猪支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine, MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)感染引起的一种慢性呼吸道传染病，又称地方流行性肺炎(enzootic pneumonia, EP)。该病分布广泛，是生猪养殖行业中最重要的传染病之一。建立准确和敏感的猪肺炎支原体抗体检测方法有助于了解猪肺炎支原体在猪群的流行情况，以便采取相应的防控措施。

目前应用较为广泛的猪肺炎支原体抗体检测方法是酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。我国批准上市的猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒是IDEXX公司开发的间接ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒用猪肺炎支原体全菌作为包被抗原，这造成该试剂盒在检测猪肺炎支原体抗体时会交叉识别环境中其他支原体刺激猪只产生的抗体，导致其特异性不高。Feng等建立了基于P97R1蛋白的间接ELISA抗体检测方法，用于检测猪鼻腔中的猪肺炎支原体IgA抗体^[1-2]，但该检测方法存在取样困难、采样过程不易标准化的问题。本实验室前期建立了一种基于Mhp366-N蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法，用于检测猪只自然感染猪肺炎支原体后血清中的抗体^[3]。该方法的灵敏性和特异性优于商品化试剂盒，但特异性仍需进一步提升。实验室前期研究发现猪肺炎支原体膜蛋白Mhp336与猪肺炎支原体阳性血清具有良好的反应性^[4]，具有作为ELISA检测方法包被抗原的潜力。本研究用Mhp336蛋白作为包被抗原，建立了一种灵敏性和特异性均较好的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法，为猪肺炎支原体的血清流行病学调查和猪场猪支原体肺炎的净化提供了帮助。

大肠杆菌BL21(DE3)-pGEX-6P-1-mhp336^[4]和质粒pET-32a(+)由本实验室保存，大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α感受态由本实验室制备并保存。

质粒提取试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；PrimeSTAR^® Max DNA polymerase、T4 DNA ligase、BamH Ⅰ和Xho Ⅰ购自宝生物工程(大连)有限公司；蛋白预染Marker和Omni-Easy^TM即用型BCA蛋白定量试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Thermo Scientific公司；HRP标记兔抗猪IgG和鼠抗His-Tag单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记兔抗鼠IgG购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。基于Mhp366-N蛋白的猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测试剂盒由本实验室制备^[5]。

在某猪肺炎支原体阳性且未免疫过猪支原体肺炎疫苗的猪场采集血液样品20份。在某猪肺炎支原体阴性且未免疫过猪支原体肺炎疫苗的猪场采集血液样品60份；该猪场在过去2年的猪肺炎支原体抗体监测的结果均为阴性。在某屠宰场采集血液样品63份，某种猪场采集血液样品20份，两个育肥猪场分别采集血液样品70、73份，合计226份；这些猪均没有免疫过猪支原体肺炎疫苗，且猪场猪肺炎支原体感染状态未知。收集的血液4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取上清分离血清。分离的血清经商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测试剂盒检测后，按1:1的比例加入终浓度为50%的甘油，振荡混匀后−20 ℃保存。

猪链球菌2型阳性血清由华中农业大学谭臣教授惠赠；猪鼻支原体、猪滑液支原体和絮状支原体阳性血清、猪肺炎支原体灭活疫苗免疫血清由江苏省农科院兽医研究所保存；猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒gB蛋白阳性血清由西南大学动物支原体学实验室保存。

文中的动物实验经西南大学实验动物伦理审查委员会批准(批准号：IACUC-20231228-04)。

在NCBI查找mhp336基因的核苷酸序列和Mhp336蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为：AE017332.1)，将mhp336基因核苷酸序列和Mhp336蛋白氨基酸序列在GenBank进行BLAST序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，分析核苷酸序列和氨基酸序列与其他物种的同源性，确定mhp336基因和Mhp336蛋白的保守性。

