2025, Vol. 41中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李胜杰, 苏慧娟, 李晓婷, 魏静, 陈廷涛
- LI Shengjie, SU Huijuan, LI Xiaoting, WEI Jing, CHEN Tingtao
- 高效递送趋化因子CXCL12工程益生菌的构建及其在糖尿病慢性创面愈合中的应用
- Construction of an engineered probiotic strain for efficiently delivering chemokine CXCL12 and application of the strain in diabetic chronic wound healing
- 生物工程学报, 2025, 41(6): 2334-2348
- Chinese Journal of Biotechnology, 2025, 41(6): 2334-2348
- CSTR: 32114.14.j.cjb.240632
- DOI: 10.13345/j.cjb.240632
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文章历史
- Received: August 5, 2024
- Accepted: December 5, 2024
- Published: December 9, 2024
引用本文
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2. 南昌大学 江西医学院 药学院生物工程药物江西省重点实验室, 江西 南昌 330031
2. Jiangxi Province Key Laboratory of Bioengineering Drugs, School of Pharmacy, Jiangxi Medical College, Nanchang University, Nanchang 330031, Jiangxi, China
糖尿病慢性创面因其复杂的病理基础造成创面经久难愈，导致行动不便、截肢甚至死亡等，严重影响着患者生存质量和心理健康，给社会经济和医疗资源带来了沉重的负担[1-2]。据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation, IDF)相关数据统计，2021年全球成年糖尿病患者人数达到5.37亿，造成的全球卫生支出估计为9 660亿美元；预计到2030年和2045年，全球成年糖尿病患者人数将分别达到6.43亿和7.83亿[3]。因缺乏有效的预防和控制措施，急剧上升的糖尿病发病率所造成慢性创面和足溃疡并发症的大幅增加已成为日益严重的临床问题[2]。由于糖尿病慢性创面(皮肤伤口及足溃疡)存在长期慢性炎症、代谢异常、难愈合或不愈合等诸多问题，使得清创术、皮肤移植和全身性抗生素使用等常规的治疗方法无法取得令人满意的愈合效果[4]。因此开发更有效的新疗法、新策略加速创面愈合具有重要意义。
趋化因子CXCL12，也叫基质细胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor, SDF-1)，通过招募多种类型的修复细胞和调节血管生成，共同协调并促进创面愈合和组织修复[5-6]。CXCL12与其受体CXCR4/ACKR3结合，构成CXCL12/ CXCR4/ACKR3生物轴，通过激活一系列细胞内信号通路和效应分子，来调节细胞增殖、迁移和定殖，从而影响血管形成和组织分化，参与创面愈合等生理过程[7-8]。研究表明，CXCL12对单核/巨噬细胞、淋巴细胞、内皮祖细胞以及干细胞的伤口转运具有重要作用，从而有助于创面新生血管的快速形成并促进伤口的再上皮化[9]。CXCL12能够选择性促进血管内皮细胞分裂增殖来促进新血管形成，通过增加微血管的通透性，使血浆蛋白渗出至血管外形成临时基质，有利于新血管的形成[5]。此外，CXCL12不仅可以趋化巨噬细胞定向募集，还能诱导间充质细胞归巢，后者除了可以促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达加速血管生成外，还可以调控巨噬细胞由M1型向M2型极化，从而缩短创面的炎症反应阶段，加快组织修复进程。因此，CXCL12不仅是维持正常皮肤结构和功能、保持自身稳态的重要趋化因子，而且在调节创伤后皮肤血管生成和促进再上皮化过程中起着重要作用[8]。
在糖尿病慢性创面模型中，内皮祖细胞的低循环水平与CXCL12的低表达水平呈正相关，其内在分子机制可能是高血糖会抑制巨噬细胞CXCL12的表达进而阻止内皮祖细胞的定向招募[10]。因此，局部使用过表达CXCL12的质粒用于提高CXCL12水平，可加速糖尿病伤口的愈合[11]；相反，CXCL12拮抗剂在伤口愈合早期使用会显著阻碍伤口的愈合[12]，而局部应用CXCR4选择性激动剂可改善糖尿病小鼠的伤口愈合[13]。然而，慢性创面复杂的局部微环境，如高蛋白酶(如肽酶CD26)活性和持续炎症反应，使得外源性CXCL12在局部创面的生物转化率或生物利用度非常低，效果不显著[14]。
