肠道是人体中最大的消化吸收和免疫器官，与健康状态密切相关。肠道内定殖微生物的数量约为10¹³–10¹⁴个^[1]，这些微生物维持着肠道的微生态平衡，广泛参与宿主的神经、生理、代谢、免疫等生理活动，被认为是调节宿主健康的关键因素之一^[2]。肠道微生物紊乱可以引发多种疾病，包括肥胖症、Ⅱ型糖尿病、脂肪肝、炎症性肠病等^[3-4]。

随着基因组学和代谢组学等高通量实验技术的发展，研究人员得以深入探索宿主与肠道微生物之间的复杂相互作用机制。基于伦理和安全方面的考虑，小鼠作为模式动物在肠道菌群研究中应用越来越广泛^[5]。然而，尽管小鼠肠道微生物的多样性与功能潜力巨大，但目前对其结构和组成，特别是对可培养菌株的系统性分离培养研究仍存在不足，人类起源的微生物在小鼠肠道中的定殖和功能发挥仍存在着诸多问题^[6-7]，因此对于小鼠模型肠道微生物的分离培养和鉴定势在必行。

自1970年厌氧技术的开发利用以来，小鼠肠道厌氧菌的分离工作取得了显著进展，但由于传统方法的局限性，多数研究仍停留于细菌表型研究^[7]。随着分子生物技术的进步，特别是大规模测序的应用，研究人员得以发现大量过去无法获得的未知微生物，实现对分离菌株的精确分类与鉴定。近年来，多个研究团队致力于构建小鼠肠道菌株资源库。如2016年德国慕尼黑理工大学构建的miBC^[8]和2020年本团队构建的mGMB^[9]，使得可培养的小鼠肠道微生物菌株资源增加到180个种，110个属^[10]。尽管小鼠肠道菌株资源库的建设取得了显著成就，但仍有超过70%的小鼠肠道微生物处于未培养状态^[9]，研究人员需要持续努力，探索新的培养技术和方法，以扩大可培养菌株的范围，为开发新型功能益生菌、预防和治疗相关疾病提供有力支持。

群体感应(quorum sensing, QS)是细胞间通信的一种关键机制，微生物以种群密度依赖的形式分泌特定的信号分子参与一系列生理代谢活动^[11-12]。群体感应最早在费氏弧菌(Vibrio fischeri)的生物发光调控中被发现，之后，依赖于群体感应的基因调控陆续在不同类型的细菌中被发现，包括驻留在胃肠道中的肠道微生物^[13]。群感效应信号因子主要分为4类，革兰氏阴性菌中的酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine lactone, AHL)和自诱导剂-3 (autoinducer-3, AI-3)，革兰氏阳性菌中的自诱导多肽(autoinducing polypeptide, AIP)，以及在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中都有发现的自诱导剂-2 (autoinducer-2, AI-2)^[14-15]。

2019年，付凯飞等^[16]的研究表明，小鼠腹腔注射AHL后，其十二指肠及空回肠部位的肠道菌群多样性增加。本研究尝试在传统培养基中添加外源AHL类信号分子十二烷酰-l-高丝氨酸内酯(N-dodecanoyl-l-homoserine lactone, C12-HSL)分离小鼠肠道微生物，以期提高小鼠肠道中难培养革兰氏阴性菌和受群感效应调控菌种的分离培养效率，丰富小鼠肠道菌株资源库。

1 材料与方法 1.1 培养基配制

改良Gifu厌氧培养基(modified Gifu anaerobe media, mGAM)：改良GAM肉汤60 g，d-甘露糖0.5 g，d-果糖0.5 g，d-半乳糖0.5 g，d-海藻糖0.5 g，d-纤维二糖0.5 g，菊糖0.5 g，帕拉金糖0.5 g，l-鼠李糖0.5 g，精氨酸0.5 g，色氨酸0.3 g，碳酸氢钠2 g，乙酸钠2.46 g，瘤胃液50 mL，刃天青1 mL，氯化血红素5 mL，琼脂粉15 g，加水定容至1 L，pH调至7.2。115 ℃灭菌25 min，灭菌后冷却至60 ℃，在超净工作台中加入2.5 mL 0.02%维生素K1、500 μL Wolfe’s维生素溶液、500 μL Wolfe’s矿物质溶液，冷却至50 ℃后加入50 mL羊血，添加C12-HSL使终浓度为20 mg/L，混匀后倒平板。

YCFA培养基：酪蛋白10 g，酵母提取物2.5 g，碳酸氢钠4 g，氯化钠0.9 g，磷酸氢二钾0.45 g，磷酸二氢钾0.59 g，七水合硫酸镁0.01 g，氯化钙0.119 g，葡萄糖2.0 g，刃天青1 mL，氯化血红素5 mL，l-半胱氨酸0.5 g，琼脂粉15 g，加水定容至1 L，pH调至7.2。115 ℃灭菌25 min，冷却至50 ℃后添加C12-HSL使终浓度为20 mg/L，混匀后倒平板。

