2025, Vol. 41中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 赵霞芳, 杜丽宏, 马宝霞, 贾劭娜, 刘宇飞, 朱宇飞, 麻啸涛, 杨小军, 徐坤
- ZHAO Xiafang, DU Lihong, MA Baoxia, JIA Shaona, LIU Yufei, ZHU Yufei, MA Xiaotao, YANG Xiaojun, XU Kun
- 产肠毒素大肠杆菌DNA疫苗重组酵母菌体微胶囊开发
- Recombinant yeast-cell microcapsules carrying the DNA vaccine against enterotoxigenic Escherichia coli
- 生物工程学报, 2025, 41(6): 2388-2404
- Chinese Journal of Biotechnology, 2025, 41(6): 2388-2404
- CSTR: 32114.14.j.cjb.240753
- DOI: 10.13345/j.cjb.240753
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文章历史
- Received: September 18, 2024
- Accepted: December 20, 2024
- Published: December 27, 2024
引用本文
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2. 山西大禹生物工程股份有限公司, 山西 运城 044600
2. Shanxi Dayu Bioengineering Co., Ltd., Yuncheng 044600, Shanxi, China
近年来，随着DNA疫苗的兴起，研究人员尝试利用益生菌作为疫苗递送载体，将致病性大肠杆菌抗原基因呈递至宿主免疫系统，激活特异性免疫，从而实现预防畜禽腹泻的目的[1]。
作为肠道“优势菌种”的大肠杆菌一般没有致病性，然而有的菌株可进化成为致病性大肠杆菌，或者在宿主肠道稳态失调的情况下导致宿主发病。这些致病性大肠杆菌可根据血清型、毒力因子、致病机制或临床发病症状进行分类，其中大多数已经进化为具有导致胃肠道、泌尿道或中枢神经系统疾病的能力，危害甚大[2-3]。导致腹泻的大肠杆菌根据临床症状可分为肠道致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)、肠道产毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)、肠道侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC)、肠道出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)及肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC)[4]。每种致病菌所偏好的宿主也不相同，其中ETEC主要感染新生、哺乳或断奶仔猪以及新生犊牛，也会感染羊、犬。菌毛是促进ETEC感染的关键因素，临床上常根据大肠杆菌菌体表面菌毛蛋白的亚型来区分不同的菌株[5]。寄生于动物肠道的ETEC具有独特的菌毛类型，从猪肠道中分离的ETEC主要表达F4(K88)、F5(K99)、F6(987p)和F18这几类菌毛，断奶仔猪腹泻多是由于感染含有F4菌毛的大肠杆菌。ETEC的主要抗原包括黏附素和肠毒素。黏附素又叫菌毛，F4(K88)是研究最多的黏附素之一，蛋白相对分子量在23.5–26.0 kDa之间，由1个包含10个基因的基因簇编码，分别称为faeA−faeJ，其中faeG是编码菌毛的主要亚基，与菌毛的黏附特性相关。利用特异性抗血清可以将K88菌毛分为K88ab、K88ac、K88ad这3种类型，它们都有一个共同的抗原决定簇“a”[6]。ETEC肠毒素包括热敏肠毒素(heat-labile toxin, LT)与热稳定性肠毒素(heat-stable toxin, ST)这2种。热敏肠毒素I (heat-labile enterotoxin I, LTI)除了引起腹泻，还能强化菌株对肠上皮细胞的黏附和定殖作用，同时也会诱发对宿主有利的免疫效应。热稳定肠毒素分为A型(heat-stable enterotoxin A, STa)与B型(heat-stable Enterotoxin B12, STb)，其中STb由动物源菌株分泌。ST单独不能够刺激机体免疫，但与大分子(如热敏肠毒素)相偶联即可获得免疫原性[7-8]。
ETEC感染仔猪属于非侵入性的胃肠道感染，只有诱导适当的胃肠道黏膜免疫才能预防病原体的侵染。基于仔猪断奶后对肠道病原体高度敏感的事实，急需研发一款针对断奶仔猪的口服疫苗。市场上流通的几种疫苗携带一定量的内毒素，使用后可能引起仔猪腹泻，再者这些疫苗多为妊娠期母猪使用，激活的是全身免疫系统，而非肠黏膜免疫系统[9]。人和动物的黏膜表面是大多数病原体入侵机体的重要门户，约90%以上的病原微生物都由黏膜入侵机体[10]。肠道免疫能够模拟自然感染，病原体进入消化道后直接刺激黏膜淋巴组织产生免疫应答，分泌免疫活性物质清除病原体[11]。存在于黏膜表面的分泌型IgA (secretory IgA)能够与病原体结合，从而阻止致病菌的黏附与入侵，而胞内转运过程中的IgA主要负责中和侵入细胞的病毒。肠道免疫系统中除了含有大量的巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞之外，还有3类性质独特的免疫细胞：上皮内淋巴细胞、肠黏膜上皮细胞和微皱褶细胞(M细胞)。肠道黏膜免疫因为具有独特的归巢现象与免疫耐受现象，所以肠道免疫系统(主要是消化道)对正常食物抗原和菌群保持免疫耐受。
