恩拉霉素(enramycin)是一种由链霉菌(Streptomyces fungicidious)分泌并由17种有机氨基酸和13种氨基脂肪酸构成的、属于多肽结合类型的有机化合物^[1]，它对于链球菌、肺炎双球菌等革兰氏阳性菌具有强烈的抗菌活性，能够有效调节各类动物的胃肠道菌群。1974年，恩拉霉素在美国、日本正式登记注册，因其能够有效地促进动物健康生长并能够改善饲料综合利用率^[2]，在美国、日本等全球40多个国家广泛使用，并于1993年在我国首次允许使用^[3]。近年来，由于畜禽饲养量的增加，部分养殖户为取得最大经济效益滥用恩拉霉素，导致肉源性食品中恩拉霉素的过量残留。这不仅会增加食用者的患病风险，对各国的进出口贸易也可能产生很大的负面影响。2020年，我国禁止将恩拉霉素作为饲料添加剂^[4]，因此，规范恩拉霉素的使用对于保障公共健康具有重要的现实意义。

当前，恩拉霉素的测定技术主要有两种，分别是微生物法^[2]和色谱分析法^[5-6]。其中，色谱分析法还可与其他方法联用来提高检测的灵敏度。但是这些测定方法样本的前处理时间较长，并且需要特定的人员进行操作及结果判定，具有较强的专业性。胶体金免疫层析分析技术(gold immunochromatographic assay, GICA)因具有方便、快捷和成本低等优点^[7]，被广泛用于现场检测。它是一种在免疫理论基础上进一步发展而来的新型免疫层析测定技术，能够很好地弥补仪器检测方法检测时间长、成本高昂以及样本处理难度较大的缺点。此法在对动物源性食品质量控制^[8]、食品病原微生物检测^[9]、食品谷物真菌毒素^[10]的检测领域表现出极大的优势，并且发展快速，在特异性和灵敏度方面明显优于传统检测技术，降低了检测工作的强度，同时提升了检测的质量。目前，对于恩拉霉素含量的免疫检测方法^[11]报道不多，其中关于胶体金试纸条的残留检测方法尚未见报道。因此，建立恩拉霉素的胶体金免疫层析法具有较高的应用价值。

1 材料与方法 1.1 主要材料

恩拉霉素A组分(enramycin A, Er.A)、恩拉霉素B组分(enramycin B, Er.B)、抗恩拉霉素A单克隆抗体(anti-enramycin A monoclonal antibody, anti-Er.A-mAb)、恩拉霉素A人工抗原(Er.A-BSA)由实验室自制，牛血清蛋白(bovine serum protein, BSA)购自Sigma公司，多黏菌素B (polymyxin B, Pol.B)、杆菌肽A (bacitracin A, Bac.A)、维吉尼亚霉素M1 (virginiamycin M1, Vir.M1)、万古霉素(vancomycin, Van)均购自南京都莱生物技术公司，恩拉霉素预混剂(enramycin premix, Er.Pre)购自上海莫息生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG (horseradish peroxidase-IgG, HRP-IgG)、羊抗鼠IgG (goat anti-mouse IgG)购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，纯度98%的3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine, TMB)购自萨恩化学技术(上海)有限公司，0.01 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PBS)购自上海碧云天生物技术股份有限公司，碳酸钾、甲醇、氯化钠、吐温-20、酪蛋白和明胶购自国药集团，蔗糖、去离子水购自本地超市，猪饲料、鸡饲料购自本地农贸超市，玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane, NC)、吸水纸、Polyvinyl chloride (PVC)底板、50 nm粒径胶体金溶液购自杭州布陆斯贸易有限公司。

1.2 主要仪器

万分之一天平、pH计购自梅特勒托利多科技(上海)有限公司，数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司，高速冷冻离心机购自Sorvall公司，酶标仪购自美谷分子仪器(上海)有限公司，紫外分光光度计购自上海美谱达仪器，旋涡振荡仪购自海门市其林贝尔仪器公司，高效液相色谱仪购自Waters公司，XYZ-3000型试纸条三维喷膜仪、胶体金读数仪由杭州都林生物科技有限公司提供。

1.3 金标抗体的制备及表征 1.3.1 金标抗体最佳标记pH的确定^[7]