近年来，合成生物学的快速发展使得研究人员能够在模式菌中设计复杂的“遗传电路”改造宿主基因组，构建相应的基因工程菌并赋予其疾病靶向调节或治疗的新功能，具有很大的应用潜力和开发价值。乳酸菌等益生菌因其公认的安全性以及益生作用，使其成为非常重要且合适的底盘菌，常用于生物制药和转化医学等研究领域[15]。此外，乳酸菌能够利用其独特的代谢优势产生大量的乳酸，不仅可以维持局部酸性环境且能作为信号分子诱导巨噬细胞由M1向M2型极化[14]。本研究以植物乳杆菌WCFS1为宿主菌，利用合成生物学技术原理，鉴定并表征了该菌株的一套基于强组成型启动子P32(pgm)和lp_3050分泌信号肽的高效分泌表达系统。基于此，本研究构建了CXCL12基因工程菌Lpw-CXCL12，用于CXCL12的高效递送，并在小鼠糖尿病模型中评估了该工程菌促进慢性创面愈合的作用，以期为未来慢性创面的临床治疗提供新的思路和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 菌株与质粒克隆菌株大肠杆菌(Escherichia coli) Top10用LB液体或固体培养基有氧培养，恒温培养温度37 ℃，振荡培养转速200 r/min，红霉素抗性工作浓度为200 μg/mL，氨苄青霉素抗性工作浓度为100 μg/mL。植物乳杆菌WCFS1 (Lactobacillus plantarum WCFS1, Lpw)用MRS (DeMan, Rogosa and Sharpe)液体或固体培养基兼性厌氧静置培养，红霉素抗性工作浓度为10 μg/mL，培养温度37 ℃。pTRK892质粒购自Addgene，pMG36e质粒由本课题组保藏，pHSpBR256质粒由新加坡国立大学Shen等[16]构建，其余质粒均由本研究构建。本研究所用的菌株和质粒如表 1所示。
| Plasmids and strains | Descriptions | Source |
| Plasmids | ||
| pTRK892 | Ppgm-gusA expression cassette, pWV01 replicon, ErmR | Addgene |
| pMG36e | Shuttle plasmid of lactic acid bacteria, source of P32 promoter, ErmR | Lab store |
| pUC-GW-SPusp45-CXCL12 | AmpR, source of the codon-optimized tandem sequence of usp45 signal peptide and chemokine CXCL12 | Synthesized by GENEWIZ |
| pTRK892-P32(pgm) | pTRK892 plasmid was modified by replacing its original pgm promoter with the P32 promoter from pMG36e | This study |
| pTRK892-P32(pgm)-SPlp_3050 | The sequence of lp_3050 secretion signal peptide was inserted into the pTRK892-P32(pgm)-gusA plasmid | This study |
| pTRK892-P32(pgm)-SPusp45 | The sequence of USP45 secretion signal peptide was inserted into the pTRK892-P32(pgm)-gusA plasmid | This study |
| pHSpBR256 | p256 replicon, pBR322-derived ColE1 replicon, ErmR, AmpR, Ppgm-gusA expression cassette | [16] |
| pHS256-P32(pgm) | pHSpBR256 was modified by replacing its original pgm promoter with the P32 promoter from pMG36e | This study |
| pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12 | The tandem sequence of lp_3050 secretion signal peptide and CXCL12 gene was integrated into pHS256-P32(pgm) to replace gusA report gene | This study |
| pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12HiBit | The tandem sequence of lp_3050 secretion signal peptide and CXCL12 gene with HiBit tag was integrated into pHS256-P32(pgm) to replace gusA report gene | This study |
| pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12His | The tandem sequence of lp_3050 secretion signal peptide and CXCL12 gene with His tag was integrated into pHS256-P32(pgm) to replace gusA report gene | This study |
| Strains | ||
| Escherichia coli Top10 | Transformation host strain | Lab store |
| Lpw | Lactobacillus plantarum WCFS1 wild-type, chassis strain | Lab store |
| Lpw-SPlp_3050-gusA | Engineered L. plantarum WCFS1 with the pTRK892-P32(pgm)-SPlp_3050-gusA plasmid | This study |