DNA疫苗由于抗原基因在机体内表达，具有正确的自身翻译后修饰功能，可形成天然的蛋白构象。因此，抗原可在抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)表面形成MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类复合物，从而刺激CD4+T和CD8+T细胞，诱导体液免疫反应和细胞免疫反应。与传统疫苗相比，DNA疫苗具有设计简单、安全性高、针对性强、范围广[12]等特点。在使用生物载体的递送技术中，使用酿酒酵母作为载体的口服疫苗，在新疫苗的研发和设计中具有一定吸引力[13-14]。
重组酵母菌体DNA疫苗相对于其他酵母菌体疫苗具有安全性高、免疫效果好、免疫反应更快的优势[15]。HAN等[16]的研究表明，口服重组酵母DNA疫苗能够在鱼类的肠道中表达目标基因，并诱导特异性免疫反应；接种重组酵母DNA疫苗的鱼类能够产生较强的抗体反应[17]。这些优势表明，重组酵母菌体DNA疫苗在生产养殖中具有较大应用潜力，在控制畜禽传染病方面与重组酵母蛋白疫苗、重组酵母表面展示疫苗及重组酵母RNA疫苗等相比具有显著优势。
酵母载体通过口服的形式将抗原基因递送至动物肠道免疫系统，能够最大限度地减少动物应激[18]。重组酵母疫苗到达胃肠道后，首先被肠壁上的M细胞内化，随后引导至派尔集合淋巴(peyer patch, PP)结中的抗原呈递细胞，达到免疫目的。无论是活菌还是其细胞壁产物，酿酒酵母都可以作为饲料添加剂应用到动物生产中[19]。研究表明，酿酒酵母主要通过调节肠道微生物菌群、加强代谢、调节免疫系统和减轻氧化应激等方式发挥益生作用，还提高了pH的稳定性，促进了肠道微生物蛋白的产生，增加了挥发性脂肪酸的浓度，从而增加了采食量，提高了动物的生产力[20-22]。本研究制备了携带ETEC K88抗原基因的酵母菌体微胶囊(yeast-cell microcapsules, YCM)，以酿酒酵母为递送系统，将ETEC抗原基因递送至肠道免疫系统；通过饲喂实验探究了YCM重组菌对动物特异性免疫与肠道菌群的影响，以期为ETEC相关动物疾病的免疫预防提供参考和借鉴，也为研究酿酒酵母作为递送载体提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒酿酒酵母菌株JMY1、大肠杆菌DH5α菌株和JM109菌株均为本实验室保存；原核表达菌株BL21(DE3)感受态细胞购自北京擎科生物科技股份有限公司。质粒pET32a与载体JMB84-CMV- T2A-EGFP为本实验室保存。
1.1.2 培养基(1) 细菌LB培养基(100 mL)：1 g蛋白胨，1 g氯化钠，0.5 g酵母浸粉，固体培养基中再加入1 g琼脂粉，使用5 mol/L氢氧化钠调节pH至7.4，121 ℃灭菌20 min，待冷却至60 ℃左右时，加入氨苄青霉素使其终浓度为100 µg/mL，置于4 ℃备用。
(2) 酿酒酵母全营养型YEP培养基(100 mL)：2 g蛋白胨，2 g葡萄糖，1 g酵母浸粉，固体培养基中加入1 g琼脂粉，使用5 mol/L氢氧化钠调节pH至6.5左右，121 ℃灭菌15 min，冷却后置于4 ℃备用。
(3) 酿酒酵母尿嘧啶缺陷型SD (synthetic defined medium)培养基(100 mL)：2.2 g葡萄糖，0.67 g酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB)，0.06 g氨基酸缺失混合物(-Ade-His-Trp- Ura)，固体培养基中加入2 g琼脂粉，121 ℃灭菌15 min，待冷却后，按1:100的比例分别加入已配制好的Ade、Trp、His和Ieu溶液，然后置于4 ℃备用。所需要的氨基酸溶液配制方案如下。
亮氨酸溶液：将0.36 g亮氨酸(l-leucine)粉末溶于100 mL灭菌水中；色氨酸溶液：将0.24 g色氨酸(l-tryptophan)粉末溶于100 mL灭菌水中；组氨酸溶液：将0.24 g组氨酸(l- histidine)粉末溶于100 mL灭菌水中；腺嘌呤溶液：将0.24 g腺嘌呤(adenine)粉末溶于100 mL灭菌水中。
(5) 细胞完全培养基(100 mL)：Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)培养基90 mL、10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 10 mL，另外按1:100比例添加青链霉素(终浓度：青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL) 1 mL。如培养Caco-2细胞还需额外添加丙酮酸钠、非必需氨基酸和l-谷氨酰胺。配制完成保存于4 ℃备用。
1.1.3 其他试剂及仪器(1) 试剂：限制性核酸内切酶，纽英伦生物技术(北京)有限公司；T4 DNA连接酶，武汉赛维尔生物科技有限公司；质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒，Omega Bio-Tek公司；PCR相关试剂，天根生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、酵母氮源基础YNB、酵母营养缺陷型培养基补充剂、LiAc、PEG-6000、变性鲑鱼精DNA、RIPA裂解液、胃蛋白酶和胰蛋白酶、小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液、鼠源His标签抗体、羊抗鼠IgG二抗、鼠源Myc标签抗体、兔源GFP抗体，江苏康为世纪生物科技股份有限公司；脱脂奶粉、ECL显色液，上海雅酶生物医药科技有限公司；DMEM、胎牛血清、100×青霉素-链霉素溶液，赛默飞世尔科技公司；Hieff Trans脂质体转染试剂，翌圣生物科技股份有限公司；小鼠K88抗体ELISA检测试剂盒，上海泛柯实业有限公司；HRP-山羊抗小鼠IgG、HRP-山羊抗小鼠IgA，ImmunoWay Biotechnology Company；Alexa Fluor 488-山羊抗兔IgG、自发荧光淬灭剂、DAPI，上海碧云天生物技术股份有限公司；二氨基联苯胺辣根过氧化物酶显色试剂盒(diaminobenzidine horseradish peroxidase color development kit, DAB)、正常山羊血清、石蜡、二甲苯、无水乙醇、PBS缓冲液、虎红琼脂培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