取−80 ℃保存的大肠杆菌BL21(DE3)-pGEX-6P-1-mhp336，划线接种氨苄西林(ampicillin，Amp) LB平板后37 ℃培养18 h。挑取长出的单菌落，接种于10 mL Amp⁺ LB液体培养基，37 ℃、180 r/min摇床培养8 h，使用质粒提取试剂盒提取重组质粒pGEX-6P-1-mhp336。根据猪肺炎支原体232菌株mhp336基因核苷酸序列，用Primer Premier 6.0软件设计引物，并在上游和下游引物分别引入BamH I、Xho I酶切位点和相应保护性碱基。引物序列：mhp336-F：5′-GGATCCATGAAAAATAAACTAATTCTTAGTAAATTT-3′；mhp336-R：5'-CTCGAGTAT GTAGTTTTTTTCTTTTGGATC-3'。单下划线表示BamH Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点，双下划线表示保护性碱基。以提取的重组质粒为模板，PCR扩增mhp336基因。扩增的基因经BamH I和Xho I双酶切后，与同样经BamH I和Xho I双酶切的pET-32a(+)载体连接。连接的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态并提取重组质粒，提取的重组质粒经BamH I和Xho I双酶切和测序鉴定。构建正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，重组菌命名为大肠杆菌BL21(DE3)-pET32a(+)-mhp336。参考本实验室前期的方法^[6]表达目的蛋白并鉴定蛋白表达形式。

剩余菌体加入适量Binding buffer (NaCl 0.5 mol/L, NaH₂PO₄·2H₂O 0.02 mol/L, Na₂HPO₄·12H₂O 0.02 mol/L)重悬菌体，超声破菌后4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取破菌上清。破菌上清缓慢过镍柱，使Mhp336重组蛋白与Ni²⁺充分结合，Washing buffer (NaCl 0.25 mol/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.01 mol/L、Na₂HPO₄·12H₂O 0.01 mol/L、咪唑0.1 mol/L)洗脱杂蛋白，Elution buffer (NaCl 0.25 mol/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.01 mol/L、Na₂HPO₄·12H₂O 0.01 mol/L、咪唑0.15 mol/L)洗脱目的蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化情况。

参考本实验室建立的基于Mhp366-N蛋白的猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法^[6]并做少许调整确定最佳反应条件：纯化的Mhp336蛋白包被浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 μg/mL；封闭时间为0.5、1.0、1.5和2.0 h；猪肺炎支原体阴性和阳性血清按1:50、1:200、1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000和1:8 000的比例稀释，37 ℃孵育0.5、1.0、1.5和2.0 h；HRP标记兔抗猪IgG按1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:40 000和1:80 000比例稀释，37 ℃孵育0.5、1.0、1.5和2.0 h；室温避光显色时间为5、10、15和20 min。

选取60份商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测试剂盒均检测为猪肺炎支原体抗体阴性的血清，按照确定的最佳反应条件进行ELISA试验，每个血清设3个重复，计算平均值(x)和标准差(s)，以x+2s作为血清阴阳性的临界值(cut off值)。

参考本实验室建立的基于Mhp366-N蛋白的猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法^[6]并做少许调整开展重复性试验，猪肺炎支原体阴性和阳性血清各随机选择3份。

将猪肺炎支原体阴性和阳性血清作为对照，用确定的最佳反应条件检测猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体、猪链球菌2型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和猪伪狂犬病病毒gB蛋白阳性血清。每个血清设3次重复。

取5份猪肺炎支原体阳性血清，用确定的最佳封闭液按1:100、1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:16 000和1: 32 000的比例稀释，其余步骤按最佳反应条件进行，测量相应孔的OD₄₅₀值，用确定的cut off值判断建立的ELISA方法血清的最大稀释倍数。