1.2 肠道微生物分离培养

在厌氧工作台中取小鼠盲肠内容物样品悬浮于含0.1%半胱氨酸的PBS缓冲液中，使用细胞筛去除悬浮液中的大颗粒不溶性物质得到样品原液。将样品原液依次梯度稀释至不同浓度，取100 µL不同浓度的稀释液分别涂布于固体培养基上，涂布后的平板倒置放入厌氧培养袋中，放入除氧包，密封后置于37 ℃培养。培养5–20 d后在厌氧工作台中挑取可见单菌落进行PCR测序。本实验经山东大学生命科学学院实验动物伦理审查委员会批准(批准号：SYDWLL-2022-086)。

1.3 PCR测序

挑取单菌落到4 μL裂解液中，充分吹打后加入60 μL ddH₂O，98 ℃裂解30 min作为DNA模板。30 μL PCR反应体系：1 μL上游引物(10 μmol/L)；1 μL下游引物(10 μmol/L)；15 μL 2×PCR MasterMix；11 μL ddH₂O；2 μL DNA模板。

PCR扩增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序和序列拼接。利用EzBioCloud (EzBioCloud.net|Search about Bacteria or Archaea)进行在线比对分析。

1.4 菌种保藏

(1) 固体斜面保藏

将新鲜菌液接种在厌氧固体斜面培养基上，37 ℃培养长出菌落后，于常温下保藏。

(2) 甘油保藏

按照40%甘油：菌液=1:1的比例混合加入保种管中，密封于厌氧培养袋中–80 ℃保存。

(3) 冷冻干燥保藏

取新鲜菌液离心得到菌体，加入300 µL冷冻干燥保护液，充分吹打混匀后转移至保种管，冷冻干燥后常温保存。冷冻干燥保护液配制：50 g/L脱脂奶粉、30 g/L乳糖、20 mL/L甘油，抽换气后113 ℃灭菌15 min，冷却后4 ℃保存。

1.5 细菌基因组提取和测序分析

按照细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]说明书提取细菌DNA，送样至广东美格基因科技有限公司，使用Illumina测序平台进行基因组测序和组装。使用ANI Calculator (https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)计算基因组平均核苷酸相似度(average nucleotide identity, ANI)。使用Genome-to-Genome Distance Calculator (gdc.dsmz.de/ggdc.php)计算DNA-DNA杂交值(digital DNA-DNA hybridization, dDDH)。使用BLASTp计算保守蛋白百分比(percentage of conserved proteins, POCP)。

1.6 细菌的系统进化分析

使用MEGA 7构建系统发育树。将所有细菌的16S rRNA序列保存为txt文本文件，打开MEGA点击Edit/Build Alignment，依次点击“Create a new alignment” “DNA”，点击“Open图标”选择fasta文件打开，选择“Alignment/Align by ClustalW”，采用默认的选项运行，选择“Data”→“Export alignment”→“MEGA Format”，选择“neighbor-joining tree”构建系统发育树，保存后导入iTOL (https://itol.embl.de/)进行美化。

1.7 细菌形态鉴定

将菌株涂布于mGAM固体培养基上，37 ℃培养长出单菌落后，观察并记录细菌的菌落形态。采用负染色法使用透射电子显微镜观察细菌的超微结构，将磷钨酸和单菌落混合稀释后滴在载网上，样品通过挥发干燥使染色剂固定在样品周围及可能的部分内部空隙中，最后在透射电镜下观察细菌的超微结构。

1.8 细菌碳氮源利用分析

使用Biolog AN MicroPlates检测细菌对95种碳氮源的利用情况。将待测菌株培养至平台期，在米开罗那厌氧台中取2 mL菌液，6 000 r/min离心5 min去上清，加入1 mL接种液使沉淀重新悬浮，重复洗涤3次。最后取适量菌体到15 mL接种液中，充分混合后按照每孔100 μL接种到AN MicroPlates，放入厌氧袋37 ℃孵育1–3 d，使用酶标仪进行分析。

1.9 C12-HSL对细胞密度的影响

将过夜培养的M00047菌株以1:100 (体积比)的比例分别接种到添加不同浓度C12-HSL的培养基中。37 ℃培养，每1 h记录1次细胞密度。

1.10 核酸序列编号

54株菌的16S rRNA基因序列和菌株M00047的基因组序列已提交至国家微生物科学数据中心，登录号为NMDC10019040。

1.11 数据分析

使用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析和绘图。使用单因素方差分析检验数据的统计学显著性，P < 0.05被认为具有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 肠道微生物的分离培养