(2) 仪器：PCR仪、高速低温离心机、NanoDrop 2000超微量检测仪、酵母培养箱、脱色摇床，赛默飞世尔科技有限公司；核酸电泳仪、蛋白电泳仪、琼脂糖凝胶成像系统、凝胶蛋白成像系统、酶标仪，伯乐生命医学产品有限公司；紫外分光光度计，岛津企业管理有限公司；超声破碎仪、匀浆器，宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温摇床、恒温培养箱，上海博迅实业有限公司；恒温水浴锅，美墨尔特贸易有限公司；倒置荧光显微镜，奥林巴斯有限公司；细胞培养箱，宾得医疗器械有限公司；超净台，力康生物医疗科技控股有限公司；石蜡切片机、石蜡包埋盒，徕卡显微系统贸易有限公司；干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。
1.1.4 实验动物五周龄的雌性昆明小白鼠共计77只，购自第四军医大学动物饲养繁殖中心。小鼠的饲养和处理按照中国实验动物福利和道德检查委员会指南进行，所有动物实验获得西北农林大学动物伦理委员会批准(批准号NWAFU- DK2020046)。
1.2 方法 1.2.1 原核表达载体与酵母穿梭载体的构建及表达(1) K88抗原基因的合成与原核表达载体的构建
根据GenBank中产肠毒素性大肠杆菌K88抗原基因序列号(K88：M35954.1)，送生物公司合成载体pUC57-ETEC (含K88抗原基因)。
用限制性核酸内切酶BamH I和Sal I于37 ℃水浴锅酶切pUC57-ETEC载体和pET32a 2 h，1.0%琼脂糖凝胶电泳30 min，用胶回收试剂盒进行回收。胶回收后按5:1的摩尔比例用T4 DNA连接酶于25 ℃连接45 min。酶连产物热激转化E. coli DH5α细胞，挑取单克隆接种于5 mL含有氨苄西林(ampicillin, Amp)的LB液体培养基(终浓度为100 µg/mL)中，37 ℃培养至菌液呈浑浊状态。提取质粒进行酶切鉴定与测序鉴定，命名为pET32a-K88。
(2) K88蛋白的诱导表达与鉴定
K88蛋白的诱导表达：热激法将pET32a-K88载体转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取单克隆于LB液体培养基(含有终浓度为100 µg/mL的Amp)中培养10 h，按1:100比例扩大培养，至菌液OD600≈0.5时，加入IPTG诱导(浓度为0.1 mmol/L)。未加诱导剂的菌液作为阴性对照组。菌液在37 ℃、180 r/min的条件下诱导6 h，4 ℃、10 000 r/min离心2 min收集菌体，弃上清液，之后用预冷的ddH2O重悬沉淀，离心去上清，重复3次。最后用1 mL预冷的PBS重悬菌体，用超声破碎仪进行菌体破碎(设置功率45%，超声3 s、间隔1 s，共30 min)。待菌液澄清透明，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用PBS重悬沉淀。取200 μL重悬液，加入50 μL蛋白上样缓冲液(5×)，煮沸10 min，存于−80 ℃用于后续SDS-PAGE和Western blotting检测。
SDS-PAGE和Western blotting检测K88蛋白表达情况：配制SDS-PAGE胶(浓缩胶5%，分离胶12%)，上样量为15 μL。首先80 V电压电泳30 min，然后将电压调节至120 V继续电泳约2 h。结束电泳后置于考马斯亮蓝染液中浸染3 h后脱色，对脱色后的PAGE胶用凝胶成像系统拍照，观察并分析K88蛋白表达情况。
Western blotting进一步检测K88蛋白的表达。首先用SDS-PAGE胶分离细菌总蛋白，然后转膜。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜需提前在甲醇溶液中浸泡10 min活化，按照转膜夹负极-海绵-3层滤纸-蛋白胶- PVDF膜-3层滤纸-海绵-转膜夹正极的顺序进行转膜，设置转膜条件为恒流300 mA，时间90 min；转膜结束后，5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h，PBST清洗3次，每次10 min；用PBST稀释的鼠源His标签抗体(1:1 000)孵育PVDF膜，4 ℃过夜；用PBST清洗3次，每次10 min；用PBST稀释的羊抗鼠IgG二抗(1:2 000)孵育PVDF膜，摇床上室温孵育2 h；用PBST清洗3次，每次10 min；用滤纸吸净PVDF膜上的残液后滴加ECL显色液，用化学发光成像仪进行成像分析。
(3) 酵母穿梭载体构建和验证
JMB84-CMV-K88-EGFP载体构建：用BamH I和Sal I限制性内切酶对载体JMB84- CMV-T2A-EGFP与pUC57-ETEC进行双酶切，鉴定无误后命名为JMB84-CMV-K88-EGFP。
JMB84-CMV-K88载体构建：将JMB84- CMV-K88-EGFP载体用Sal I与Xho I酶切，通过同尾酶原理进行自连得到载体JMB84-CMV- K88。
酵母穿梭载体转染哺乳动物细胞：利用脂质体转染试剂将酵母穿梭载体JMB84-CMV- K88-EGFP转染HEK293T细胞。36 h之后在荧光显微镜下观察表达情况。
1.2.2 YCM制备、肠道表达和稳定性研究(1) K88抗原基因YCM制备
用醋酸锂转化法(PEG-LiAC)将构建的酵母穿梭载体分别转化JMY1酿酒酵母菌株。转化完成之后，在尿嘧啶(uracil, ura)缺陷型培养基上筛选重组酵母。培养3–4 d，挑取单克隆于YPD培养基中扩大培养，梯度稀释并在尿嘧啶缺陷型培养基上点板观察生长情况；用酵母质粒提取试剂盒提取质粒，通过酶切鉴定进一步确认。鉴定无误的YCM分别命名为JMY1-K88、JMY1-K88-EGFP。