用本研究建立的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法检测采集的226份临床猪血清样品、猪肺炎支原体灭活疫苗免疫前(第0天)和免疫后不同时间点(免疫后第7、10、15、18、20和28天)采集的血清，同时用猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测试剂盒和商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒进行检测。比较不同试剂盒的检测结果。

mhp336基因和Mhp336蛋白与猪的其他病原不存在同源基因和同源蛋白，与感染羊的绵羊支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)的相关基因和蛋白分别有90.3%−91.8% (mhp336)和79.5%−87.4% (Mhp336)的同源性，与感染牛的殊异支原体(Mycoplasma dispar)相关基因和蛋白分别有92.4%−92.5% (mhp336)和83.7%-88.7% (Mhp336)的同源性；不同猪肺炎支原体菌株中mhp336基因同源性超过95.5%，Mhp336蛋白同源性超过90.2%。

以提取的重组质粒pGEX-6P-1-mhp336为模板PCR扩增mhp336基因片段(图 1A)。mhp336基因全长1 473 bp，扩增的片段去掉了终止密码子TAA，但在两端分别添加了BamH I和Xho I的酶切位点及保护性碱基，因此扩增的全长为1 488 bp。

图 1 重组质粒pET-32a(+)-mhp336的构建 Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pET-32a(+)-mhp336. A: Amplification of mhp336 gene by PCR. B: Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-mhp336 by digestion. A：PCR扩增mhp336基因. B：重组质粒pET-32a(+)-mhp336的酶切鉴定

图选项

构建的重组质粒经BamH I和Xho I双酶切后，被酶切为两个条带(图 1B)，一条为5 900 bp左右的pET-32a(+)载体片段，一条为1 476 bp的mhp336基因片段(PCR产物基础上去掉了保护性碱基、BamH I和Xho I酶切位点的部分碱基)。测序发现重组质粒中的mhp336基因序列除5个在支原体编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG外，其余核苷酸序列与猪肺炎支原体232菌株mhp336基因的核苷酸序列完全一致。构建的重组质粒命名为pET-32a(+)-mhp336。

构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET32a(+)-mhp336使用IPTG在16 ℃诱导表达目的蛋白20 h，超声破菌后经多次离心，分离得到上清和沉淀。根据SDS-PAGE电泳结果(图 2A)和Western blotting结果(图 2B)可知，Mhp336重组蛋白的分子量为60 kDa，以可溶和包涵体两种形式表达，经纯化后纯度达到95%以上(图 2C)。

图 2 重组蛋白Mhp336的表达与纯化 Fig. 2 Expression and purification of recombinant protein Mhp336. Identification of the expression and expression form of Mhp336 by SDS-PAGE (A) and Western blotting (B). M: Protein marker; 1: Recombinant bacteria without induction of recombinant protein expression by IPTG; 2: Recombinant bacteria with induction of recombinant protein expression by IPTG; 3: Supernatant of recombinant bacteria with induction of recombinant protein expression by IPTG; 4: The pellet of recombinant bacteria with induction of recombinant protein expression by IPTG. C: Purification of recombinant protein Mhp336. M: Protein marker; 1: Loading material; 2: Flow through; 3: Washing buffer; 4−5: Elution buffer. SDS-PAGE (A)和Western blotting (B)鉴定Mhp336蛋白的表达及表达形式. M：蛋白marker；1：未经IPTG诱导目的蛋白表达的重组菌；2：经IPTG诱导目的蛋白表达的重组菌；3：经IPTG诱导目的蛋白表达的重组菌破菌上清；4：经IPTG诱导目的蛋白表达的重组菌破菌沉淀. C：Mhp336重组蛋白的纯化. M：蛋白Marker；1：重组菌破菌上清；2：流穿；3：Washing buffer；4−5：Elution buffer

图选项

本研究确定ELISA操作步骤为：纯化的Mhp336蛋白用碳酸盐缓冲液调整浓度为0.05 μg/mL (图 3A)，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜。PBST洗涤5次，每次3 min。每孔加入200 μL含2.5%脱脂奶粉的PBS作为封闭液(图 3B)，37 ℃封闭1 h (图 3C)，PBST洗涤5次。每孔加入100 μL待检猪血清(封闭液1:500稀释) (图 3D)，37 ℃孵育0.5 h (图 3E)，PBST洗涤5次。每孔加入100 μL用封闭液1:10 000稀释(图 3F)的兔抗猪IgG酶标二抗，37 ℃孵育1 h (图 3G)后PBST洗涤5次。每孔加入底物显色液A、B各50 μL。室温避光显色5 min (图 3H)，加入50 μL终止液，10 min内使用酶标仪测定OD₄₅₀值。