| Lpw-SPusp45-gusA | Engineered L. plantarum WCFS1 with the pTRK892-P32(pgm)-SPusp45-gusA plasmid | This study |
| Lpw-SPlp_3050-CXCL12 | Engineered L. plantarum WCFS1 with the pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12 plasmid | This study |
| Lpw-SPlp_3050-CXCL12His | Engineered L. plantarum WCFS1 with the pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12His plasmid | This study |
| Lpw-SPlp_3050-CXCL12HiBit | Engineered L. plantarum WCFS1 with the pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12HiBit plasmid | This study |
采用SnapGene软件(www.snapgene.com, version 6.0.2)对拟构建的质粒进行模拟并设计相应的引物序列，引物退火温度(即Tm值)控制在55–60 ℃，合成后保存备用。本研究所用引物序列如表 2所示。
| Primers | Sequences (5ʹ→3ʹ) |
| P32-GA-F | AGAGATCTAATCGATGCATGCCATGGCGTTCGCTTGATAAATCTCCC |
| P32-GA-R | GATGATTTTCCTTTCTAGTAGAATTCCCGAATATTTTTTTACCTACCTAGTATAGC |
| SPlp_3050-GA-F | GAATTCTACTAGAAAGGAAAATCATCTATGAAAAAATTTAACTTTAAAACCATGTTGC |
| SPlp_3050-GA-R | GGATATAGTGCAGATTCCATCTTGGAGGCCTGGGC |
| SPlp_3050-GA-R2 | TATGACAAACTTACCGGTTTCTTGGAGGCCTGGGCG |
| gusA-GA-F1 | CCTCCAAGATGGAATCTGCACTATATCCAATTCAAAATA |
| gusA-end-GA-R | TCAGTGTATAAGCTTCTAGAGCGGCCGCTCTAGATGGATTCATCAGACTTAGTTG |
| SP-GA-F | GTAGGTAAAAAAATATTCGGGAATTCTACTAGAAAGGAAAATCATCTATGAA |
| SPusp45-GA-F | GAATTCTACTAGAAAGGAAAATCATCTATGAAGAAGAAAATCATATCCGCAA |
| SPusp45-GA-R | TTGGATATAGTGCAGATTCCATGGTATCGGCATATACACCACT |
| gusA-GA-F2 | CGATACCATGGAATCTGCACTATATCCAATTC |
| C12-GA-F | AAACCGGTAAGTTTGTCATATCGA |
| C12-GA-R | GCACGCGTGGAACCTCTAGACTGCAGTTATTTGTTTAAGGCCTTTTCTAAGTACTCTT |
| C12His-GA-R1 | GTGGTGGTGATGGTGTGAGCCACCACCACCTTTGTTTAAGGCCTTTTCTAAGTACTCTT |
| C12His-GA-R2 | GCACGCGTGGAACCTCTAGACTGCAGTTAGTGGTGGTGGTGATGGTGTGAG |
| C12HiB-GA-R1 | GCTAATCTTTTTAAACAAGCGCCAGCCACTAACTGAGCCACCACCACCTTTG |
| C12HiB-GA-R2 | GCACGCGTGGAACCTCTAGACTGCAGTTAGCTAATCTTTTTAAACAAGCGCCAG |
| 667-seq-F | ATACCGCTCTACTTGTATAATTAGAACA |
| 908-seq-R | CGTTGTATAAAATTGCGTCTTGA |
| gusA-200-R | CCAGTATAGTATTTACGGTCTCGCT |
| gusA-800-R | TCGTCAACTGTTTTTCCGTCTT |
| gusA-1400-R | ACAAAGTCACAAAGTGGGTGAA |
| p256-seq-R | CGGATTTGTCCTACTCAGGAGAG |
按照TaKaRa高保真聚合酶并按照使用说明书配制PCR扩增体系，即50 μL体系中含1–5 ng模板、0.2 μmol/L上/下游引物、25 μL 2×PrimeSTAR Premix和适量的ddH2O。PCR反应条件为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸(1 kb/min，时间视扩增长度调整)，25次循环；72 ℃终延伸2 min。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳及胶回收PCR反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分离，电泳条件为：120 V恒压，电泳30–50 min。电泳结束后，使用凝胶成像观察PCR产物的纯度和浓度。在相应DNA Marker位置切下目的扩增片段，采用Promega胶回收试剂盒(Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System)进行纯化。纯化后的扩增产物用NanoDrop 2000测定浓度，–20 ℃保存备用。