(2) YCM肠道表达试验
为探究小鼠口服YCM之后，外源基因能否在小鼠肠道细胞内表达。取2只昆明小鼠灌胃JMY1-K88-EGFP，灌胃剂量为1.0×109 CFU。饲喂JMY1酵母的小鼠作为阴性对照。24 h后取回肠组织，用预冷的PBS冲洗，切成3−4 mm大小的组织块，放入4%多聚甲醛固定液4 ℃固定24 h。组织石蜡包埋与切片免疫荧光操作按说明书进行。
(3) YCM耐受胃肠液试验
为探究YCM在胃肠液中的稳定性，进行体外模拟实验。人工胃液(simulated gastric fluid, SGF)：0.2 g NaCl，0.32 g胃蛋白酶，用1.0 mol/L HCl溶液将pH调节至2.0。用过滤器(孔径0.22 µm)过滤除菌，现配现用；人工肠液(simulated intestinal fluid, SIF)：0.68 g KH2PO4，1 g胰蛋白酶，用1.0 mol/L NaOH溶液pH调节至6.8。(孔径0.22 µm)过滤除菌，现配现用。
接种JMY1和JMY1-K88酵母单克隆于10 mL YPD培养基中，在30 ℃、250 r/min的摇床中培养10 h。每组取1 mL菌液于3 000 r/min离心2 min，用ddH2O清洗2次，分别加入5 mL预热的PBS、SGF和SIF，置于37 ℃、250 r/min温育8 h。从0 h开始，其间每隔2 h取样100 µL，连续10倍梯度稀释涂布于YPD固体培养基，30 ℃静置培养2 d后菌落计数，计算得出各时间段不同培养液中的菌体数量。
(4) YCM黏附肠上皮细胞试验
为探究JMY1-K88 YCM对肠上皮细胞的黏附力，进行体外模拟酵母-结肠癌细胞共培养实验，将JMY1-K88 YCM和结肠癌细胞培养在DMEM培养基，补充10%胎牛血清、青霉素(50 U/mL)和链霉素(50 μg/mL)。放入37 ℃、饱和水分、含5% CO2的培养箱中培养，具体按照参考文献[23]进行操作。
(5) JMY1-K88肠道滞留试验
取健康的昆明小白鼠3只，饲喂前对每只小鼠粪便取样，混样，用PBS重悬稀释之后涂布虎红平板，置于30 ℃恒温培养箱培养3–4 d观察是否有菌落生长；分别对3只小鼠连续灌胃3 d，每天灌胃1.0×109 CFU。从第5天开始每天收集小鼠粪便，混样，用PBS重悬稀释之后涂布虎红平板，恒温培养3−4 d筛选单菌落，连续采样15 d；监测的最后1天，从虎红平板上挑取单克隆，设计K88核酸序列引物，做菌落PCR，确定菌株是否为JMY1-K88。
1.2.3 YCM免疫原性检测(1) 小鼠分组与饲喂程序
为探究YCM饲喂小鼠后的免疫反应，选取72只5周龄体重相当的雌性健康昆明小白鼠开展饲喂实验，随机分为3组：PBS组、JMY1、JMY1-K88组，每组24只，具体分组方案见表 1。
| Groups | Number of mice (pieces) | Oral immunization regimen | Number of yeast | Function |
| PBS | 24 | One time per week for three consecutive days, a total of eight times | − | Blank control |
| JMY1 | 24 | One time per week for three consecutive days, a total of eight times | 1.0×109 CFU/time | Experimental control |
| JMY1-K88 | 24 | One time per week for three consecutive days, a total of eight times | 1.0×109 CFU/time | Experimental group |
每只小鼠取100 μL (1.0×1010 CFU/mL) YCM重悬液进行口服免疫，PBS作空白对照组，JMY1酵母作试验对照组。每隔1周口服免疫1次，每次连续口服3 d，共免疫8次；每2次口服免疫之后隔3 d进行采样。
(2) 样品的采集
血清采集：分别在第15、31、47、63天每组随机选取6只小鼠进行心脏采血，采集的血液样品先在37 ℃静置30 min，后于4 ℃静置2 h，4 ℃、2 500 r/min离心10 min，收集血清保存于−20 ℃，用于血清细胞因子及特异性抗体检测。
回肠组织液采集：为评估饲喂YCM对小鼠肠黏膜免疫系统的作用，于第15、31天每组随机选取6只小鼠实施安乐死，取回肠组织并称重。用预冷的PBS清洗，用PBS定容至5 mL，加入终浓度1.0 mol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)。将离心管置于冰上用匀浆器充分研磨粉碎组织，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清冻存于−20 ℃，用于后续回肠组织细胞因子检测。
回肠组织采集：在第47天时，每组随机取3只小鼠采集回肠组织，用预冷的PBS清洗，切成3−4 mm大小的组织块，放入4%多聚甲醛固定液4 ℃固定24 h，用于后续免疫组化IgA阳性细胞分析。
(3) 免疫检测
血清K88特异性抗体检测：先前纯化的K88抗原蛋白进行SDS-PAGE分析，之后转膜用Western blotting检测。一抗用第15天采集的血清(1:500稀释)，二抗用HRP-羊抗鼠IgG抗体。操作同1.2.1.2。初步检测确定血清中特异性抗体之后，用小鼠K88抗体ELISA检测试剂盒检测第15、31、47、63天血清中的抗体含量。
血清与回肠组织细胞因子检测：分别用小鼠IL-10 ELISA检测试剂盒、IL-17a ELISA检测试剂盒、TNF-α ELISA检测试剂盒检测第15、31天各组小鼠血清、回肠组织中细胞因子含量。
回肠组织IgA阳性细胞免疫组化检测：在第47天取各组小鼠的回肠组织用4%多聚甲醛固定，用免疫组化技术分析各组小鼠回肠组织中IgA阳性细胞的比例。