图 3 基于Mhp336的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法的最佳反应条件 Fig. 3 Optimal working conditions of the ELISA method for detection of anti-Mycoplasma hyopneumoniae antibody based on Mhp336 protein. The optimal antigen concentration was 0.05 μg/mL in coating buffer (A), The optimal blocking buffer was 2.5% skim milk dissolved in PBS (B), and the highest P/N value was got if the antigen was blocked for 1 h (C). The optimal dilutions of serum and secondary antibody were 1:500 (D) and 1:10 000 (F) diluted in blocking buffer. The optimal incubation times of serum and secondary antibody were 0.5 h (E) and 1 h (G), respectively. The optimal colorimetric reaction time was observed after exposing to substrate solution for 5 min (H). 最佳抗原包被浓度为0.05 μg/mL (A)，最佳封闭液为含2.5%脱脂奶粉的PBS (B)，最佳封闭时间为1 h (C)，最佳血清和二抗稀释倍数分别为1:500 (D)和1:10 000 (F)，最佳血清和二抗孵育时间为0.5 h (E)和1 h (G)，最佳显色时间为5 min (H)

图选项

60份猪肺炎支原体阴性血清OD₄₅₀的平均值(x)为0.216，标准差(s)为0.058。以x+2s作为临界值(cut off值)，最终确定待检血清OD₄₅₀值≥0.332时为猪肺炎支原体抗体阳性，OD₄₅₀值＜0.332时为猪肺炎支原体抗体阴性。

制备的试剂盒批内和批间重复的变异系数分别为2.46%−5.52%和3.63%−6.20%，小于7%。表明同一批次和不同批次制备的试剂盒批内和批间变异系数小，具有良好的批内和批间重复性。

按照本研究建立的ELISA方法检测3种支原体、1种猪的致病菌、4种猪的病毒和猪伪狂犬病病毒gB蛋白阳性血清。结果发现上述血清均为猪肺炎支原体抗体阴性(图 4)，说明建立的ELISA方法所用蛋白抗原和猪的其他主要病原和猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗血清没有交叉反应。

图 4 基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法检测猪的其他病原阳性血清结果 Fig. 4 The detection result of positive sera of porcine pathogens using the ELISA method for detection of anti-Mycoplasma hyopneumoniae antibody based on Mhp336 protein. Mhp: Mycoplasma hyopneumoniae; Mhr: Mycoplasma hyorhinis; MF: Mycoplasma flocculare; Mhs: Mycoplasma hyosynoviae; SS2: Streptococcus suis serotype 2; CSFV: Classical swine fever virus; ASFV: African swine fever virus; PRRSV: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PCV-2: Porcine circovirus 2; gB-PRV: gB protein of pseudorabies virus.

图选项

由图 5可见，5个猪肺炎支原体阳性血清在1:4 000稀释时，所有血清均可判为阳性；1:8 000稀释时，仅有1个血清可判为阳性；1:16 000和1:32 000稀释时，所有的数值均低于cut off值。说明用该方法检测猪血清中猪肺炎支原体抗体最高可稀释4 000倍。

图 5 基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法的可用血清最高稀释倍数 Fig. 5 The available maximum dilution ratio of porcine serum for the ELISA method for detection of anti-Mycoplasma hyopneumoniae antibody based on Mhp336 protein.

