2025, Vol. 41中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王孝芳, 王硕, 杨可铭, 唐义珂, 徐阳春, 沈其荣, 韦中
- WANG Xiaofang, WANG Shuo, YANG Keming, TANG Yike, XU Yangchun, SHEN Qirong, WEI Zhong
- 土壤噬菌体微生态研究方法进展与挑战
- Methodological breakthroughs and challenges in research of soil phage microecology
- 生物工程学报, 2025, 41(6): 2310-2323
- Chinese Journal of Biotechnology, 2025, 41(6): 2310-2323
- CSTR: 32114.14.j.cjb.250258
- DOI: 10.13345/j.cjb.250258
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文章历史
- Received: March 30, 2025
- Accepted: May 25, 2025
引用本文
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2. 南京农业大学 草业学院, 江苏 南京 210095
2. College of Agro-grassland Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China
土壤微生态系统是指在特定微域空间内，由微生物群落与土壤基质、植物组织及其代谢产物共同构成的动态互作网络。该系统具有自主执行物质循环、能量传递和遗传信息交换的核心生态功能[1]。通过微生物-植物-土壤界面的协同进化，其在维持宿主植物健康、优化养分获取等方面发挥了重要作用[2]。噬菌体作为专性侵染细菌或古菌的一类病毒，是地球上丰度最高(约1031–1032颗粒)且遗传多样性最复杂的生物实体。在土壤微生态系统中，噬菌体深刻影响着物质循环、能量流动和生态功能[3]。作为土壤微生物组中的“暗物质”，噬菌体在调控微生物群落结构与功能、维持土壤-植物系统健 康中发挥关键作用[4]。凭借其高度的靶向性、强裂解能力以及对环境微生态扰动较小等优势，噬菌体正日益成为土壤生态学研究的前沿热点。
相较于水体环境，土壤特殊的物理、化学和生物属性构成了研究土壤噬菌体的多重屏障。首先，土壤结构具有异质性，土壤固相占比约为总体积的50%，且矿物组成、团聚体结构和根系分泌物梯度等塑造了空间的变异[5]，导致噬菌体原位迁移与追踪困难[6]；其次，土壤有机质-金属离子-矿物等复合体系形成分子吸附屏障[7]，导致噬菌体核酸提取效率低；此外，土壤噬菌体、细菌及真核生物间形成的多级互作网络[8]，导致单一噬菌体研究结果难以反映实际生态情境。总体而言，受限于上述屏障，与水体、医学等领域相比，土壤噬菌体研究进展相对滞后，亟需对研究方法进行系统性梳理与整合。为此，本文聚焦土壤噬菌体研究方法与进展，系统归纳整合了以下关键环节：土壤样品的预处理、土壤噬菌体的定量表征、多组学联合分析策略、噬菌体-细菌互作研究。
1 土壤样品预处理与噬菌体富集 1.1 土壤样品预处理尽管“宿主存在即存在对应噬菌体”的生态学假说提示理论上任何可培养宿主细菌的对应噬菌体均可分离，但土壤中可培养细菌比例不足1%，其对应噬菌体的可培养率可能更低[9]。目标噬菌体丰度低于检测限是主要原因之一，需进行浓缩富集。然而，受限于土壤胶体对噬菌体颗粒的强吸附性，水环境领域成熟的噬菌体富集方法并不适用于土壤体系。因此，高效洗脱吸附于土壤颗粒表面的噬菌体，制备富含噬菌体的悬液(图1)，成为研究土壤噬菌体的首要预处理步骤。目前常用洗脱液包括镁盐、柠檬酸钾或磷酸盐缓冲液以及10%的牛肉浸膏等[10]。其中，缓冲液中的盐成分主要用于调节pH并稳定病毒颗粒[11]；而牛肉浸膏中的蛋白质或含有2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的离子化合物，则可竞争土壤胶体结合位点[12]，促进噬菌体置换解吸。需要注意的是，这些洗脱介质通常需结合超声处理[13]、涡旋[14]、振荡[15]或磁力搅拌[12]等物理机械方法，以破坏噬菌体-土壤相互作用，增强洗脱效果。