本研究共挑取了331个单克隆，分离纯化出235株可培养细菌，通过16S rRNA基因测序鉴定及系统发育分析，这235株菌分属于5门9纲19科和54种(图 1A)，包含1个潜在新科、4个潜在新属、4个潜在新种，与实验室前期分离得到的mGMB小鼠肠道菌株资源库相比^[9]，增加了42个新物种，丰富了可培养小鼠肠道菌株资源。

在门水平上(图 1B)，厚壁菌门(Firmicutes)数量仍然占有主导地位(27种)，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes) (17种)、变形菌门(Proteobacteria) (7种)、放线菌门(Actinobacteria) (2种)和疣微菌门(Verrucomicrobia) (1种)；在纲水平上(图 1C)，拟杆菌纲(Bacteroidia)和梭菌纲(Clostridia)是丰度最高的两个纲，分别是17种和18种，其次是芽孢杆菌纲(Bacilli) (5种)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria) (5种)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia) (4种)，而其他4个纲β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、红椿菌纲(Coriobacteriia)、放线菌纲(Actinomycetia)和疣微菌纲(Verrucomicrobiae)丰度较低，仅获得1–2种。在属水平上，属于拟杆菌纲的拟杆菌属(Bacteroides)为主导优势，包含7个种，占比12.5%。埃希氏菌属(Escherichia)、粪杆菌属(Faecalicatena)、副拟杆菌属(Parabacteroides)各有3个种，其他菌属仅分离得到1种。以上结果表明，加入群感效应因子成功丰富了小鼠肠道可培养细菌的多样性。

2.2 外源添加群感效应分子促进革兰氏阴性菌的分离效率

在使用未添加C12-HSL的培养基进行微生物分离时，革兰氏阴性菌仅分离到7种，占总分离数的16% (图 2A)，当在分离过程中引入外源C12-HSL后，革兰氏阴性菌的分离比例显著提升至48% (图 2B)，这一结果表明外源添加C12-HSL后可以显著增加革兰氏阴性菌的分离效率。特别值得注意的是，在未添加C12-HSL时没有分离到变形菌门(Proteobacteria)细菌，在添加C12-HSL后这一比例显著增加到13.5%，说明C12-HSL作为变形菌门中许多细菌用于群体感应的关键信号分子，可能通过激活这些细菌中的信号转导途径，促进细菌的生长和繁殖。

2.3 潜在新菌的鉴定与描述

群感效应是细菌间的一种关键通讯机制，可以通过影响细胞密度促进细菌生长。通过分析这些肠道微生物的基因组数据，并结合KEGG数据库的注释结果，发现菌株M00047的基因组中存在与群感效应相关的基因，接下来首先对菌株M00047进行了简易多相分类学鉴定，包括系统进化分析、形态描述、碳氮源利用偏好以及基因组分析。

与菌株M00047亲缘关系最近的是人肠道慢生人体杆菌(Lentihominibacter hominis)^[9] (图 3A)。L. hominis与菌株M00047的16S rRNA相似度为91.32%，DNA G+C含量相差5.79%。M00047基因组DNA的G+C含量为45.79%。L. hominis和M00047的dDDH值和ANI值分别为22.70%和70.24%，POCP值为46.33%，表明L. hominis和菌株M00047属于不同的属。透射电镜观察其细胞形态是棒状(长6.5–7.5 μm，宽0.5–0.8 μm)，具有簇状鞭毛(图 3B)。培养3 d后，在mGAM琼脂平板上会出现微小、轻微隆起的半透明菌落。生长温度范围为30–37 ℃，pH值范围为7.0–7.5。菌株可以利用d-纤维二糖、d-果糖、d-半乳糖、d-半乳糖醛酸、龙胆二糖、α-d-葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、α-d-乳糖、d-甘露糖、d-麦芽糖、3-甲基-d-葡萄糖、帕拉金糖、松二糖、l-缬氨酸、甘露糖胺、糊精、d-蜜三糖、乙醛酸、α-酮戊酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-缬氨酸和l-天门冬氨酸。

2.4 外源添加C12-HSL分子促进细菌生长

为了探究C12-HSL这一群体感应信号分子是否可以促进M00047的生长，向培养基中添加不同浓度的C12-HSL，随后检测在不同时间点培养液的吸光度(OD值)，以监测M00047生长动态。实验结果表明，与未添加C12-HSL的对照组相比，在C12-HSL浓度为10 μmol/L时，并未观察到细胞密度增加。然而，当C12-HSL浓度提升到20 μmol/L时，实验组培养液细胞密度显著增加，且随着C12-HSL浓度进一步增加，细胞密度的增加越明显，这表明C12-HSL在一定浓度范围内，能够有效促进M00047菌株的生长(图 4B)。进一步分析生长曲线，发现对照组细菌在培养6 h后进入对数生长期，而在加入50 μmol/L C12-HSL的条件下，细菌提前至5 h时便进入对数生长期，这表明C12-HSL不仅直接促进了细菌生长，还提高了其生长速率(图 4A)。这一结果与在肠道微生物分离培养实验中观察到的现象相吻合，即固体培养基中添加71 μmol/L的C12-HSL时，能够有效促进受群体感应调控的细菌生长。