取10个1.5 mL离心管分别编号后加入胶体金溶液1 mL，向每个离心管中加入相应编号的0−9 μL 0.2 mol/L K₂CO₃混匀。在每管中加入5 μg anti-Er.A-mAb反应20 min，然后分别加入100 μL 10% NaCl溶液，静置60 min。最后从各管中取200 μL溶液和200 μL胶体金原溶液在400−600 nm处进行波段扫描，重复3次，选取与胶体金原溶液相比最大吸光值变化最小的实验组pH值为最佳标记pH。

1.3.2 金标抗体最佳抗体标记量的确定^[7]

取10个1.5 mL离心管分别加入胶体金溶液1 mL，用1.3.1中确定的最佳K₂CO₃添加量调节溶液pH。随后在各离心管中加入适量anti-Er.A-mAb使其终浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 μg/mL。反应20 min后，在溶液中添加100 μL 10% NaCl并摇匀，静置60 min。从各管中取200 μL溶液和200 μL胶体金原溶液在400−600 nm处进行波段扫描，重复3次，选取与胶体金原溶液相比最大吸光值变化最小的实验组抗体添加量作为最佳的抗体添加量。

1.3.3 金标抗体的制备

吸取适量胶体金溶液于一个烧杯中，用K₂CO₃将溶液调至合适的pH，加入一定量抗体，充分混匀后慢速振荡标记40 min。取10% BSA进行封闭，继续反应40 min。将溶液转移到洁净的离心管中，4 ℃、1 400 r/min离心10 min，去除较大的聚集物后，8 000 r/min离心30 min，弃上清，加入胶体金复溶液进行复溶，将适量的金标抗体加入到可拆卸的96孔板内^[12-13]，冻干后密封避光保存备用。

1.3.4 金标抗体偶联率的测定及表征

通过紫外-可见光测定法测定样本中游离的anti-Er.A-mAb，以此计算得到抗体偶联率。首先，以不同浓度游离的anti-Er.A-mAb为横坐标，以OD₄₅₀的吸光度值为纵坐标建立标准曲线。然后通过间接酶联免疫分析法测定1.3.3中离心的上清液，计算得到游离的anti-Er.A-mAb含量^[14]。偶联率(coupling rate)的计算方法：

式中，Cr表示偶联率，mAb_tol表示抗体标记前的抗体总量，mAb_SN表示上清液中的抗体量。

此外，通过紫外分光光度计扫描标记前后的胶体金以及金标抗体溶液，观察最大吸收峰是否偏移。

1.4 饲料样本浸提方法

称取待测的猪、鸡饲料50 g置于250 mL锥形瓶中，按1:1 (质量体积比)加入甲醇浓度为50% (体积比)的PBS溶液。在漩涡振荡仪振荡15 min，再在室温下超声10 min。在4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液备用。用同样的方式对离心后的沉淀物进行二次浸提处理，完成后将两次上清液进行混合，并用45 nm滤膜对上清液进行过滤，获得样本浸提液，采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive inhibition enzyme-linked immunosorbent assay, icElisa)^[11]检测确定样本提取液中不含恩拉霉素，用于外标添加实验。

1.5 胶体金免疫层析试纸条的组装

试纸条的组装如图 1所示，它由PVC底板、样本垫、NC膜和吸水垫组成，检测线和质控线喷涂在NC膜上适当位置。

1.6 反应条件的优化

为了筛选出免疫层析试纸条的重要参数，应用胶体金读数仪对试纸条进行扫描读数。检测结果以T/C值和抑制率(inhibition rate)进行判定^[15-16]，当T/C＜1 (即T线比C线浅)时为阳性；当T/C≥1 (即T线比C线深或一样深)时为阴性；当C线未显色时，则检测无效(图 2)。

抑制率的计算公式：

式中，I表示抑制率，B_x表示阴性样本的T/C值，B₀表示阳性样本的T/C值。

1.6.1 T线包被浓度的优化

C线羊抗鼠IgG浓度选用常规浓度0.4 mg/ml，考察T线浓度为0.5、1.0、1.5 mg/mL时对试纸条显色的影响，用甲醇浓度为50% (体积比)的PBS溶液(阴性样本)和含250 ng/mL的Er.A标准品(阳性样本)进行测定，试纸条反应15 min后，用胶体金读数仪进行判定。