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| 图 1 土壤噬菌体研究方法流程 Fig. 1 Research methods and workflow for soil phage analysis. AMG: Auxiliary metabolic gene; ARG: Antibiotics resistance genes. AMG：辅助代谢基因；ARG：抗生素抗性基因。 |
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获得土壤噬菌体悬液后，通常需通过浓缩富集技术提升噬菌体浓度和纯度。目前主流方法为切向流过滤法(tangential-flow filtration, TFF)和聚乙二醇沉淀法(polyethylene glycol, PEG)，二者可单独或联合氯化铯密度梯度离心进行噬菌体的富集(表1和图1)。TFF技术利用垂直流向的过滤模式循环截留病毒颗粒[16]。该方法能特异性去除细菌等杂质，实现噬菌体的持续浓缩，尤其适用于大体积样本处理。PEG 技术则通过聚乙二醇破坏噬菌体表面水化层诱导沉淀。具体操作需加入终浓度为0.5 mol/L的NaCl溶液和等体积10% PEG 6000溶液，4 ℃孵育过夜后以8 000 r/min 离心30 min收集沉淀[17]。该方法成本低、操作简便，是常规实验室手段。对于高纯度需求，可将前述浓缩技术与蔗糖或氯化铯密度梯度离心联用。后者基于噬菌体颗粒密度差异实现精细分离，但受限于专业设备要求，常规实验室中应用较少。
| Specialized vocabulary | Definition |
| Tangential-flow filtration | Compared with traditional filtration, tangential flow directs liquid parallel to the filter membrane, preventing accumulation of large molecules that cause membrane clogging |
| Polyethylene glycol | Polyethylene glycol precipitates viruses by disrupting capsid hydration layers |
| Quality control | Filter raw sequencing data by removing low-quality/eukaryotic sequences and trimming ends |
| Assembly | Splicing short reads from raw sequencing data into assemble scaffold-level or complete circular DNA using established algorithms |
| Taxonomy annotation | Assign taxonomy to unknown sequences by aligning species markers/reference genomes |
| Phage life cycle | Phage lifecycle stages comprise lytic, chronic, and lysogenic cycles etc. |
| Gene annotation | Predict unknown gene function by similarity comparison to annotated genes |
| Collinearity analysis | Detect recombination regions via pairwise genome alignment |
| Pangenome analysis | Classify phage genes by population-level cluster distribution |
| Resequence | Sequence closely related genomes, align to analyze mutations, and assess indel impacts on function |