1.2.4 肠道菌群分析小鼠粪便采集：在第63天时，每组随机取3只小鼠采集盲肠内容物，将收集到的各组小鼠的粪便样品交由北京擎科生物科技股份有限公司进行16S rRNA基因测序分析各组小鼠的肠道菌群变化。
1.3 数据处理本研究相关数据，用Microsoft Excel 2016完成对数据的初步整理，然后用GraphPad
Prism 9软件进行具体分析，采用此软件中的one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著，0.05 < P < 0.1表示有显著性差异趋势，结果用mean±SEM表示。
2 结果与分析 2.1 原核表达载体与酵母穿梭载体的构建及表达利用生物公司合成的载体pUC57构建原核表达载体pET32a-K88，通过限制性内切酶BamH I和Sal I对该载体进行酶切鉴定，大小符合SnapGene预期的5 881 bp和855 bp。进一步进行测序鉴定，结果表明原核表达载体pET32a-K88构建成功。载体图谱、酶切鉴定结果以及测序结果见图 1A。为了评估该载体的功能，将pET32a-K88载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。在IPTG的诱导下，目标蛋白以包涵体的形式在细胞内高效表达。利用SnapGene软件进行预测，融合有His标签的K88重组蛋白预期分子量约为48.8 kDa，同时预测可能存在的副产物条带大小为31.1 kDa。利用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting进行检测。结果显示，蛋白大小符合预期且存在31.1 kDa的副产物条带(图 1B)。这说明pET32a-K88载体构建成功，且在原核表达系统中具有高效表达目标蛋白的能力，为后续的功能研究和应用奠定了基础。
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| 图 1 载体鉴定与表达 Fig. 1 Vector identification and expression. A: Prokaryotic expression vector pET32a-K88 map, enzyme digestion identification results, sequencing results. B: The results of prokaryotic inducible protein SDS-PAGE and the identification of prokaryotic inducible protein by Western blotting. "+" indicates samples induced by IPTG, and "–" indicates samples that have not been induced by IPTG. C: Map, enzyme digestion identification and sequencing results of yeast shuttle vector JMB84-CMV-K88. D: Map, enzyme digestion identification and sequencing results of yeast shuttle vector JMB84-CMV-K88-EGFP. E: Fluorescence results of vector-transfected cells. A：原核表达载体pET32a-K88图谱、酶切鉴定结果图、测序结果图。B：原核诱导蛋白SDS-PAGE结果图、原核诱导蛋白Western blotting鉴定结果图。“+”表示经IPTG诱导的样本，“–”表示未经IPTG诱导的样本。C：酵母穿梭载体JMB84-CMV-K88图谱、酶切鉴定与测序结果图。D：酵母穿梭载体JMB84-CMV-K88-EGFP图谱、酶切鉴定与测序结果图。E：载体转染细胞荧光结果。 |
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利用生物公司合成的pUC57-ETEC载体和本实验室保存的真核表达载体JMB84-CMV- T2A-EGFP，构建了JMB84-CMV-K88-EGFP和JMB84-CMV-K88这2种穿梭载体，用BamH I/ Xho I和BamH I/EcoR Ⅴ对2种载体分别进行了酶切鉴定。两种穿梭载体的图谱、酶切鉴定结果以及测序结果见图 1C、1D。为验证表达载体能否在细胞内成功转录翻译，将载体转染哺乳动物细胞，观察荧光情况。转染HEK293T细胞36 h后，在荧光显微镜下观察发现JMB84- CMV-K88-EGFP载体转染的荧光效果良好(图 1E)。
2.2 YCM菌株制备与稳定性探究利用醋酸锂转化法将构建的2种穿梭载体转化入酿酒酵母，在尿嘧啶缺陷型培养基上筛选。以JMY1空白菌株作为阴性对照，30 ℃静置培养3 d，结果如图 2A所示。扩大培养的转化子提取质粒，经大肠杆菌JM109菌株扩增质粒，酶切鉴定进一步确认筛选得到的转化子。转化子质粒pJMB84-CMV-K88与pJMB84-CMV- K88-EGFP分别用限制性内切酶BamH I/Kpn I与BamH I/Xho I进行酶切鉴定酶切，鉴定结果如图 2B所示。