1.6.2 金标抗体用量的优化

考察金标抗体用量为2、3、4、5、6 μL时对胶体金试纸条显色的影响，用阴性样本和阳性样本进行测定，选取T/C值最接近1且抑制率最低的作为最佳抗体使用量。

1.7 检测限测试

用甲醇浓度为50% (体积比)的PBS溶液将1 mg/mL Er.A标准品分别稀释成5、25、50、75、100、200、300、400、500和600 ng/mL，测试时取20 μL不同浓度标准品与阴性样本加入含有金标抗体的微孔中，再加入80 μL样本稀释液振荡均匀。将试纸条样本垫一端插入微孔，15 min后用胶体金读数仪判定结果。

1.8 特异性测试^[11]

用甲醇浓度为50% (体积比)的PBS溶液分别配制浓度为1 mg/mL的Er.A、Er.B、Er.Pre、Van、Bac.A、Pol.B和Vir.M1标准溶液，分别稀释到1 μg/mL后进行特异性测试^[11]，同时设阴性对照。

1.9 重复性测试

从3个批次制备的恩拉霉素胶体金免疫层析试纸条中分别随机抽取15条试纸条，用于检测阴性样本、250 ng/mL Er.A标准品溶液和500 ng/mL Er.A标准品溶液，每组重复5次。

1.10 阳性添加实验

作为促生长类饲料添加剂(anti-growth promoter, AGP)，恩拉霉素在饲料中的添加量为猪饲料2.5−20.0 mg/kg，鸡饲料1−5 mg/kg^[17]。因此向阴性饲料样本中添加适量10 mg/mL Er.A标准品溶液，分别制备Er.A浓度为2.5、20、30 mg/kg的猪饲料样本和Er.A浓度为1、5、10 mg/kg的鸡饲料样本，按1.4中的方法取样浸提，与阴性样本一同进行测试。

恩拉霉素的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测方法参照金萍^[18]报道的色谱条件：C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相为0.01 mol/L乙腈-磷酸二氢钾体系(30:70，体积比)，流速为1 mL/min，检测波长为267 nm。

2 结果与分析 2.1 金标抗体制备条件的优化及表征 2.1.1 金标抗体标记条件的优化

胶体金溶液的pH和抗体的标记量会影响抗体与胶体金颗粒的结合效率以及金标抗体的稳定性^[19-20]。如图 3所示，当体系中用于pH调节的碳酸钾添加量达到8 μL时，胶体金最大吸收值变化较小，说明该条件下金标抗体的稳定性最好，能够在高盐环境中保持胶体金颗粒呈分散状态而不聚沉，因此选取K₂CO₃添加量为8 μL。考察标记体系中anti-Er.A-mAb的最适用量，结果表明当抗体终浓度达到4 μg/mL时，溶液的OD₄₅₀值与胶体金原溶液的差异最小，金标抗体最稳定，并且浓度升高后变化不显著，因此选择4 μg anti-Er.A-mAb为每毫升胶体金溶液的最佳标记量。

2.1.2 金标抗体质量鉴定

通过肉眼观察，标记后的金标抗体溶液呈紫红色，较标记前胶体金溶液偏紫一些，色泽鲜亮，其400−600 nm紫外扫描图谱见图 4。由图 4可知，标记前胶体金溶液的最大吸收波峰在524 nm处，而标记后同浓度金标抗体溶液的最大吸收峰在529 nm处，发生了偏移，这表明anti-Er.A-mAb成功结合在胶体金颗粒上。

2.1.3 抗体偶联率的测定

将1 mg/mL的anti-Er.A-mAb标准溶液稀释至浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/mL，通过icElisa方法测定其在450 nm处的吸光值并建立标准曲线(图 5)，曲线方程为y=0.203 68+6.439 69 x (R²=0.989 17)。图 5表明，anti-Er.A-mAb在0.02−0.10 μg/mL之间时，OD₄₅₀值与anti-Er.A-mAb浓度具有良好的线性关系。经测定，离心后的上清液OD₄₅₀为0.11，表明游离anti-Er.A-mAb抗体的浓度小于0.02 μg/mL，抗体偶联率高于99%。