1.2.4 Gibson组装采用NEB公司Gibson组装试剂(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)将插入片段和线性化的质粒进行组装。10 μL反应体系中含5 μL Assembly Master Mix、50 ng线性化质粒、与质粒等摩尔数的插入片段以及无菌ddH2O。反应体系于50 ℃条件下反应15–30 min后全部转入E. coli Top10感受态细胞。
1.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒提取将活化好的大肠杆菌按1%接种比例接种至100 mL新鲜LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600为0.5–0.6左右，冰上静置10–15 min后，于4 ℃、3 000 r/min离心5 min后，收集菌体。菌体用25–30 mL预冷的60 mmol/L CaCl2溶液充分洗涤2次，离心温度和条件同上。最后，菌体用1 mL预冷的含15%甘油的60 mmol/L CaCl2溶液重悬，100 μL/管分装，–80 ℃保存备用。
取出感受态细胞置于冰上解冻，加入重组产物或者质粒，冰上孵育15–30 min。42 ℃热激45–60 s，置于冰上2–3 min。加入900 μL新鲜的LB液体培养基，37 ℃振荡培养，复苏1 h后涂LB抗性板。倒置培养观察菌落生长情况，挑若干单菌落进行菌落PCR鉴定。鉴定成功的单菌落继续扩大培养，采用Qiagen质粒小提试剂盒(Plasmid Miniprep Kit)提取质粒，送测序公司进行测序鉴定。测序成功后，–20 ℃保存质粒备用。
1.4 植物乳杆菌感受态的制备及电转化将活化好的植物乳杆菌按1%接种比例接种至100 mL MRS+2%甘氨酸液体培养基中，30 ℃静置培养至OD600为0.6左右，冰上静置10–15 min后，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，收集菌体。菌体用25–30 mL预冷的0.1 mmol/L MgCl2溶液充分洗涤2次，离心温度和条件同上。菌体再用25–30 mL预冷的30% PEG 1500洗涤2次，4 ℃、5 000 r/min离心5 min。最后，菌体用1 mL预冷的30% PEG 1500溶液重悬，100 μL/管分装，–80 ℃保存备用。
从–80 ℃超低温冰箱中取感受态置于冰上溶解，加入0.5–1.0 μg质粒，冰上孵育5–10 min后快速转移至预冷的电转杯中进行电转化，电转化条件为2.0 kV、400 Ω、25 μF，电转时间约为10 ms。电转结束后加入1 mL新鲜MRS培养基，37 ℃静置孵育2 h后取适量菌液涂布于含10 μg/mL红霉素抗性MRS固体培养皿中，37 ℃倒置培养1–2 d；挑单克隆至含10 μg/mL红霉素抗性的MRS液体培养基中扩大培养，制备相应的工程菌株后备用。
1.5 GusA酶活性的定性与定量分析制备含50 μg/mL X-GluC显色底物(CAS#114162-64-2)和红霉素抗性的MRS固体平板，取相应的菌株进行平板划线，37 ℃倒置培养，观察菌落及其周围是否变蓝，对分泌信号肽分泌能力进行定性分析。
将上述过夜培养后的各工程菌的OD600值用液体培养基调整至0.1左右，置于相应的培养温度下静置培养24 h，酶标仪测量各菌株的OD600用于后续计算分析。取10 μL培养液加入到含90 μL GusA反应缓冲液的96孔板中，并加入2.5 μL 0.1% SDS和5 μL氯仿，于37 ℃反应5 min以上。向反应体系中加入20 μL 50 mg/mL对4-硝基苯基-β-d-葡萄糖苷溶液(p-nitrophenyl-β-d-glucuronide, PNPG，CAS# 10344-94-2)，轻微混匀，置于37 ℃反应30 min后加入50 μL 1 mol/L碳酸氢钠溶液。离心去除细胞碎片后取100 μL上清至新的96孔板中，酶标板测定OD405吸光值。采用Miller units定量分析GusA酶活性，计算公式如公式(1)所示：
| $ \text{M}\text{iller}\;\text{units=}\frac{O{D}_{405}\times 1000}{O{D}_{600}\times 时间\text{(min)}\times 体积(\text{mL})} $ | (1) |
其中，时间为加入底物后的反应时间30 min，体积为0.1 mL。
1.6 趋化因子CXCL12分泌表达定性与定量分析 1.6.1 Western blotting检测His标签采用15%三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)沉淀发酵上清中的总蛋白，即10 mL发酵液(无细菌)中加入1.5 g TCA，低温反应2 h后，高速离心收集沉淀，用预冷的丙酮洗涤沉淀2次，晾干后获得总蛋白，–20 ℃保存备用。总蛋白经12% SDS-PAGE分离后，采用转膜仪将样本从凝胶转至PVDF膜中；采用膜用5%脱脂乳(溶解在1×TBST溶液中)室温封闭2 h后，用1×TBST反复洗涤3次，每次5 min；用His标签抗体(1︰1 000稀释)室温孵育1 h，1×TBST反复洗涤3次；用显色液进行显色和曝光检测。
1.6.2 HiBit标签定量检测CXCL12的分泌表达参考Promega公司的HiBit标签定量检测试剂盒(Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System)使用说明书，对发酵上清液中含HiBit标签的CXCL12进行检测，并制定标准曲线定量计算CXCL12HiBit的含量。
