肠道菌群作为人体微生物组的重要组成部分，与人体健康的关系极为紧密^[1]。它们参与人体的营养代谢、免疫调节以及抵御病原体入侵等诸多生理过程^[2]。研究表明，肠道菌群的失衡与多种慢性疾病如肥胖^[3]、糖尿病^[4]、心血管疾病^[5]以及某些肠道疾病的发生发展密切相关。维持肠道菌群的平衡和健康，对于提高人体整体健康水平具有关键作用^[6]。

在影响肠道菌群的众多因素中，膳食是核心要素之一^[7]。不同的膳食成分能够为肠道微生物提供各异的营养底物，从而显著影响肠道菌群的组成、结构和功能。例如，膳食纤维可被肠道有益菌发酵利用，产生短链脂肪酸，对肠道健康产生积极影响^[8]；而高脂高糖饮食则可能导致肠道菌群失调，增加疾病风险。然而，尽管膳食对肠道菌群的重要性已得到广泛认可^[9]，但目前对于衡量各种膳食因子对肠道菌群的健康调节效果，仍缺乏系统评估。

过往研究中，虽已开发出多种肠道菌群健康评估方法，但针对膳食因子调节效果的评估仍存在不足。已开发的肠道菌群健康指数^[10-11]主要用于综合评价肠道菌群健康状况，却难以直接用于精准评估不同膳食因子的作用。这使得在制定个性化膳食干预策略以改善肠道菌群健康时，缺乏足够的科学依据和有效的工具。

本研究以此为切入点，旨在深入评估膳食因子对超重人群肠道菌群的调控效果。通过开展17种膳食因子的体外发酵实验，创新性地运用基于主成分分析的肠道菌群健康指数(health index with principal component analysis, hiPCA)^[11]，构建膳食因子潜在健康调控效果评估方法。本研究不仅能揭示不同膳食因子对超重人群肠道菌群的影响，还能为改善人群肠道菌群健康、制定精准的膳食干预方案提供理论支持和实践指导，推动精准营养领域的创新发展。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及设备

实验所用培养基为改良岐阜培养基(modified Gifu anaerobic medium, mGAM)，购自青岛日水生物技术有限公司。培养基主要成分及含量详见表 1，配制方法严格依照说明书进行。膳食因子信息见表 2，购自扬州市博睿糖生物技术有限公司。为全面评估其对超重人群肠道菌群的调控作用，实验选取膳食多糖^[12]、多酚化合物^[13-14]及萜类物质作为研究对象。所选膳食因子均为无毒无害的可食用物质且经过纯化处理。主要试剂包括维生素K1溶液、蛋白胨、消化血清粉、牛肝浸出粉和氯化血红素溶液，均购自上海创赛科技有限公司。

实验主要设备包括ME-T精密天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、MS3旋涡振荡器(艾卡仪器设备有限公司)、GR60DA立式蒸汽灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)、5415型冷冻高速离心机(艾本德股份公司)以及DG250厌氧工作站(Don Whitley Scientific有限公司)。

1.2 体外发酵粪便接种液收集与处理

体外发酵接种物来自人群粪便样本。随机采集来自5名超重志愿者的粪便，志愿者的身体状况满足以下条件：身体质量指数(body mass index, BMI)处于25–30之间，满足超重界定；无明显肠道疾病、心脑血管疾病史；近3个月内未服用抗生素、益生菌或其他药物，避免干扰肠道菌群；年龄在18岁以上等。志愿者粪便的采集过程严格按照要求进行。志愿者将新鲜粪便排入专用采集管，操作中严格避免混入尿液，以保障样本纯净。采集管放入含厌氧袋的密封袋，确保粪便样本处于完全厌氧环境，维持微生物活性，保存备用。

收集的粪便样本等比例均匀混合，按1:10的比例与无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline, PBS)混合制成均质悬浮液，经4层无菌纱布过滤后即得体外发酵粪便接种液。