自20世纪50年代以来，噬菌斑计数法因其操作简便、成本低廉的优势，被广泛用于土壤样品及共培养液中噬菌体丰度的检测[18-19]。然而，该方法存在2大局限性：(1) 依赖可培养宿主细菌进行增殖，限制了可检测的噬菌体种类[20]；(2) 仅适用于裂解宿主形成噬菌斑的烈性噬菌体，无法检测基因整合到宿主基因组中的温和噬菌体。
2.1.2 电子显微镜计数透射电镜(transmission electron microscope, TEM)技术于1928年首次用于海洋病毒样颗粒计数[21]，至20世纪末拓展至土壤噬菌体研究[22]。虽能直观观察噬菌体形态，但因设备昂贵、操作繁琐且需高浓度样本，当前在数量表征方向的应用受限。
2.1.3 荧光显微计数法荧光显微镜(epifluorescent microscopy, EM)自2000年后成为主流，研究者们通过荧光显微镜量化了不同土壤类型及深度的噬菌体丰度[23]。但其同样存在局限，如荧光染料结合效率不足导致计数偏低[24]，且无法区分噬菌体形态或特异性识别的病毒样颗粒。
2.1.4 流式细胞仪计数流式细胞仪计数作为21世纪初兴起的高通量技术，可用于快速检测湖泊、海洋及土壤中的噬菌体种群[25]，并于2013年后应用于土壤噬菌体分布研究[24]及原噬菌体检测研究[26]。然而，该技术无法靶向检测特定核酸或蛋白，且染料的特异性及成本因素也限制了其广泛应用。
2.2 土壤噬菌体的形态研究噬菌体形态高度多样，透射电镜是其形态分类的主流工具[7]。随着科技进步，透射电镜性能大幅提升，2010年后已广泛用于噬菌体形态表征，可识别有尾、球形、杆状及丝状噬菌体等主要噬菌体类型[9]。Swanson等[9]发现根际土壤中约50%的有尾噬菌体属于短尾噬菌体科。然而，透射电镜也存在一定的局限：(1) 难以分辨噬菌体细微的形态差异，如长尾噬菌体科内头部与尾部变异[5]；(2) 对样品中噬菌体种群密度要求高，且操作耗时耗力。近年来，冷冻电子显微镜[27]和X射线晶体学方法[28]已在其他领域的研究中用于噬菌体微观结构的观察。另外高通量的形态鉴定可以基于噬菌体的基因组序列进行判断，利用VirFam在线工具分析 (http://biodev.cea.fr/virfam/Default.aspx)分析有尾噬菌体的头尾蛋白注释，并结合NCBIrefseq数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/taxon=10239)的比对判断其他类型噬菌体。
2.3 土壤噬菌体基础生物学特性研究分离获得噬菌体后，需系统评估其基础生物学特性以挖掘应用潜力。(1) 噬菌体效价或滴度(titer)测定：通常采用噬菌斑计数法来量化活性噬菌体浓度，并可同步获取噬菌斑特征(斑块大小、透明浑浊等)。(2) 环境耐受性：通过不同温度、pH处理结合效价检测，评估噬菌体的耐热性与酸碱稳定性。(3) 一步生长曲线：定量分析烈性噬菌体的潜伏期、裂解量等参数，揭示裂解动力学特征，是评估噬菌体裂解能力的关键指标。(4) 最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)：通过设置噬菌体-细菌比例梯度试验，确定产生最高子代效价的MOI值，以表征侵染效率。
3 基于多组学的土壤噬菌体多样性研究土壤噬菌体基因组具有高度多样性，其核酸类型包括dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA[29]，其中dsDNA噬菌体是土壤环境中的主要类群。土壤噬菌体的基因组长度高度多样，其范围从数千bp (如丝状噬菌体)到超过100 kb (如巨型噬菌体)。功能基因组成涵盖了结构组装、DNA复制等核心生物学过程。目前针对土壤噬菌体基因组多样性的分析流程可分为3个模块(表2)：测序数据预处理、基因组多样性解析、比较基因组分析。
| Research module | Research content | Software | Function |
| Preprocess | Quality control | Trimmomatic[30], BWA[31], FastQC[32] | Trimomatic (quality trimming); BWA (alignment/eukaryotic filter); FastQC (quality assessment) |