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| 图 2 阳性转化子的鉴定与重组酵母稳定性 Fig. 2 Identification of positive transformants and stability of recombinant yeast. A: Identification of transformant-ura-deficient media. B: Identification results of enzymatic digestion of transformants. M: Marker; Lane 1: JMY1-K88; 2: JMY1-K88-EGFP. C: Variation plot of JMY1 survival rate of blank yeast. D: Changes in the viability of recombinant yeast JMY1-K88. E: Recombinant yeast adhesion to Caco-2 cells. F: Immunofluorescence detection of ileal tissue. G: Detection of recombinant yeast tiger red plate in mouse feces. H: Colony PCR results. Data are presented as mean±SEM, * represents P < 0.05. A：转化子-ura缺陷型培养基鉴定。B：转化子酶切鉴定结果。M：Marker；泳道1：转化子JMY1-K88质粒酶切鉴定；泳道2：转化子JMY1-K88-EGFP质粒酶切鉴定。C：空白酵母JMY1存活率变化图。D：重组酵母JMY1-K88存活率变化图。E：重组酵母黏附Caco-2细胞。F：回肠组织免疫荧光检测。G：小鼠粪便中重组酵母虎红平板检测。H：菌落PCR结果。数据表示为mean±SEM，*表示P < 0.05。 |
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鉴定正确后，验证YCM在肠道内的表达情况。用JMY1-K88-EGFP饲喂小鼠，24 h后取回肠组织进行免疫荧光检测，如图 2F所示，相比于饲喂JMY1酵母的小鼠，饲喂JMY1-K88- EGFP的小鼠回肠组织能够检测到绿色荧光蛋白，证明携带外源基因YCM能够在小肠细胞内表达。
接着探究了JMY1-K88对胃肠液的耐受能力，将YCM分别与PBS、模拟胃液、模拟肠液共培养，同时以空白菌株JMY1作为对照，其间每隔2 h取样监测重组酵母的数量变化，绘制重组酵母的数量-时间变化关系图(图 2C、2D)。结果表明，8 h内YCM的数量相较于最初未发生明显变化，2种酵母的数量变化趋势基本一致，证明YCM可以耐受一定时间的胃肠液消化，且与野生酵母JMY1的耐受能力无异。
YCM对胃肠液具有一定耐受性，需要进一步探究其黏附肠上皮细胞的能力。本研究在体外模拟了重组酵母-结肠癌细胞的共培养试验。将JMY1-K88与Caco-2细胞共培养，以JMY1酵母作为对照，每组设置3个重复孔，计算了平均黏附率。结果如图 2E所示，JMY1-K88的黏附率略高于JMY1酵母，达到了10%，证明YCM菌株未削弱对肠上皮细胞的黏附能力，甚至略优于野生型酵母菌株。
体外模拟后，探究了YCM在小鼠体内滞留时间。连续灌胃小鼠3 d，结束后采集粪便涂布虎红平板，直至粪便中检测不到酵母菌落，挑取最后一天单克隆菌落做菌落PCR，检测到与预期大小相符的885 bp大小条带(图 2G、2H)。结果如图所示，YCM可以在小鼠肠道滞留15 d，且筛选到的菌落均为JMY1-K88酵母。
2.3 YCM免疫原性研究对JMY1-K88组小鼠第15天的血清进行了Western blotting检测，在48.8 kDa处有明显的条带，与K88蛋白预期大小相符，证明JMY1-K88 YCM成功诱导小鼠机体产生特异性抗体，结果如图 3B所示。随后用ELISA抗体检测试剂盒对小鼠第15、31、47、63天的血清进行抗体滴度检测，结果如图 3C所示，随着饲喂次数的增加，小鼠体内的抗体水平逐渐升高，且与对照组形成显著差异。
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| 图 3 小鼠饲喂和采样流程与小鼠血清、回肠组织免疫原性检测 Fig. 3 Mouse feeding and sampling process and detection of immunogenicity of mouse serum and ileal tissue. A: Mouse feeding and sampling process. B: SDS-PAGE and Western blotting were used to detect serum antibodies. C: Mouse serum antibody ELISA detection. D: Detection of serum IL-17a ELISA in mice on the 15th and 31st days of immunization. E: Serum IL-10 ELISA detection in mouse on the 15th and 31st days of immunization. F: Cytokine content in ileal tissue of mouse. G: Statistical analysis of positive cell area in ileal tissue under 100× view. H: Picture interception of ileal tissue under 100× field of view. The data are expressed as the average±SEM, ns represents P > 0.05, * represents P < 0.05, *** represents P < 0.001, **** represents P < 0.000 1. A：小鼠饲喂和采样流程。B：SDS-PAGE与Western blotting检测血清抗体。C：小鼠血清抗体ELISA检测。D：免疫第15、31天小鼠血清IL-17a ELISA检测。E：免疫第15、31天小鼠血清IL-10 ELISA检测。F：小鼠回肠组织细胞因子含量检测。G：回肠组织100倍镜视野下阳性细胞面积统计分析。H：回肠组织100倍镜视野下的图片截取。数据表示为平均值±SEM，ns表示P > 0.05，*表示P < 0.05，***表示P < 0.001，****表示P < 0.000 1。 |