1.3 体外发酵实验方法

精准配制mGAM培养基和其他试剂进行灭菌。待灭菌完成，向孔板中分别加入1.6 mL包含原mGAM培养基以及以17种不同膳食因子替换碳源的培养基，其中多糖添加量为5 mg/mL，多酚化合物和萜类物质添加量为0.1 mg/mL。取0.4 mL混合均匀的粪便接种液接种到含不同膳食因子的培养基。随后，将接种后的培养基置于厌氧环境发酵24 h。发酵结束后将发酵液转移至2 mL无菌离心管，以10 000 r/min的转速离心10 min，实现上清液和菌泥的分离。最后，用PBS清洗菌泥并离心，重复3次以保证菌泥纯净，再将清洗后的菌泥放入–80 ℃冰箱长期保存。

1.4 体外发酵样本宏基因组测序及分析方法

为深入探究不同膳食因子对超重人群肠道菌群产生的影响，本研究将体外发酵实验获取的菌泥用于宏基因组测序分析。为有效保证宏基因组上游分析流程的高度一致性，最大程度降低因方法差异引发的异质性问题，宏基因组分析全程严格遵循hiPCA数据集所采用的方法与步骤^[11]。

在具体操作过程中，首先借助KneadData v0.5.1质量控制工具对肠道宏基因组数据序列展开读取工作，精准去除其中低质量的序列以及源自人类宿主的序列，由此成功获取经过质量控制后的肠道宏基因组序列数据。运用MetaPhlAn2软件将上述肠道宏基因组序列数据细致分类至物种水平，进而确定出单个样本的物种相对丰度表。在此基础上，仔细删除物种相对丰度表中存在的病毒以及无法识别的物种，并重新实施标准化处理。最终将所有样本进行整合，顺利获得涵盖全部样本的物种相对丰度表。

1.5 基于hiPCA的膳食因子评估方法

肠道菌群宏基因组数据普遍具有高维性与稀疏性的特点^[15]，这使得对其进行有效解释面临较大挑战。鉴于此，主成分分析(principal component analysis, PCA)作为一种常用方法，被广泛应用于肠道宏基因组数据的降维处理，目的是最大程度地保留数据中的关键信息。本课题组前期研究已运用PCA对肠道宏基因组数据进行建模，构建出相应的协方差矩阵。在此基础上，对协方差矩阵实施特征分解，获取特征值与特征向量。依据特征值挑选出主成分子空间(principal component subspace, PCS)以及残差子空间(residual subspace, RS)的特征值和特征向量，进而利用这些数值构建肠道菌群健康指数^[11]。

当hiPCA判定个体处于不健康状态时，需识别出相较于健康人群而言，能够呈现出明显疾病信号的关键物种。本研究采用细菌对hiPCA的贡献(bacteria-to-health-index contribution, BHC)进行推断，给不健康样本添加一个校正项，使其状态恢复至正常。例如，对于某个不健康样本，若某些特征呈现出异常时，模型会将样本进行重构。接着设定一个优化目标，通过令该目标的一阶导数为零，计算得出特征对hiPCA的贡献，从而实现对物种贡献的推断。

为评估不同膳食因子通过调节人群肠道菌群结构进而改善健康的潜在效果，设计了基于肠道菌群健康指数hiPCA的膳食因子评估方法，方法框架图如图 1所示。首先，借助训练数据集中的健康样本构建统计模型，随后将体外发酵后得到的样本数据输入该模型，以此计算出每个样本的hiPCA值。通过对比膳食因子组与对照组的hiPCA数值，筛选出对肠道菌群健康指数调控效果最为显著的膳食因子。进一步深入分析物种对hiPCA的贡献程度，深度挖掘膳食因子与肠道菌群之间的内在关联。

2 结果与分析 2.1 膳食因子体外发酵对超重人群肠道菌群分类组成的影响

为探究膳食因子对超重人群肠道菌群的影响，并筛选出有助于调控超重人群肠道菌群的膳食因子，进行了体外模拟结肠发酵。基于膳食因子的结构特性，挑选并确定了17种膳食因子用于实验，具体膳食因子详情见表 2。这17种膳食因子包括低聚果糖^[16]、低聚半乳糖^[17]等曾被用于调节超重或肥胖人群肠道菌群及其标志物的益生元，也包含尚未在研究中用于调节超重或肥胖但可能具有潜在效果的膳食因子。同时，为确保实验的科学性与严谨性，设置了以葡萄糖为碳源的阳性对照组。