| Assembly | IDBA[33], SPAdes[34], metaSPAdes[35], MEGAHIT[36], Trinity[37], Flye[38] | metaSPAdes/MEGAHIT (metagenome/virome); IDBA/Flye (whole genome); Trinity (transcriptome) | |
| Genome diversity | Taxonomy diversity | PhaGCN[39], gtdbtk[40], vContact2[41] OrthoFinder[42], VIRFAM[43], VICTOR[44], ViPTree[45], Mash[46], fastree[47], iqtree[48] |
GTDB-Tk: bacterial taxonomy PhaGCN/vContact2: phage taxonomy VIRFAM: Caudovirales annotation OrthoFinder/ViPTree: protein tree Mash/VICTOR: nucleotide tree FastTree/iqtree: conserved sequence |
| Life cycle | PHASTER[49], PHASTEST[50] PhageBoost[51], Phigaro[52], Prophage Hunter[53], PhaTYP[54], Deephage[55], PhageAI[56], geNomad[57] |
Based on database: PHASTER, PHASTEST Based on machine learning: PhageBoost, Phigaro, Prophage Hunter, PhaTYP, Deephage, PhageAI and geNomad |
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| Gene prediction | Prokka[58], Prodigal[59], Pharokka[60], GeneMark[61] |
Prokka/Prodigal: bacterial genomes; Pharokka: phage genomes | |
| Gene annotation | BLAST[62], DIAMOND[63], HMMER[64] |
BLAST (nt/aa); DIAMOND (fast aa); HMMER (HMM profiles) | |
| NR[65], Pfam[66], CARD[67], CAZy[68], VOGDB[69], phold[70], KEGG[71], GO[72] | NR: Comprehensive Pfam: Domains CARD: Antibiotic resistance CAZy: Carbohydrate metabolism VOGDB: Phage-host interaction phold: Phage structure KEGG/GO: Metabolic pathways |
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| Comparative genomics | Collinearity analysis | aliTV[73] | Pairwise sequence alignment (genome/gene) |
| Resequence | Snippy[74], GATK[75] PLINK[76], Pyseer[77] |
SNP calling: Snippy, GATK GWAS: PLINK/Pyseer |
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| Pangenome analysis | Roary[78], Panaroo[79] | Pangenome dynamics: Roary/Panaroo (core/pan-gene tracking) | |
| Phage identification | DeepVirFinder[80], CheckV[81], VirSorter2[82], Vibrant[83], Phamer[84] |
Database: CheckV/VirSorter2 Machine learning: DeepVirFinder, Vibrant, PhaMer |