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检测了小鼠血清中IL-10、IL-17a的含量，IL-10是一种抗炎因子，与免疫耐受相关；而IL-17a是一种促炎因子，IL-17a的升高表明机体处于免疫激活状态。常用这两种细胞因子的变化指示小鼠机体趋于免疫耐受或免疫激活的状态。小鼠回肠组织中TNF-α的含量可以指示YCM对小鼠肠道刺激作用的强弱，是否诱导了肠道局部炎症反应。小鼠血清细胞因子含量检测如图 3D、3E所示，从2次的检测结果可以发现，随着饲喂次数(从15−31 d)的增加，JMY1-K88组小鼠血清中IL-17a水平升高，而IL-10水平降低，说明小鼠整体免疫水平趋于逐渐激活的状态；如图 3F所示，JMY1-K88组小鼠回肠组织中TNF-α的含量与对照组相当，说明YCM对小鼠肠道刺激作用较小，未引起由炎症反应导致的肠道稳态失衡。
免疫球蛋白A (IgA)作为肠黏膜上的主要免疫球蛋白，可抵抗各种共生菌与外源致病菌的入侵，在肠道免疫当中起到关键作用。为探究JMY1-K88 YCM对肠道免疫系统的激活作用，利用免疫组化技术对各组小鼠回肠组织中可分泌IgA蛋白的细胞进行了特异性染色，分析各组小鼠IgA阳性细胞占比。结果如图 3G、3H所示，JMY1-K88组小鼠回肠组织中可分泌IgA细胞的比例高于其他2组。
2.4 小鼠肠道菌群分析结果香农指数曲线(Shannon index)和稀释性曲线(rarefaction curve)表明样本中的大部分菌群多样性已被捕获，样本测序数据是合理的(图 4A、4B)。Shannon指数结果表明，与PBS组小鼠相比，口服酵母后3组小鼠肠道菌群丰度未发生明显变化。各样本Venne图也显示，3组小鼠共有菌群物种数达305个，组间差异较小，但K88组小鼠与PBS组小鼠共有物种达100个，物种相似度更高(图 4C、4D)。
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| 图 4 小鼠肠道菌群分析结果 Fig. 4 Intestinal microbiota analysis results in mice. A: Shannon index curve of microbial sequencing samples. B: Dilution curve of microbial sequencing samples. C: Shannon index results. D: Venne analysis. E: PCoA analysis. F: phylum-level species analysis. G: Genus level species analysis. Data are presented as mean±SEM, ns represents P > 0.05. A：微生物测序样本香浓指数曲线。B：微生物测序样本稀释性曲线。C：Shannon指数结果。D：Venne分析。E：PCoA分析。F：门水平物种分析。G：属水平物种分析。数据表示为平均值± SEM，ns表示P > 0.05。 |
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通过β多样性分析(beta diversity)，可以比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度，本研究选择主坐标分析(PCoA)方法，坐标轴图上距离越近的样品，表示相似性越大。PCoA显示，酿酒酵母影响了肠道微生物组成；与PBS组小鼠相比，JMY1组小鼠和JMY1-K88组小鼠肠道菌群发生了显著变化，且二者微生物组成更为接近(图 4E)。
为了进一步了解口服YCM后微生物群落的具体变化，分析了各组样品在门和属水平上的差异(图 4F、4G)。结果显示，在门水平上酿酒酵母通过增加厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)和放线菌门(Actinobacteriota)等肠道基础菌群的比例改变了肠道微生物区系的组成；同时一种肠道有害菌脱硫弧菌(Desulfobacterota)的比例降低。在属水平上，口服酵母组小鼠肠道菌群拟杆菌属(Bacteroides)的比例有所增加，一些未被培养且功能未知的菌群如毛螺菌属(Lachnospira)、颤螺菌属(Oscillospira)的比例也有所增加；肠道有害菌脱硫弧菌属(unclassified Desulfovibrionaceae)的比例降低。总之，小鼠在饲喂YCM之后肠道菌群区系组成与对照组小鼠相比，未发生明显变化，只是肠道基础群的比例有所增加，这与酿酒酵母益生菌的特性相符。
3 讨论与结论随着分子生物学技术的不断发展，原核表达已是一种相当成熟的技术，能够高效率、低成本地表达外源基因。大肠杆菌作为常用表达外源基因的底盘生物，具有遗传背景清晰、培养操作简便、易于繁殖等优点。pET系统是一种高效的原核表达系统，该系统使用的宿主菌株基因组上整合了T7噬菌体RNA聚合酶基因，能够激活T7强启动子之下的特异性转录。pET系列载体携带有His标签，方便后续检测和纯化目的蛋白。试验诱导的重组蛋白经SDS-PAGE检测发现，目的蛋白主要存在于菌体破碎离心后的沉淀中，不溶于PBS缓冲液，即目的蛋白以包涵体形式存在。
SDS-PAGE检测结果可知，目的蛋白表达量不是很高且本底表达明显。理论上，K88为菌体的结构蛋白，不具有酶活功能，其在胞内的大量表达对宿主毒性较小。鉴于此，可用以下方案解决：(1) 质粒pLysS含有编码T7溶菌酶的基因，可与T7 RNA聚合酶结合，降低本底蛋白表达水平，还适用于严格调控毒基因的表达，所以建议使用大肠杆菌BL21(DE3) pLysS作为表达宿主。(2) 由于基因合成时对K88核酸序列进行了哺乳动物源密码子优化，导致在原核表达系统内蛋白表达量下降，建议使用Rosetta(DE3)菌株作为底盘细胞，此种菌株含有6种稀有密码子对应的tRNA，能够提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平；通过SDS-PAGE及Western blotting检测结果可以发现，2种蛋白均有副产物条带出现，起初推测是目的蛋白发生降解，但根据SnapGene软件预测结果发现，原核表达载体上抗原蛋白基因的开放阅读框内存在2个起始密码子。
