋白作为抗原，免疫原性弱，一般需要佐剂增强，而且产生免疫记忆效应可能较弱。
PDCoV和PEDV作为两种重要的猪肠道冠状病毒，在临床实践中经常存在交叉混合感染，为防控带来不便[3, 33]。对于PDCoV和PEDV的防控，疫苗接种仍是目前最有效的手段，然而，目前尚无针对PDCoV和PEDV的二联商品化疫苗。我们前期的研究表明，以GⅡa CH/HBXT/2018毒株为基础的灭活疫苗能有效保护所有仔猪(8/8)抵抗同源强毒(GIIa)和异源强毒(GIIb)的攻击[34]。因此，本研究基于PDCoV CH/XJYN/2016毒株S蛋白RBD和PEDV GⅡaCH/HBXT/2018毒株S蛋白RBD，利用分子生物学技术将其串联表达，这样既能增加RBD的免疫原性，又能达到免疫一种抗原同时预防两种疾病的效果[27, 35]。由于冠状病毒的RBD存在糖基化，因此本研究选择真核表达系统表达纯化pdRBD-peRBD融合蛋白，使其更符合病毒蛋白的天然结构，达到更好的免疫效果。在最新的研究中，Wang等[36]利用昆虫杆状病毒表达系统表达纯化出PDCoV-RBD蛋白，然后分别用CPG2395佐剂、水佐剂和Al(OH)3佐剂充分乳化制备疫苗，对小鼠进行体液和细胞免疫反应评估。结果显示，免疫组均能诱导小鼠高水平免疫应答，表明PDCoV-RBD蛋白具有良好的抗原性，可作为PDCoV的保护性抗原。Li等[37]在昆虫细胞中分别表达纯化出PDCoV S和RBD三聚体蛋白，在小鼠中检测了对S蛋白和RBD三聚体的免疫应答。中和试验和流式细胞术分析证明S蛋白和RBD三聚体均能引起较强的中和抗体和细胞免疫应答。伊立超等[38]利用杆状病毒表达系统制备PEDV-RBD蛋白，免疫周龄仔猪，免疫后8周产生了高水平的特异性抗体和中和抗体，并诱导了一定的细胞免疫应答。在上述研究中使用的都是昆虫细胞表达系统，该系统具有一定的优势，如蛋白翻译后的加工修饰(磷酸化、糖基化、二硫键等)，可容纳大分子的插入片段，表达水平高，可达总蛋白量的50%，能同时表达多个基因，对脊椎动物具有安全性等。但哺乳动物细胞表达系统在翻译后修饰、蛋白质正确折叠以及蛋白活性方面远高于其他表达系统，在生物医学和药学研究中具有不可替代的作用。因此，本研究选择哺乳动物细胞ExpiCHO表达系统表达纯化pdRBD-peRBD融合蛋白，并分为3种剂量(10、20和30 μg)进行小鼠免疫试验研究，结果表明，融合蛋白不仅诱导了高水平体液免疫应答，还诱导了一定的细胞免疫应答，这与Xu等[35]的研究结果一致，prototype RBD-Beta RBD或Delta RBD-Omicron RBD融合抗原诱导了更广泛的SARS-CoV-2变异体的血清中和，并在小鼠体内提供了更好的保护，以抵御Delta或Omicron SARS-CoV-2的攻击。
综上所述，pdRBD-peRBD融合蛋白具有良好的免疫原性，免疫小鼠后产生了高水平的特异性IgG抗体，能同时诱导产生PDCoV和PEDV中和抗体，可以作为一种候选PDCoV和PEDV二联亚单位疫苗。小鼠作为一种模式动物，可用于pdRBD-peRBD融合蛋白的免疫原性初步评价。在后续的研究中，我们将会选择免疫待产母猪，利用哺乳仔猪进行攻毒保护实验，进一步评估pdRBD-peRBD融合蛋白的免疫效力，为PDCoV和PEDV二联亚单位疫苗的研制提供依据。
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