1.7 小鼠糖尿病慢性创面模型的构建及动物实验设计本研究动物实验方案已经通过南昌大学医学部实验动物伦理委员会和南昌大学实验动物科学中心的审批(批准号为NCULAE-20221228057)。
12只6–8周龄雄性C57BL/6小鼠购自南京科瑞斯动物有限公司。适应性喂养1周后，9只小鼠采用高脂饮食联合链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)注射进行Ⅱ型糖尿病(type Ⅱ diabetes, T2DM)造模，3只小鼠不做任何处理用作正常对照。造模过程中，小鼠给予高糖高脂饮食，持续8周；腹腔注射50 mg/kg/d STZ，持续5 d。随后测定小鼠空腹血糖，连续3次小鼠空腹血糖≥16.67 mmol/L视为已成功构建T2DM小鼠模型。所有小鼠麻醉后剪开背部约1 cm2全层皮肤，创建小鼠创面模型。正常小鼠创面用无菌生理盐水涂抹处理，视为正常对照组(C)。糖尿病创面模型小鼠随机分为3组，每组3只：(1) 模型组(M)，无菌生理盐水涂抹处理；(2) Lpw组(Lpw)，1×108 CFU植物乳杆菌WCFS1野生株Lpw涂抹处理；(3) Lpw-CXCL12组，1×108 CFU趋化因子CXCL12工程菌Lpw-SPlp_3050-CXCL12涂抹处理。每隔3 d拍照记录各组小鼠皮肤创面愈合情况，采用ImageJ软件统计各组小鼠创面面积及创面愈合率。创面愈合率计算公式如公式(2)所示：
| $ \begin{array}{c}伤口愈合率(\%)\text{=}\\ \frac{初始伤口面积-测定时伤口面积}{初始伤口面积}\times 100\end{array} $ | (2) |
所有数据均使用GraphPad Prism统计软件(Prism的第9版，https://www.graphpad.com/)进行分析。数据通过基于Shapiro-Wilk的正态性检验(P > 0.1)，采用普通单因素方差分析(ANOVA)结合Tukey多重比较，确定3组或3组以上组间的统计学差异。数据未通过正态性检验，采用基于Kruskal-Wallis检验的方差分析进行非参数检验，结合Dunn多重比较进行统计分析。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。*P < 0.05或**P < 0.01表示两组间的差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 质粒构建本研究所构建的质粒图谱如图 1所示。pTRK892质粒含pgm启动子驱动的gusA报告基因表达回路(terminator 667-Ppgm-gusA-terminator 908)、pWV01广谱性复制子、红霉素抗性基因EryR等核心结构元件，可在乳酸菌属中广泛使用[17]。在之前的研究中，Shen等[16]在植物乳杆菌中构建并表征了一套小型的组成型启动子文库，发现P32启动子结合pgm启动子的RBS序列较pgm原启动子相比，gusA报告基因在植物乳杆菌中的表达效率显著提高。本研究以pTRK892为基本骨架，采用NcoⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶双酶切使其线性化，纯化回收后与P32启动子扩增片段(引物P32-GA-F和P32-GA-R，片段大小328 bp)进行Gibson组装，用引物667-Seq-F进行测序鉴定，证明成功构建了pTRK892-P32(pgm)质粒(图 1A)。随后，以pTRK892-P32(pgm)质粒为骨架，使用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切线性化并回收；采用融合PCR在gusA报告基因(引物gusA-GA-F1/gusA-GA-F2和gusA-end-GA-R，大小约2 000 bp)的N端分别融合lp_3050基因信号肽(引物SPlp_3050-GA-F和SPlp_3050-GA-R，片段大小164 bp)和usp45信号肽(引物SPusp45-GA-F和SPusp45-GA-R，大小137 bp)，融合PCR引物为SP-GA-F和gusA-end-GA-R；将融合PCR产物与线性化的pTRK892-P32(pgm)质粒进行组装，经引物908-seq-R、gusA-1400-R、gusA-800-R和gusA-200-R测序鉴定后，成功构建质粒pTRK892-P32(pgm)-SPlp_3050 (图 1B)和pTRK892-P32(pgm)-SPusp45 (图 1C)。
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| 图 1 本研究所构建的质粒图谱 Fig. 1 Schematic diagrams of plasmids constructed in this study. A: pTRK892-P32(pgm); B: pTRK892-P32(pgm)-SPlp_3050; C: pTRK892-P32(pgm)-SPusp45; D: pHS256-P32(pgm); E: pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12His; F: pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12HiBit. SP: Signal peptide; His: 6×His tag; HiBit: HiBit tag. |