图选项

采用本研究建立的基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法、猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法和商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒检测226份猪血清样品，结果如表 1所示。本研究建立的方法和商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒的符合率为81.0%，和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法的符合率为82.7%，猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法和商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒的符合率为67.7%。

以商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒为基准，去掉不能判定的可疑血清，分别计算基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法的特异性和灵敏性。本方法的灵敏性和特异性分别为87.9%和85.2%，猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法的灵敏性和特异性分别为86.2%和66.5%。证明本方法的特异性和灵敏性均优于猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法。

用3种试剂盒检测猪肺炎支原体灭活疫苗免疫前和免疫后不同时间点采集的血清。商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒检测的结果全部为阴性；用猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法检测，只有第28天采集的血清检测结果为阳性；用基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法检测，第20天和第28天采集的血清检测结果均为阳性。

猪支原体肺炎通常不导致猪的死亡，但会严重降低猪的生产性能。在禁抗限抗以及疫苗的免疫效果有待进一步提升的背景下，猪支原体肺炎的净化越来越受到养殖企业的重视。疫病净化的关键条件之一是拥有灵敏性高、特异性好的检测试剂。

支原体是环境中的常在微生物，猪只不可避免会接触环境中的支原体并产生针对支原体的抗体。特别是絮状支原体，是猪场最常见的支原体，也是猪呼吸道的常在菌^[7-8]；此外猪场还可能存在通常不引起猪发病或引起与猪链球菌病和格拉瑟病相似临床症状的猪鼻支原体^[9-10]。絮状支原体、猪鼻支原体与猪肺炎支原体存在共同抗原^[11-13]。商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒使用的包被抗原为猪肺炎支原体全菌蛋白。这就不可避免地导致试剂盒特异性较差，造成猪鼻支原体、絮状支原体或猪滑液囊支原体血清抗体的检出^[13]。有研究表明，商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒灵敏性较差^[14]。

基于上述情况，本实验室以猪肺炎支原体Mhp366-N蛋白^[14-15]为包被抗原，建立了基于Mhp366-N蛋白的猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法^[3-5]。该方法提高了检测的灵敏性，也克服了商品化试剂盒特异性不高的问题。但在临床检测过程中，我们发现在无猪支原体肺炎临床症状的猪只中使用荧光定量PCR方法检测不到猪肺炎支原体核酸，但用猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法检测猪血清为阳性。因此猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法可能存在较多的假阳性结果。这种方法用于猪场猪支原体肺炎净化会造成假阳性猪只的误淘汰，给猪场造成损失。因此，还需建立特异性更高的猪肺炎支原体抗体检测方法。

Mhp336蛋白是本实验室发现的一个猪肺炎支原体体液免疫显性蛋白^[4]，该蛋白与猪肺炎支原体阳性血清存在良好的反应性，经BLAST序列比对，与感染猪的其他微生物不存在同源蛋白，具有作为检测抗原的潜力。基于此，我们拟以Mhp336蛋白作为包被抗原，建立一种新的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法。

为确保得到在宿主菌以可溶形式表达的Mhp336蛋白，我们将PCR扩增得到的mhp336基因分别连接至pET-22b(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)和pET-32a(+)这4个载体，构建了4个重组菌。结果发现，只有连接pET-32a(+)载体构建的重组菌中Mhp336重组蛋白大部分以可溶形式表达。因此，最终选择重组菌大肠杆菌BL21(DE3)-pET-32a(+)-mhp336用于表达Mhp336重组蛋白。

采用本研究建立的ELISA检测方法检测其他猪的病原阳性血清，结果表明，所用的包被抗原Mhp336蛋白与检测的其他猪病原蛋白没有交叉反应性。

以商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒为基准，比较本研究建立的方法和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法的灵敏性和特异性。理论上说，高灵敏性和高特异性不可兼得^[16]，但我们将使用商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒检测到的13个不能判定阴阳性的可疑样品去除后再比较两种方法的灵敏性和特异性，结果发现本研究建立的方法比猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法的灵敏性和特异性均更高，这也说明本研究建立的方法优于其他两种方法。

总之，本研究基于猪肺炎支原体Mhp336蛋白建立了一种新的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法。该方法具有良好的灵敏性和特异性，适合用于猪场猪支原体肺炎的净化。