体外模拟结肠发酵后的样本经宏基因组测序与注释，在所有样本中共检测出92个属、221个物种，肠道菌群相对丰度结果如图 2所示。在属水平上，经过24 h体外发酵后，所有组别的拟杆菌属相对丰度水平均有所下降(图 2A、2B)，多糖组的下降程度没有其他2类膳食因子高，且在普雷沃氏菌属(Prevotella)上出现了一定的上升趋势。值得关注的是，葛根多糖组的发酵液中布劳氏菌属(Blautia)相对丰度明显提升。在以往的研究中也有类似的发现，研究表明葛根抗性淀粉^[18]和桑瓜饮^[19](含桑叶、葛根)可以改善高脂饮食肥胖小鼠的代谢综合征，并显著上调了小鼠肠道中的Blautia相对丰度。香菇多糖和甘露聚糖均提高了发酵液中副拟杆菌属(Parabacteroides)的相对丰度，Parabacteroides被认为是人类肠道微生物群的核心成员，与宿主健康(例如代谢综合征、炎症性肠病和肥胖症)有密切关系^[20]。

在物种水平上(图 2C、2D)，粪普雷沃氏菌(Prevotella stercorea)和直肠真杆菌(Eubacterium rectale)在多数样本中均具有较高的相对丰度，在膳食因子体外发酵样本中占据主要优势物种地位，其中P. stercorea被认为与肥胖的改善有关^[21]。另外，经过24 h的体外发酵后，各组发酵液中粪拟杆菌(Bacteroides coprocola)的相对丰度水平出现了下降，该菌被认为与肥胖的预防和治疗潜在相关^[22]。但单从肠道菌群物种组成信息中难以挖掘和筛选对肥胖人群肠道菌群具有正向调节能力的膳食因子，因此需要更多的方法和大数据驱动的工具对膳食因子的效果进行评价和筛选。

2.2 膳食因子体外发酵对超重人群肠道菌群多样性的影响

肠道菌群的α多样性指标是评估肠道菌群稳态的指标之一^[23]，本研究进一步对体外发酵后各样本的菌群多样性进行计算，计算结果如图 3和表 3所示。结果显示，大多数膳食因子体外发酵后，其香农多样性、辛普森多样性以及物种丰富度低于阳性对照组。这一结果与先前的研究结论相似，即物种多样性的降低可能是由于膳食因子选择性地富集了益生菌，如双歧杆菌属(Bifidobacterium)，但这并不一定意味着与不健康的肠道菌群存在关联^[11]。多样性的变化还取决于个体差异，需要维持在一个合适的范围内以实现稳态平衡^[6]。

2.3 膳食因子体外发酵对超重人群肠道菌群网络结构的影响

肠道菌群的网络结构有助于揭示微生物之间的共生、竞争或拮抗关系，可以反映菌群生态系统的稳定性，以及观察和识别关键物种^[24]。因此，本研究进一步对健康人群(图 4A)和超重人群膳食因子体外发酵样本(图 4B)的肠道菌群网络结构进行了分析。结果表明，虽然干预后的肠道菌群网络结构更加稀疏，但常见的益生菌长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)^[25]和潜在的益生菌普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)^[26]仍在网络中保持比较重要的位置，且益生菌青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)^[27]也被识别为网络结构中的关键物种，这可能是膳食因子改善超重人群微生态的途径之一。同时，调控后的网络结构结果解释了上文中菌群α多样性的变化原因。

2.4 不同类型膳食因子体外发酵的菌群差异物种

肠道菌群的属水平和物种水平韦恩图(图 5A、5B)有助于揭示不同组别之间共有和特有的肠道菌群数量，反映不同膳食因子的共同效应和独特的调控作用，重叠的区域越大，共有菌群越多，组间相似性越高。属水平上，多糖类、多酚类和萜类膳食因子共享了50种菌群，其中多糖类和萜类体外发酵后的肠道菌群更为相似，多糖类的微生物调控效果特异性更高。肠道菌群种水平分析呈现出类似的情况。因此，对不同类型的膳食因子体外发酵样本差异物种进行线性判别分析(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)，结果如图 5C所示。其中多酚类物质体外发酵与其他2类膳食因子发酵的差异物种主要是产甲酸多雷氏菌(Dorea formicigenerans)，该物种被认为在超重、肥胖志愿者中的丰度更高^[28]，这可能表明本研究中的酚类物种对超重患者的肠道菌群调控并不明显。萜类膳食因子体外发酵后的差异物种亚颗粒菌属(Subdoligranulum)与儿童未来的BMI呈负相关^[29]。Bacteroides plebeius是多糖类膳食因子发酵后的特异物种，被认为是可能用于2型糖尿病肥胖患者治疗的关键细菌类群^[30]。