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含pWV01复制子的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒(如pTRK892、pMG36e等)在大肠杆菌中克隆异常困难，表现在构建周期长、质粒提取量低、测序困难等，造成克隆费时费力且不稳定。Shen等[16]也发现，在大肠杆菌中使用pTRK892构建分泌表达蛋白时容易发生突变而使蛋白失活。因此，他们采用植物乳杆菌特有的复制子p256替换了pTRK892中的pWV01复制子，并引入了AmpR抗性筛选基因和大肠杆菌pBR322高拷贝复制子，构建了一个基于p256复制子的窄宿主范围的质粒—pHSpBR256[16]。该质粒易于在大肠杆菌中进行克隆，其克隆效率高且稳定；由于p256复制子的效率在植物乳杆菌中较pWV01要弱，其GusA表达效率相对较差，但两者均能在植物乳杆菌中行使复制功能，均可用于植物乳杆菌的遗传操作[16-17]。将P32启动子片段插入到pHSpBR256质粒的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ位点，成功构建了pHS256-P32(pgm)质粒(图 1D)。将lp_3050信号肽(扩增引物SPlp_3050-GA-F和SPlp_3050-GA-R2)分别与趋化因子CXCL12基因(扩增引物C12-GA-F和C12-GA-R)、含C端His标签的CXCL12基因(扩增引物C12-GA-F和C12His-GA-R1)或含C端HiBit标签的CXCL12基因(扩增引物C12-GA-F和C12HiB-GA-R1)进行融合表达，融合表达引物分别为SP-GA-F和C12-GA-R、SP-GA-F和C12His-GA-R2、SP-GA-F和C12HiB-GA-R2。随后，将融合片段插入到pHSpBR256质粒的EcoRⅠ和PstⅠ位点，成功构建质粒pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12、pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12His (图 1E)和pHS256-P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12HiBit (图 1F)。
2.2 植物乳植杆菌WCFS1分泌系统的构建和表征本研究采用gusA报告基因，以X-GluC和PNPG作为效应底物，对比分析lp_3050的信号肽和usp45信号肽介导GusA的分泌表达能力(图 2A)。前者是植物乳杆菌WCFS1内源性的分泌信号肽，在多种乳杆菌中能介导外源基因的分泌表达[18]；后者是在乳酸菌分泌表达系统中常用的异源信号肽，源自乳酸乳球菌Usp45蛋白，广泛应用于乳酸菌分泌系统的构建[19]。将GusA底物X-Gluc添加到MRS琼脂平板中，工程化植物乳杆菌分泌表达的GusA切割琼脂平板中的X-Gluc，产生蓝色产物diHX-indigo，并使菌落周围的琼脂变蓝。可以根据菌落周围蓝色分泌圈的大小定性分析GusA的分泌表达效率，进而判断各分泌信号肽的效率。如图 2B所示，与植物乳杆菌WCFS1野生株(Lpw)相比，工程菌Lpw-SPlp_3050-gusA有明显的蓝色菌落及更大的周围蓝色圈，而工程菌Lpw-SPusp45-gusA菌落及其周围的蓝色圈都非常弱。GusA酶活性定量分析结果显示，工程菌Lpw-SPlp_3050-gusA发酵上清的GusA酶活力显著高于工程菌Lpw-SPlp_3050-gusA [(41 684.27±2 622.51) vs. (8 906.93±250.65)，P < 0.01]。因此较常见的usp45信号肽相比，lp_3050信号肽在植物乳杆菌WCFS1中具有更强的异源蛋白的分泌能力。
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| 图 2 lp_3050分泌信号肽介导的植物乳杆菌WCFS1蛋白分泌系统的鉴定 Fig. 2 Identification of lp_3050 signal peptide-mediated protein secretion system in Lactobacillus plantarum WCFS1. A: Schematic diagrams of GusA expression and secretion circuits. SP: Signal peptide; Rs: Residues. Dotted arrow with×mark represent the signal peptide cleavage sites. B: Validation of signal peptides-mediated GusA secretion. C: Detection of the GusA activities in the culture supernatant of engineered strains by GusA assay. Data were presented as mean±SD and calculated from three independent experiments. t-test was used for statistical analysis. **: P < 0.01. |