为了进一步证明C12-HSL对细菌生长的促进作用以及其有效浓度范围，使用YCFA培养基重复了上述实验。实验结果显示，与对照组相比，C12-HSL浓度大于20 μmol/L时依然可以显著促进M00047生长(图 4D)，且在C12-HSL浓度达到200 μmol/L的条件下，M00047菌株的生长速率明显加快，提前1 h进入对数生长期(图 4C)。然而，在高浓度C12-HSL (如300 μmol/L)的作用下，M00047的生长却受到显著抑制，稳定期的细胞密度显著降低(图 4D)，表明C12-HSL的调控作用并非简单的线性关系，而是存在一个最优浓度范围。

3 讨论与结论

近年来，群感效应作为微生物群体行为调控的核心机制，研究热度持续攀升，应用领域也在迅速扩大^[17]。特别是在营养成分有限的复杂肠道微生物环境中，群感效应机制不仅调控着细菌的生长与竞争，还对宿主与微生物群之间的平衡产生深远影响^[18-19]。

微生物中存在多种与群感效应有关的信号分子，它们在细菌密度调控中起到了重要作用，例如Li等^[20]的研究发现外源添加AHLs可以明显加速从变质冷藏大菱鲆中分离出来的温和气单胞菌(Aeromonas sobria) AS7菌株的生长速度，增加其细菌密度。在另外一项研究中，针对厌氧单胞菌JQ1004生长缓慢的情况，低浓度的外源AHLs可以显著促进JQ1004的生长，使JQ1004的生长滞后时间缩短，提前进入对数生长阶段，而添加高浓度的外源AHLs则会抑制菌株的生长^[21]。除此之外，AHLs在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生物膜形成中也表现出非线性作用，尽管AHLs能促进生物膜形成，但这种促进作用并未随着其浓度的增加而持续增强，当AHLs浓度超过某一阈值时其生物膜的形成反而受到限制^[22]。根据文献报道，特定浓度范围的外源AHLs对革兰氏阴性菌细胞密度的积极影响的机制可能包括以下3方面：(1) 当AHLs浓度达到特定阈值时能够与特定革兰氏阴性菌中的相应受体LuxR蛋白特异性结合，形成活性二聚体，进而调控与细胞密度相关的特定基因表达，促进细菌的生长和密度增加^[23]；(2) 外源AHLs浓度的增加降低了内源细菌之间的竞争，提前激活群感效应阈值诱导细菌进入对数生长期，加速细菌生长；(3) 细菌可以直接利用外源的AHLs作为碳源或能源，减轻了形成AHLs所需的物质和能量代谢负担，更有利于细菌生长^[24]。目前通过外源性添加AHLs促进肠道微生物生长的应用探索仍显不足，对这一领域的研究具有重要的科学意义，不仅有助于分离那些在传统条件下难以生长的革兰氏阴性菌，也为深入解析肠道菌群与宿主健康之间的相互作用机制开辟了新视野。

本研究利用添加C12-HSL的培养基对小鼠肠道内容物进行菌株分离培养和新物种鉴定，共获得331个分离株，通过16S rRNA测序初步鉴定出54种菌，其中包含9个首次分离培养的潜在新分类单元，为药物研发和临床应用提供了新的候选菌株。与实验室前期建立的小鼠肠道微生物菌株资源库mGMB相比，42个菌种为本研究的新增物种，丰富了菌库中可培养菌种的多样性，通过该方法分离获得的革兰氏阴性菌比例，特别是变形菌门的比例显著高于未添加C12-HSL的普通分离培养方法，这一发现揭示了群感效应因子在促进特定微生物类群生长中的关键作用。随后，通过基因组分析发现1个新菌种含有与群感效应相关的基因，并且体外培养实验表明，外源C12-HSL在特定浓度范围内能够显著促进其生长，加速其生长速率，然而过高浓度的C12-HSL则导致稳定期的细胞密度下降，表明AHL的作用存在浓度依赖性，为群体感应信号分子在细菌生长调控中的潜在应用提供了有力证据，同时也为调控肠道微生物群落结构、促进宿主健康提供了新的策略与思路。

作者贡献声明

王长钰：方案设计、实验操作、初稿写作；赵庆华：数据管理、实验操作；刘畅、刘双江：经费支持、监督指导、稿件润色修改。

作者利益冲突公开声明

作者声明没有任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。