酿酒酵母作为递送载体，将具有功能的DNA、mRNA和siRNA等分子输送到小鼠和人类树突状细胞(dendritic cell, DC)中。本课题组前期的研究也证明通过口服携带CD40序列特异性shRNA(短发夹RNA)的重组酿酒酵母可将抗原靶向呈递树突状细胞[15]。在构建核酸疫苗载体的过程中，需要考虑的关键问题就是编码抗原的基因的高效启动表达，因此选择合适的启动子是十分重要的。研究表明，常见的来源于巨细胞病毒的启动子在哺乳动物中是一种强有力的启动子，但在酵母中基本丧失功能。因此本研究在构建重组酵母DNA疫苗时，选择使用CMV启动子[24]，该启动子也是构建DNA疫苗时广泛使用的启动子[25]。
酿酒酵母递送真核表达载体至肠道树突状细胞，为探究表达载体在哺乳动物细胞内能否翻译出抗原蛋白，将其转染动物细胞，通过荧光观察与Western blotting检测，证明酵母穿梭载体能够在哺乳动物细胞内工作且效率良好；从荧光观察结果来看，JMB84-CMV-K88-EGFP载体的表达效果良好。
良好的口服疫苗需对胃肠液有一定的耐受性，克服消化道极酸、多消化酶的复杂环境；理论上YCM黏附于肠上皮细胞的数量越多，被黏膜层吞噬细胞识别内化的概率越高，YCM才会更有效，因此还需要对肠上皮细胞有一定的黏附性。实验结果表明，JMY1-K88重组酵母能够耐受胃肠液长达8 h的消化，这足够重组酵母在摄入后到达肠道黏膜层并被识别吞噬。理论上重组酵母由于额外整合了外源基因，生长代谢负担加重，相比于野生型酵母，在抗逆性、黏附性方面会略显逊色，但以上结果证明JMY1-K88重组酵母与JMY1野生型酵母没有明显差异，这进一步说明了重组酵母用于递送口服DNA疫苗的可行性。
口服DNA疫苗发挥作用的关键在于其携带的抗原基因能够在宿主细胞内高效表达。小鼠口服JMY1-K88-EGFP重组酵母后在回肠组织能够检测到绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达，证明酿酒酵母作为DNA疫苗递送载体的可行性。然而从免疫荧光结果来看，表达效率并不高。推测原因之一是重组酵母被M细胞吞噬概率较低，其次是酿酒酵母表达载体在宿主细胞内转录翻译效率低下。这也是目前口服DNA疫苗面临的2个主要问题。针对此问题，研究人员尝试了多种方法，比如利用酵母表面修饰技术，在酵母细胞壁表达一些细菌黏附素蛋白、特异性配体(Fc receptor, FcR)等，提高酿酒酵母靶向免疫细胞的概率[26]。表达载体方面，可以使用抗原基因密码子优化、载体稳定性增强、启动子优化等策略。
YCM饲喂小鼠之后，首先要评估YCM本身对小鼠肠道稳态的影响。本研究从细胞因子方面，检测了回肠组织中促炎因子肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的含量，结果显示饲喂酵母组小鼠细胞因子水平与PBS组小鼠基本相当。说明重组酵母未导致肠道发生明显的局部炎症反应，从免疫水平而言，未导致肠道稳态失衡。
为探究YCM对小鼠全身免疫系统的激活作用，检测了免疫早期(15–31 d)血清中IL-17a与IL-10这2种细胞因子的含量以及整个免疫周期内特异性IgG抗体含量。IL-17家族的细胞因子具有多种免疫调节功能，其最显著的作用就是参与诱导和介导促炎反应，可诱导多种趋化因子，它们吸引中性粒细胞进入感染或损伤的组织[27]。IL-10是一种具有多效性免疫抑制功能的细胞因子，IL-10抑制TNF-α、IL-1β和IL-8等细胞因子的表达，并能抑制淋巴细胞表面黏附分子的表达[28]。从第2次检测结果(图 3D、3E)可知，在免疫早期JMY1-K88组小鼠整体的免疫状态是趋向于激活而非耐受。然而，细胞因子的变化与对照组相比未有统计学上的差别。而且PBS组小鼠的细胞因子与饲喂酵母的小鼠呈现出相似的变化趋势，推测是因为灌胃操作对小鼠自身有应激作用。目前关于酿酒酵母刺激免疫细胞分泌细胞因子的研究多通过体外实验(如酵母-细胞共培养)来检测，这种活体水平的检测难以发现明显区别[29-30]。从抗体滴度检测结果可知，随着饲喂次数的增加，特异性抗体水平在逐步上升，说明机体的免疫防线在逐渐增强。除了评估YCM的免疫应答外，还讨论了其对肠道菌群的影响。本研究发现，YCM不仅不会破坏肠道菌群，反而能够提升厚壁菌门、拟杆菌门这类肠道基础菌的比例，降低有害菌的滋长，从调节肠道稳态方面进一步对机体提供保护，这种变化可能主要是由递送载体酿酒酵母所引起的。
YCM无安全风险，易于大规模生产，具有很大的开发和应用潜力，有进一步发展成为可食用疫苗的可能。本实验探究了携带ETEC DNA疫苗的YCM作为口服疫苗在小鼠上的可行性，不仅为猪生产中疫苗的开发提供了科学依据，还为传染病的防治提供了新思路。总而言之，在“禁抗”的时代背景下，本研究制备的K88抗原基因的YCM展现出了作为口服生物制剂的良好前景，特别是用于预防畜禽养殖中由ETEC引起的肠道疾病。
致谢: 感谢西北农林科技大学基因编辑科教平台(Northwest A&F University-Gene Editing Scientific Teaching, NWAFU-GEST)、羊遗传改良与生物育种创新团队和动物营养与健康养殖创新团队对本研究提供的硬件、材料和技术支持。
作者贡献声明
赵霞芳：载体构建、相关蛋白表达、动物实验、文章写作；杜丽宏：载体构建、YCM制备及表达验证；马宝霞：细胞实验、数据处理与文章润色；贾劭娜：YCM制备与文章润色；刘宇飞：实验方案设计与文章润色；朱宇飞、麻啸涛：实验方案设计、数据处理及文章润色；杨小军、徐坤：实验设计、实验进度跟进、文章润色及定稿。
作者利益冲突公开声明
作者声明没有任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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