测序获得的原始数据需经标准化处理才能获得高质量的噬菌体基因组序列，具体流程如下。
(1) 数据质控。原始数据中常包含低质量序列、原核或真核基因组污染等。质控阶段需去除这些干扰因素，包括修剪序列末端、过滤低质量序列、剔除原核/真核生物序列，该步骤通常使用Trimmomatic[30] (表1)。若样品中存在宿主基因组污染，需要额外处理，下载参考基因组序列并使用BWA-MEN[31]比对的方法去除宿主序列。
(2) 序列组装。质控后的高质量reads需要进行组装，常用的组装软件包括IDBA[33]、SPAdes[34]、metaSPAdes[35]、MEGAHIT[36]、Trinity[37]等。不同的测序方法在组装过程中采用不同的策略：单一噬菌体测序，直接将reads组装成完整的基因组；宏基因组或宏病毒组测序，先将每个样本的高质量 reads组装成较长的contigs，再进一步筛选病毒序列，通常利用cd-hit[85]对contig进行聚类去冗余，再使用DeepVirFinder[80]、CheckV[81]、VirSorter2[82]等工具识别病毒contigs。
3.2 噬菌体基因组多样性分析当前针对土壤噬菌体基因组的分析主要包括物种多样性分析、生活史预测和基因功能多样性分析(图1)。其中物种多样性分析包括噬菌体物种分类注释与发育树构建，生活史分析旨在推断土壤噬菌体潜在的生命循环方式，基因功能多样性分析包括基因预测、功能注释与功能多样性评估。
3.2.1 噬菌体物种多样性研究物种分类是土壤噬菌体研究的基础，通常结合物种注释和系统发育分析。当前分类标准由传统的形态学分类[29]发展为国际病毒分类委员会(the International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)分类法[86]。物种注释从早期依赖特定基因或全基因组序列比对的方法逐步发展到基于系统发育树聚类和基于机器学习分类注释方法。如VIRFAM[43] (http://biodev.cea.fr/virfam/Default.aspx)通过“头-颈部-尾部模块”基因的识别对噬菌体进行科水平的物种注释；VICTOR[44]通过全基因组发育树聚类确定噬菌体的分类地位；PhaGCN[39]通过机器学习噬菌体基因结构特征进行物种注释。噬菌体基因组中缺乏类似细菌16S rRNA的保守基因，限制了通用系统发育分析。但目前有研究利用特定类群内相对保守的基因进行多样性分析[87-88]。例如，利用g23作为标记基因调查东北黑土中T4型噬菌体的多样性[89]；Zablocki等[15]使用g20和phoH作为标记基因分析南极土壤中有尾噬菌体的多样性。但此方法仅适用于同一科或同一目的噬菌体，且易受水平基因转移的干扰[90]。基于噬菌体全基因组的蛋白树或系统发育树克服了标记基因的局限性，能将更多的噬菌体纳入同一发育树中进行比较，极大地丰富了土壤噬菌体物种多样性的表征。例如，OrthoFinder[42]与ViPTree[45]等基于噬菌体全基因组编码的蛋白序列构建系统发育树；Mash[46]根据全基因组序列的距离构建系统发育树表征土壤噬菌体的多样性。
3.2.2 生活史预测噬菌体的生活史主要分为裂解性循环、溶原性循环和慢性循环这3类。基于基因组序列预测噬菌体潜在的生命循环方式是判断生活史的关键。目前预测主要集中于温和噬菌体(原噬菌体)，对于慢性循环噬菌体的预测极少，可能受限于相关数据库规模。原噬菌体预测方法的发展主要分为3个阶段。(1) 基于数据库比对。依托现有的原噬菌体数据库，通过基因组比对识别潜在的原噬菌体区域，PHASTER[49]、PHASTEST[50]等分析软件可以基于数据库对潜在的原噬菌体序列进行评估和预测，但该方法识别范围有限，遗漏大量潜在序列。(2) 基于特定溶原性标志基因识别。随着研究的深入，研究者们发现原噬菌体序列中存在特定的溶原标志基因或蛋白，如转座酶、整合酶、切割酶和重组酶等[91]。Pfam等数据库[66]可以提供相关蛋白的序列信息，通过序列比对检测识别这些酶，进而预测原噬菌体的存在。该方法基于基因序列，可靠性较高且扩大了识别范围，但仍依赖数据库。(3) 基于机器学习的预测。随着土壤微生物研究中原噬菌体的作用凸显及其的识别需求增长，涌现出PhageBoost[51]、Phigaro[52]、Prophage Hunter[53]、PhaTYP[54]等方法。这些工具利用机器学习模型识别原噬菌体序列，进一步拓展了识别范围，其预测结果通常具有很高的可靠性。