2.2 试纸条层析条件的优化 2.2.1 最佳T线包被浓度

由于T线的显色是判定结果的主要依据，在C线浓度0.4 mg/mL的条件下，对T线包被浓度进行优化，确保T线在阴性条件下有明显的显色并且在阳性条件下具有足够灵敏的竞争性。如图 6所示，采用阴性样本检测时，随T线浓度增加，T/C值逐渐增大，当T线浓度为1.0 mg/mL时，T/C值最接近1。当采用阳性样本检测时，T/C值虽随T线浓度增加而增加，但变化幅度较小；同时，当T线浓度为1.0 mg/mL时抑制率最大，表明该浓度时试纸条的竞争性最好，因此选择1.0 mg/mL作为最佳T线包被浓度。

2.2.2 最佳金标抗体用量

金标抗体用量对试纸条灵敏性有很大的影响，竞争性胶体金免疫层析法的灵敏度与金标抗体的用量成反比，过多的金标抗体会降低其灵敏度^[21]，因此需要对金标抗体用量进行考察。如图 7所示，随着金标抗体用量增加，阴性样本检测时各实验组的T/C值均接近1，但是金标抗体用量为2 μL时，T、C线的显色较浅，其他金标抗体用量的T、C线显色清晰。当采用阳性样本检测时，2 μL金标抗体用量时虽抑制率最高，但C线显色较浅；之后随金标抗体用量增加，虽T/C值略有增加，但试纸条灵敏度下降，抑制率呈下降趋势。考虑成本等因素，最终选择3 μL为最佳金标抗体使用量。

2.3 试纸条灵敏度测试

取阴性样本以及不同浓度Er.A标准品溶液，按1.7加入到含3 μL金标抗体的微孔中，插入试纸条，反应15 min后用胶体金读数仪进行结果判定，重复3次，结果见图 8。当Er.A含量达到25 ng/mL时，T/C值小于1即可被检出，并且Er.A在25−300 ng/mL范围内，试纸条的T/C值与Er.A的含量具有良好的线性关系，其方程为y=0.998 03−0.002 97 x (R²=0.99)，可实现样品中Er.A的定量检测。

2.4 试纸条特异性测试

取阴性样本以及1 μg/mL的Er.A、Er.B、Er.Pre、Van、Bac.A、Pol.B和Vir.M1标准品溶液，按1.7加入到含3 μL金标抗体的微孔中，插入试纸条，反应15 min后用胶体金读数仪进行结果判定，重复3次，结果见图 9。恩拉霉素胶体金免疫层析试纸条对1 μg/mL Er.A、Er.B以及Er.Pre检测结果为阳性，对其他的恩拉霉素结构类似物及阴性样本检测结果为阴性。这表明本试验所研制的恩拉霉素胶体金免疫层析试纸条具有高度的特异性，可以用于样品中恩拉霉素的快速检测。

2.5 试纸条重复性测试

在3批次制备的恩拉霉素胶体金免疫层析试纸条中，分别随机抽取15条用于检测阴性样本、250 ng/mL Er.A标准品溶液和500 ng/mL Er.A标准品溶液，每组重复5次，检测结果并未出现任何假阳性、假阴性的情况，说明不同批次制备的恩拉霉素检测用试纸条重复性好。

2.6 阳性样本添加实验

根据1.4方法，选用猪饲料和鸡饲料两种样品进行阳性添加实验，猪饲料中Er.A添加量分别为2.5、20、30 mg/kg，鸡饲料中Er.A添加量分别为1、5、10 mg/kg，检测时按需稀释。上述每个添加量设3次重复，采用1.4方法对样品进行处理后进行检测，结果见表 1。经GICA法测试阳性样本浸提液，猪饲料、鸡饲料中Er.A的添加回收率在87.0%−99.5%之间，相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)＜5.46%。采用HPLC法测试阳性样本浸提液，当猪饲料中Er.A添加量为2.5 mg/kg、鸡饲料样品中Er.A添加量为1、5 mg/kg时，HPLC无法检出，其他各添加水平阳性样本的Er.A添加回收率在87.40%−91.33%之间，RSD＜6.57%，说明本研究建立的免疫层析方法具有良好的灵敏性和准确性，能有效检出饲料样本中按规添加的恩拉霉素。