2.5 基于肠道菌群健康预测模型挖掘高效膳食因子

为综合评价膳食因子的健康效益，本研究基于本课题组以往开发的肠道菌群健康预测模型hiPCA^[11]对不同膳食因子发酵的样本进行评价。为减少训练集和本次实验样本之间的批次差异，对体外发酵后的样本使用以往的上游注释方法进行处理，并计算样本的hiPCA数值，以此作为来评估不同膳食因子的肠道菌群健康调控效果。

本研究中的肠道菌群健康预测模型以4 347个人肠道菌群宏基因样本作为训练集，选取本课题组过往研究中经由假设检验(Kolmogorov-Smirnov, KS)确定的92个微生物物种作为输入特征所构建的统计模型。将经过统一处理的不同膳食因子体外发酵肠道菌群数据集作为模型输入，得到hiPCA结果(图 6)。相较于以葡萄糖作为碳源的对照组，在大多数膳食因子的作用下，超重人群样本的hiPCA显著降低。这一结果表明，大多数膳食因子具有对超重人群肠道菌群起到健康调节作用的潜力，促使其朝着健康肠道菌群组成的方向发展。进一步深入剖析发现，在hiPCA (KS-92)的排名中，位列前5的膳食因子依次为低聚半乳糖、葛根多糖、甘露聚糖、香菇多糖和菊粉。其中，低聚半乳糖和葛根多糖在降低超重风险方面，相较于其他3种膳食因子展现出更为明显的效果。

2.6 基于肠道菌群健康预测模型挖掘膳食因子与肠道菌群的关联

课题组以往工作中开发的肠道菌群健康预测模型^[11]不仅可用于进行肠道菌群健康监测，还能进一步解析样本中物种对于健康指数的贡献程度。基于上述分析结果，研究发现多数膳食因子能够借助对肠道菌群的调节，降低超重风险。其中，低聚半乳糖和葛根多糖在膳食因子的健康效益评估中表现最为优异。因此，为了深入探究低聚半乳糖和葛根多糖与肠道菌群之间的内在联系，本研究依托健康预测模型，对不同膳食因子组下物种对hiPCA的贡献进行分析。具体来说，通过选取贡献排名前10的物种开展关联研究。

分析结果如图 7所示，在低聚半乳糖组(图 7A)和葛根多糖组(图 7B)中，对健康指数贡献排名前10的物种中有3个是相同的，分别为产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium) 6_1_63FAA以及毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium) 9_1_ 43BFAA。在这2组中，Clostridium perfringens和Lachnospiraceae bacterium 6_1_63FAA是贡献排名前2的物种。Lachnospiraceae bacterium 9_1_43BFAA在低聚半乳糖组中排名前5，然而在葛根多糖组中的排名则相对靠后。

进一步深入分析可知，Lachnospiraceae bacterium 6_1_63FAA、Lachnospiraceae bacterium 9_1_43BFAA以及Clostridium perfringens在低聚半乳糖组、葛根多糖组和阳性对照组(图 7C)中贡献程度均较高。而长真杆菌(Eubacterium dolichum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)和Clostridium citroniae仅在阳性对照组中贡献突出。值得注意的是，尽管Lachnospiraceae bacterium 6_1_63FAA同时存在于低聚半乳糖组、葛根多糖组和阳性对照组，但它在低聚半乳糖组中的贡献程度低于葛根多糖组和阳性对照组。并且，Lachnospiraceae bacterium 9_1_43BFAA在低聚半乳糖组和葛根多糖组中的贡献程度相较于阳性对照组均显著下降。