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基于植物乳杆菌分泌表达系统和pHSpBR256高效稳定的过表达质粒，将趋化因子CXCL12高效分泌表达回路P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12His和P32(pgm)-SPlp_3050-CXCL12HiBit (图 3A)，借助pHSpBR256质粒转入至植物乳杆菌WCFS1感受态细胞中，制备了相应的工程菌。Western blotting结果表明，与Lpw相比(图 3A，泳道4)，随机挑选的3个Lpw-SPlp_3050-CXCL12His工程菌发酵上清中均检测到明显的His标签信号(图 3A，泳道1−3)，表明CXCL12因子在该系统中可稳定地分泌表达。HiBit定量标签检测结果也显示，工程菌Lpw-SPlp_3050-CXCL12HiBit发酵上清中CXCL12HiBit含量高达(13.40±0.20) μg/mL。这些结果表明已经成功构建了高效稳定的工程化植物乳杆菌用于递送趋化因子CXCL12。为了避免信号标签对CXCL12活性的影响，随后去掉了His和HiBit标签，构建了CXCL12工程菌Lpw-SPlp_3050-CXCL12 (Lpw-CXCL12)用于后续的慢性创面治疗。
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| 图 3 高效分泌表达趋化因子CXCL12工程菌的构建和表征 Fig. 3 Construction and characterization of the engineered strain for efficiently expressing and secreting chemokine CXCL12. A: Schematic diagrams of CXCL12 expression and secretion circuits. SP: Signal peptide; Rs: Residues. Dotted arrow with × mark represent the signal peptide cleavage site. B: Detection the secreted CXCL12 with his tag in the culture supernatant of engineered strain by Western blotting. M: TrueProTM Pre-stained Protein Ladder; Lane 1−3: The supernatant samples of randomly three engineered colonies; Lane 4: The supernatant sample of L. plantarum WCFS1. C: Quantification analysis of the content of secreted CXCL12 with HiBit tag in the culture supernatant of engineered strain. Data were presented as mean±SD and calculated from three independent experiments. |
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采用高脂饮食结合STZ成功诱导了小鼠T2DM，并在此基础上构建了慢性创面小鼠模型，用于评估Lpw-CXCL12在慢性创面愈合中的治疗作用。结果如图 4所示，M组创面在第3天、第6天、第9天和第12天的愈合率分别为(18.11±7.14)%、(40.15±8.16)%、(51.19±9.04)%、(75.16±86.19)%，显著低于正常对照组的(37.44±8.33)% (P < 0.05)、(73.40±4.81)% (P < 0.01)、(82.68±2.60)% (P < 0.01)、(93.07±3.54)% (P < 0.01)，表明T2DM创面愈合能力显著降低，表现为慢性创面。与M组创面愈合率相比，Lpw野生菌治疗虽然能够轻微地促进慢性创面愈合，但效果不显著(P > 0.05)；而用Lpw-CXCL12工程菌治疗后，慢性创面在第3天、第6天、第9天和第12天的愈合率分别可达(49.45±3.60)%、(74.00±5.91)%、(88.24±4.31)%、(94.91±0.95)%，显著高于M组和Lpw组的创面愈合率(P < 0.05)。特别在慢性创面愈合初期(第3天)，Lpw-CXCL12工程菌治疗组的创面愈合率甚至高于正常对照组[(49.45±3.60)% vs. (37.44±8.33)%，P=0.197 3]。
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| 图 4 趋化因子CXCL12工程菌Lpw-CXCL12对糖尿病小鼠慢性创面愈合的影响 Fig. 4 Effects of the Lpw-CXCL12 engineered strain on the chronic wound healing in T2DM mice. A: Representative diagrams of chronic wound healing in each group. B−E: Statistical analysis of the wound healing rate on day 3, day 6, day 9, and day 12, respectively. C: Mice in the normal control treated with saline; M: Mice in the chronic wound model group treated with saline; Lpw: Mice in the chronic wound model group treated with L. plantarum WCFS1 wild-type strain; Lpw-CXCL12: Mice in the chronic wound model group treated with the Lpw-CXCL12 engineered strain. Data were presented as mean±SD, n=3. No data mark indicates there was no significant difference between the two groups (P > 0.5). |