3.2.3 噬菌体基因功能多样性土壤噬菌体基因组的多样性同样体现在基因功能层面。功能分析通常始于利用Prokka[58]、Prodigal[59]、Pharokka[60]等工具进行基因预测。随后，通过数据库比对对预测出的基因进行功能注释。基因注释涉及的数据库众多，且侧重不同的蛋白功能。例如，VOGDB数据库聚焦噬菌体与宿主互作，将蛋白功能分为病毒结构与复制、病毒-宿主互作和未表征功能3大类[69]。借助这些数据库，研究人员已成功表征了多种土壤噬菌体基因组的基因功能。Summer等[92]完成了4株马红球菌噬菌体基因组的功能分析；Halmillawewa等[93]完成了一株高卢根瘤菌噬菌体的基因组表征；Fan等[94]完成了一株分枝杆菌噬菌体基因组的功能表征。然而，当前功能注释存在显著局限，高度依赖现有的数据库。随着新土壤噬菌体的不断发现及其基因组的快速进化，大量基因无法在数据库中匹配到同源序列，严重制约了土壤噬菌体基因功能的全面解析。
3.3 噬菌体比较基因组分析解析土壤噬菌体的基因功能是当前研究的热点之一，其基因组中存在大量功能未知的“基因暗物质”。比较基因组分析方法通过比较不同土壤噬菌体基因组之间的差异来推测基因的潜在功能，是探索这些未知基因的重要手段，主要包括共线性分析、泛基因组分析、重测序分析等(图1)。
3.3.1 共线性分析通过比较已知序列的土壤噬菌体基因的排列顺序(基因结构)的差异，进行详细表征并寻找潜在的关键基因。Lee等[95]利用共线性方法比较了蜡状芽孢杆菌噬菌体、炭疽芽孢杆菌噬菌体和苏云金芽孢杆菌噬菌体基因组之间的结构差异。然而，该方法不适用于高通量分析，效率较低，难以满足日益增长的土壤噬菌体基因组分析需求。
3.3.2 泛基因组分析在群体水平对噬菌体基因进行聚类比较，通过基因簇在群体中的分布将基因进行分类，寻找其中的核心基因与泛基因，常用的软件包括Roary[78]和Panaroo[79]等。泛基因组分析的效率高，可以同时对大量噬菌体基因序列进行分析且耗时短，不仅能辅助推测基因功能，还能评估基因对噬菌体种群的重要性。
3.3.3 重测序分析噬菌体基因组存在高度的变异性。基因序列中特定碱基的变化(如某个核苷酸的插入或缺失)，可能引起基因功能的重大变化。重测序分析聚焦于噬菌体基因组的高度变异性，探究特定碱基突变引起的功能变化及其对进化的影响，有助于揭示未知基因功能。Snippy[74]、GATK[75]等软件可以检测到突变体中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及插入缺失标记(insertion-deletion, InDel)差异。与噬菌体表型关联，还可以寻找潜在关键基因或者突变位点，PLINK[76]、Pyseer[77]等软件可以实现相关功能。但需注意其结果可能存在假阳性，需要进一步实验验证。
4 噬菌体-细菌的互作研究 4.1 噬菌体-细菌互作模型在长期的协同进化过程中，噬菌体与细菌的互作形成了多层次的理论模型，生态层面包括“杀死胜利者(kill the winner, KTW)”和“搭便车(piggyback the winner, PTW)”模型，进化层面则涵盖“军备竞赛(arms race dynamics, ARD)”和“波动选择(fluctuating selection dynamics, FSD)”模型[96-97]，共同揭示了双方从分子对抗到群落动态的复杂互作机制。
4.1.1 生态层面的互作模型(1) KTW模型。当某优势细菌种群(“胜利者”)丰度上升时，其专性烈性噬菌体随之快速增殖，导致宿主数量骤降，并释放生态位[98]，从而抑制单一优势物种垄断、促进微生物群落的动态平衡与多样性维持。
(2) PTW模型。与KTW模型相反，PTW模型强调噬菌体通过温和感染策略(如溶原化)与高适应性“胜利者”宿主形成共生关系[99]，利用水平基因转移增强宿主竞争力，进而维持群落结构的稳定性。
4.1.2 进化层面的互作模型(1) ARD模型。噬菌体-细菌通过持续升级“矛”与“盾”的对抗机制实现动态平衡。例如，细菌通过限制性修饰(restriction modification, RM)系统切割噬菌体DNA，而噬菌体则进化出羟甲基胞嘧啶(hydroxymethylcytosine, HMC)甲基化修饰等机制逃避识别[100]。这种正向选择驱动的“军备竞赛”不断强化攻防能力，使适应性更强的噬菌体基因型或防御系统更完善的细菌获得短期优势，但可能导致群落多样性的下降。