上述结果表明，Eubacterium dolichum、Lactobacillus salivarius、Clostridium clostridioforme、Clostridium citroniae、Lachnospiraceae bacterium 9_1_43BFAA以及Lachnospiraceae bacterium 6_1_63FAA等物种在超重的发展进程中发挥着关键作用。低聚半乳糖和葛根多糖或许是通过对这些特定肠道菌群，尤其是Eubacterium dolichum、Lactobacillus salivarius、Clostridium clostridioforme、Clostridium citroniae以及Lachnospiraceae bacterium 9_1_43BFAA的调控，来抑制与超重相关的细菌活动。此外，低聚半乳糖还可能通过调节Lachnospiraceae bacterium 6_1_63FAA进一步增强这种抑制作用，进而降低超重人群菌群健康风险。不过，这2种物质无法通过影响Clostridium perfringens来帮助超重人群维持肠道健康。以上结果表明，低聚半乳糖和葛根多糖可能通过相似的作用机制调节肠道菌群，以此实现降低超重人群健康风险的目的。

3 讨论与结论

本研究构建的基于肠道菌群健康指数的膳食因子评估体系，借助统计模型下的肠道菌群健康指数，为膳食因子调控效果的评估提供了新的量化方式。通过对比不同膳食因子组与对照组的健康指数，直观呈现出各类膳食因子对超重人群肠道菌群的影响差异，这一方法在膳食与肠道菌群关系研究领域具有创新性。

在17种膳食因子的体外发酵实验中，宏基因组测序分析得到的物种中Prevotella stercorea和Eubacterium rectale为主要物种，丰富了对超重人群肠道菌群组成的认知。以往也有研究表明，Prevotella stercorea在肠道中的数量可能会影响家族成员的体重^[31]，并且在超重患者体重显著下降后观察到Prevotella stercorea丰度的增加^[21]。Eubacterium rectale同样也被发现与代谢紊乱的超重、肥胖人群相关性高^[32-33]，但由于其是主要的丁酸生产者，因此其对肥胖的影响目前仍存在争议^[34]。多数膳食因子调控样本的多样性低于对照组的结果，这与肠道菌群多样性和健康状态呈正相关的传统认知存在出入。这或许提示着对于超重人群肠道菌群调节，并非简单追求更高的多样性，而是优化特定的菌群结构。

基于hiPCA的膳食因子评估体系显示多数膳食因子能降低超重人群样本的hiPCA，这一结果表明膳食干预在调节超重人群肠道菌群方面具有巨大潜力。低聚半乳糖和葛根多糖作为效果最为突出的膳食因子，其作用机制的解析尤为关键。它们对Eubacterium dolichum、Lactobacillus salivarius等特定菌群的调控，揭示了膳食因子与超重相关细菌活动之间的紧密联系，为后续深入研究肠道菌群与超重关系提供了重要靶点。

需要指出的是，本研究采用体外厌氧发酵体系模拟肠道环境，用于评估不同膳食因子对肠道菌群的调节作用。尽管该方法在可控性、重复性等方面具备优势，但与体内复杂的肠道生态系统相比仍存在显著差异，如缺乏宿主免疫调节、生理屏障和系统性代谢等过程。因此，体外发酵的结果尚不能完全等同于体内调控效应，其作用机制和健康益处仍需结合动物实验及临床研究得到进一步验证。本研究结果应作为初步筛选和机制探索的重要参考，而非直接推论体内效果。

综上所述，本研究使用课题组以往开发的基于大队列的肠道菌群健康指数对不同膳食因子对超重人群肠道菌群的健康效益进行评价，筛选出低聚半乳糖和葛根多糖等膳食因子，表明了它们在降低超重人群肠道菌群健康风险方面的积极作用并提供了数据支持。另外，研究还深度剖析了膳食因子与肠道菌群之间的内在关联，发现特定肠道菌群在超重人群菌群稳态中的调控贡献程度，为未来调控机制的探索提供了依据。本方法的开发和应用促进了肠道菌群与健康关系研究的进一步发展，不仅为个性化膳食方案的制定提供科学依据，有助于个体通过合理膳食改善肠道健康、降低超重风险；同时，也为健康管理研究领域中开发面向超重或其他健康状况异常人群的膳食干预产品提供了理论基础，在精准营养和公共卫生领域展现出广阔的应用前景。

作者贡献声明

杨子欣：方案设计、实验操作、绘制图表、稿件润色修改；谢和强：方案设计、实验操作、绘制图表、初稿写作；朱金林：方案设计、经费支持、监督指导、稿件润色修改；王鸿超：监督指导；陆文伟：经费支持、监督指导。

作者利益冲突公开声明

作者声明没有任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。