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植物乳杆菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，属兼性厌氧菌，在食品发酵工业中广泛应用，是公认的安全食品级益生菌，具有重要的促健康作用。这种微生物存在于许多生态位中，包括发酵食品、腐烂的植物基材料以及肠道菌群中，表明其能适应并存活于不同极端环境。作为模式菌株，植物乳杆菌WCFS1的全基因组测序已经完成，便于后续功能研究及其遗传操作工具的开发[18, 20]。植物乳杆菌潜在的益生性能和极端环境适应性使其可作为一种非常有前途的宿主菌或底盘菌，用于构建药物原位递送以及合成生物学研究。
细菌的蛋白分泌系统对细菌的生存、繁殖及其与环境互作至关重要。通常情况下，细菌可借助多种途径将在胞质中合成的蛋白转运至细胞膜、细胞壁或外界环境中，如Sec依赖分泌途径(经典分泌途径)、Tat依赖途径(双精氨酸易位途径)和ABC转运元件依赖途径等[21]。在Sec依赖途径中，分泌蛋白前体借助其N-端信号肽的指引作用完成转运或异位过程，随后信号肽在转运期间或转运后会被信号肽酶切除。在植物乳杆菌WCFS1的基因组中，超200个基因预测编码含N-端信号肽的蛋白质，其中约100种蛋白质的信号肽含有潜在的信号肽酶Ⅰ切割位点，可潜在介导蛋白质的胞外分泌或细菌表面展示[20]。Mathiesen等[18]以葡萄球菌核酸酶NcuA作为报告基因，系统表征了植物乳杆菌WCFS1基因组的分泌信号肽，共鉴定出76个具有不同分泌效率的信号肽，其中SPlp_3050的分泌效率最高。本研究基于之前已发现的强组成型启动子P32(pgm)[16]，将SPlp_3050和SPusp45分别与gusA报告基因融合，构建P32(pgm)-SPlp_3050-gusA和P32(pgm)-SPusp45-gusA分泌表达回路(图 1和图 2)，对比分析了这2种信号肽在该菌中驱动GusA分泌表达的效率，进一步证实了P32(pgm)-SPlp_3050的强分泌表达效率。此外，构建的工程菌与野生菌相比，其生长能力无明显差异(数据待发表)，表明趋化因子CXCL12的分泌表达不会给宿主菌带来代谢负担而影响其发酵性能。
创面愈合过程可分4个相互重叠的时期，即凝血期、炎症期、增殖期和重塑期。正常伤口的愈合级联依赖生长因子、基质金属蛋白酶、细胞因子、炎性细胞、成纤维细胞和内皮细胞等协调同步[22]。但在糖尿病创面中，因组织缺血、缺氧和感染等内外部因素导致创面微环境的不良改变，使愈合进程滞留在炎症期而无法正常愈合形成慢性创面[23]。趋化因子CXCL12是维持正常皮肤结构和功能、保持自身稳态的重要趋化因子，而且在调节创伤后皮肤血管生成和促进再上皮化过程中起重要作用。研究发现，糖尿病创面持续的慢性炎症反应会形成一个高度蛋白水解(如肽酶CD26)、过度氧化应激的病理微环境，使得外源性CXCL12等细胞因子的直接使用或与不同的生物材料结合(如水凝胶)使用在局部创面的生物转化率或利用度非常低，迄今为止疗效不佳[24]。
Vågesjö等[14]以罗伊氏乳杆菌为底盘菌，制备了CXCL12工程菌局部应用于高血糖和外周缺血小鼠模型的伤口愈合，证实了基因工程菌递送CXCL12加速慢性创面愈合的可行性；但是该工程菌分泌表达CXCL12依赖于SppIP肽的诱导，会对乳酸菌自身的生长代谢产生负担并对机体细胞产生潜在的毒副作用，具有一定局限性。本课题组前期采用组成型启动子构建了CXCL12工程化乳酸乳球菌，表明其可加速小鼠烧烫伤伤口的愈合，但CXCL12的分泌表达量有限[25]。本研究基于上述开发的植物乳杆菌WCFS1高效分泌表达系统，构建了CXCL12工程益生菌Lpw-CXCL12，CXCL12分泌表达量可达13.40 μg/mL，实现了外源性CXCL12的高效递送(图 3)。在糖尿病慢性创面小鼠模型中，该工程菌可显著提高趋化因子CXCL12在局部创面的含量(数据未发表)，同时表现出加速慢性创面愈合的效果(图 4)。此外，植物乳杆菌代谢产生的乳酸不仅可以维持局部酸性环境，降低肽酶CD26活性，从而提高CXCL12的利用率，而且其还能作为信号分子诱导巨噬细胞由M1向M2型极化，从而促进创面愈合[25]。
本研究以植物乳杆菌WCFS1为底盘菌，开发一套基于组成型启动子P32(pgm)和分泌信号肽SPlp_3050的高效分泌表达系统；构建了CXCL12工程菌，使其分泌表达量显著提升；并进一步证实了通过工程益生菌局部持续高效递送趋化因子CXCL12，可以有效地加速糖尿病慢性创面愈合。本研究可为未来工程菌活菌平台开发用于糖尿病等慢性创面的临床治疗提供新的思路和技术手段。
致谢: 感谢新加坡国立大学合成生物学协同创新中心主任Matthew Chang教授、沈浩晟博士等在质粒构建和植物乳杆菌遗传操作体系开发过程中给予的建议和指导。
作者贡献声明
李胜杰：方案设计、实验操作、数据管理、初稿写作、经费支持；苏慧娟、李晓婷：实验操作、数据管理、初稿写作；魏静：提供材料；陈廷涛：方案设计、监督指导、稿件润色修改、经费支持。
作者利益冲突公开声明
作者声明没有任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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