3 讨论与结论

恩拉霉素能够阻止细菌细胞壁的合成，导致细菌失去保护，特别对肠内有害梭状芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有很强的活性^[22]。在动物饲料中添加适量恩拉霉素预混剂可以预防动物疾病，同时显著提高饲料转化率^[23]。但若养殖户不顾停药期规定滥用恩拉霉素，会造成它在动物体内残留，进而由食物链富集到人体，对人体产生危害。日本2023年通报的第G/SPS/N/JPN/1137号文件中规定猪鸡可食用性组织(鸡肉、肾脏、肝脏以及脂肪)中恩拉霉素的残留量为30 μg/kg^[24]。因此，开发一种快速、准确、可用于现场检测的恩拉霉素检测方法具有重要意义。GICA因其灵敏度高、操作简便、结果可视化等优点，在抗生素快速检测领域发挥着重要的作用^[25-27]，它还可以通过包被不同的检测线实现对几种不同抗生素的同时检测^[28]。Li等^[29]研发了一种用于检测样本中恩诺沙星含量的胶体金免疫层析试纸条，肉眼定性检出限为0.125 ng/mL；借助光学扫描仪可实现超灵敏定量，检出限为0.001 95 ng/mL，适合于现场快速检测。

本研究构建了基于胶体金的恩拉霉素免疫层析试纸条，对金标抗体标记方法、T线包被浓度以及金标抗体使用量等参数进行了优化，配合胶体金读数仪可实现饲料中恩拉霉素含量的定量检测。在金标抗体标记过程中，当K₂CO₃添加量为8 μL/mL、抗体添加量为4 μg/mL时，anti-Er.A-mAb抗体偶联率高于99%。通过研究Van、Bac.A、Pol.B、Vir.M1等结构类似物以及Er.A、Er.B、Er.Pre对检测结果的影响证明该试纸条特异性良好。本研究制备的恩拉霉素免疫试纸条在15 min内可得到结果，采用胶体金读数仪读取试纸条，Er.A检出限为25 ng/mL，线性范围为25−300 ng/mL。对猪、鸡饲料样品进行阳性样本添加试验，结果表明添加回收率在87.0%−99.5%之间，RSD＜5.46%。与恩拉霉素的其他检测方法相比，微生物法虽检测成本低，但测定时间长，灵敏度和特异性不高。陈敏等^[30]建立的以枯草芽孢杆菌为检定菌的双碟法检测恩拉霉素的定量范围为0.56−35.79 U/mL，许铭玉等^[31]建立的干燥滤纸片法检测恩拉霉素的定量范围为150−500 U/mL。恩拉霉素色谱分析法主要有两类：高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)和薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)。HPLC方法灵敏度较高、重复性好，常被用于分析发酵液和预混剂样品中恩拉霉素的含量，其定量范围为200−1 000 mg/mL^[32]。然而，单独使用HPLC法测定畜禽产品及饲料中恩拉霉素存在灵敏度的问题。杜鑫^[33]将超高效液相色谱法与质谱法联用，建立了猪肉、鸡肉样本中恩拉霉素含量的检测方法，检出限达4 μg/kg，定量下限为10 μg/kg，灵敏度优于HPLC。TLC检测成本低，若单一使用只能用于定性检测^[34]。周鹏飞等^[5]通过将TLC与紫外分光光度法联用，结果表明恩拉霉素点样量在20−166 μg范围内线性良好，可用于恩拉霉素预混剂含量的检测。目前，基于恩拉霉素单克隆抗体的检测方法只有Lu等^[11]建立的双抗原竞争ELISA：他们建立了猪肌肉和鸡肌肉样本中恩拉霉素含量的icELISA检测方法，检出限分别为144.8 μg/kg和98.0 μg/kg；证明了通过特异性抗体检测恩拉霉素方法的可行性，但ELISA方法操作过程烦琐、对操作人员及操作条件要求高。本研究制备了高纯度的恩拉霉素A单克隆抗体，建立了胶体金免疫层析法检测样品中恩拉霉素，检测限低至ng/mL水平。相较于其他恩拉霉素检测方法，具有简便快捷、节约成本、无需使用大型仪器等优点，可应用于饲料样品中恩拉霉素的实时现场筛查，具有良好的发展前景。