(2) FSD模型。“军备竞赛”中积累的防御机制会增加宿主的生存成本，使高成本优势基因型在资源竞争中被低成本的稀有基因型取代。后者种群扩张后重新面临噬菌体压力，又因成本增加而衰落，导致基因型频率呈现周期性波动[101]。该模型通过负向选择维持攻防系统的多态性，促进群落多样性。值得注意的是，“波动选择”模型与“军备竞赛”模型并非互斥，在自然界中常共存互补，共同塑造进化动态。
4.2 噬菌体-细菌互作研究方法噬菌体-细菌互作是当前研究的热点。在土壤噬菌体基因组分析的基础上衍生出一系列方法，包括土壤噬菌体宿主识别、宏基因组网络互作和计算机模型互作等，从不同角度探究噬菌体-细菌互作。
4.2.1 土壤噬菌体宿主识别技术宿主识别是土壤噬菌体-细菌互作研究的基础，主要包括基于培养和基于生信分析2种方式。双层琼脂平板法通过噬菌斑鉴定宿主，该方法准确可靠，但通量低且无法检测溶原性噬菌体的宿主。基于生信分析的方法包括CRISPR spacer识别[102]、tRNA比对[103]和同源性匹配[62]，具有高通量宿主预测的优势。但不同分析方法也存在局限性：CRISPR spacer识别是最精准的方法，但依赖完备的数据库，能够识别的土壤噬菌体有限；另外2种方法可靠性相对较低，并且识别宿主的精度也较低。基于大数据训练的人工智能(artificial intelligence, AI)模型，通过大量的细菌基因组、噬菌体基因组及其互作结果进行宿主的精准预测是未来土壤噬菌体宿主识别的重要方法。
4.2.2 宏基因组的网络互作该方法在宿主识别的基础上能够高通量研究土壤噬菌体-细菌互作。例如，Braga等[104]利用基于宏基因组的网络互作方法，探究了噬菌体胁迫对土壤细菌群落组成和多样性的影响；Starr等[105]将同位素与宏基因组网络互作研究方法相结合，确定噬菌体是驱动土壤中植物碳周转的重要因素。但是，该方法需要实验验证。
4.2.3 基于计算机数据模型的互作该方法能够快速处理大量数据，结合机器学习能够提升研究结果的可靠性。Egilmez等[106]利用数学模型预测了自然条件下噬菌体调节致病菌类鼻疽伯克霍尔德菌的数量变化。但是，噬菌体-宿主互作的复杂性及一些未知的影响因素可能限制了该方法预测宿主的准确性。
5 总结与展望当前土壤噬菌体研究已形成了多维度整合技术体系：在定量表征方面，通过噬菌斑计数法、荧光显微术及流式细胞术实现定量检测，结合透射电子显微镜可进行传统的形态学分类。在基因组方面，采用培养扩增结合Sanger测序，以及不同预处理的宏基因组或宏病毒组学技术获取遗传信息；配合Pharokka[60]等基因预测工具和VOGDB[69]等数据库进行功能注释；在此基础上进一步挖掘基因组信息，包括系统发育、基因功能多样性、泛基因组等分析。在噬菌体-细菌互作研究方面，运用宏基因组网络分析探究环境因子对噬菌体-宿主互作的调控；通过分离培养系统进行实验进化研究，获得可靠的互作实验证据；基于计算机建模探究噬菌体-宿主互作的动态变化。这些多学科研究方法从多角度揭示了噬菌体-宿主的生态进化互作规律。
尽管土壤噬菌体研究取得了一系列的进展，但目前仍存在显著不足：(1) 土壤噬菌体种质资源匮乏；(2) 土壤RNA噬菌体研究不足；(3) 土壤噬菌体基因组中存在大量功能未知的基因；(4) 土壤噬菌体的宿主预测无法精确到基因型水平。因此，土壤噬菌体未来研究可聚焦：(1) 系统分离保存土壤噬菌体的种质资源，构建功能基因库，开发噬菌体工程化改造平台，助力其应用；(2) 基于宏转录组探究土壤RNA噬菌体的多样性与功能；(3) 结合蛋白功能、结构数据库以及AI模型预测未知基因功能；(4) 整合宏基因组/转录组/蛋白质组的多维数据耦合，结合CRISPR间隔区挖掘和宿主匹配算法，解析噬菌体-宿主互作特异性，并利用微宇宙实验验证。这些研究可以深度融合前沿技术，最终实现从土壤噬菌体多样性认知到生态功能定向调控的突破。
作者贡献声明
王孝芳：总体设计框架和思路、初稿写作；王硕：初稿写作；杨可铭：稿件润色修改；唐义珂：提供文献材料；徐阳春、沈其荣：监督指导、稿件润色修改；韦中：总体设计框架和思路、监督指导、稿件润色修改。
作者利益冲突公开声明
作者声明没有任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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