塑料制品因其优越的物理特性而被广泛应用^[1]。据统计，2023年全球塑料产量超过4.3亿t^[2]，其中只有9%能被回收利用，12%被焚烧，而79%被填埋或直接遗弃至自然环境中^[3]。聚乙烯(polyethylene, PE)是以强碳碳键(C–C)聚合而成的石油基塑料^[4]，主要分为低密度聚乙烯(low density polyethylene, LDPE)、高密度聚乙烯(high density polyethylene, HDPE)和线性低密度聚乙烯(linear low density polyethylene, LLDPE)这3种类型^[1]。PE塑料焚烧会排放大量温室气体，加剧气候变化；而自然环境中PE很难被降解，海洋成为塑料废弃物最大的载体，大量塑料垃圾对海洋生态系统造成了严重的破坏，导致生物多样性急剧降低^[5]。在农业生产中，农用地膜大量使用，导致土地通气性和透水性下降、土壤肥力下降且微生物活性受到抑制，从而降低农作物产量^[6]。废弃PE塑料因紫外线、热辐射、风化、生物活动等因素逐渐形成尺寸小于5 mm的微塑料颗粒，部分微塑料会进入人体，增加心血管疾病发作的风险^[7]。因此，寻找高效、廉价、环保的废弃PE处理方法迫在眉睫。

目前处理PE废弃物的方法主要是粉碎、焚烧、填埋、回收和生物降解^[8]，其中生物降解因其环境友好型的特性被认为是最佳废弃塑料处理方法^[9]。目前已证实部分菌株具有PE降解能力，如Vimala等^[10]分离出一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，孵育30 d使紫外线照射预处理的LDPE薄膜质量损失9.26%。Yamada-Onodera等^[11]分离出一株青霉菌株(Penicillium sp.)，该菌株在180 d内使HDPE薄膜重量损失3.50%。虽然目前已发现部分菌株具有降解聚乙烯的能力，但降解菌株资源仍旧匮乏，其降解机制也有待进一步阐明。PE的强疏水性使得微生物很难在其表面定殖，稳定的分子结构使绝大多数生物酶都很难与其结合，并且没有合适的官能团作为降解位点，因而自然环境中PE的微生物降解过程十分漫长^[12]。垃圾填埋场中存在大量的PE废弃塑料，拥有复杂的微生物系统，其营养环境、湿度、温度等条件更加恶劣，是PE塑料天然的降解场所，筛选出的降解菌株有望具有更强的适应性和稳定性^[13]，因此更适合用来分离、筛选PE降解菌株。

PE生物降解的第一步是烷烃的羟基化，羟基进一步被氧化成脂肪酸，最终通过β-氧化途径被降解^[14]。这一过程中，最关键的起始步骤是塑料表面氧化。表面氧化大多是由光辐射、热辐射等非生物因素引起的^[15]，自然条件下PE塑料表面氧化需要数十年时间，随后细菌和真菌才能附着并开始降解过程^[16]。Sanluis-Verdes等^[15]从蜡虫唾液中纯化出2种酚氧化酶(Demetra和Ceres)，能够高效氧化未经处理PE，而漆酶(Lac, EC 1.10.3.2.)、木质素过氧化氢酶(LiP, EC 1.11.1.14)等^[17]氧化酶只能在添加非生物氧化剂的条件下氧化PE。非生物预处理不仅提高了应用成本，且无法直观地比对微生物之间降解作用的强弱^[18]，不利于精确评估微生物的降解效率，因此寻找一株无需预处理便能有效降解PE的菌株至关重要。

本研究从垃圾填埋场塑料废弃物中分离出一株PE降解菌株ETX1，孵育PE粉末和膜片后，通过失重率、接触角(contact angle, CA)、扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)、傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)等方法表征PE粉末和膜片结构和性质是否发生改变，从而验证菌株ETX1的降解特性。降解菌株ETX1的发现，不仅缓解了PE降解菌株资源短缺的问题，同时也为降解酶的挖掘奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 PE塑料废弃物采集

PE塑料废弃物样品采集自安徽省宣城市一处垃圾填埋厂，采用五点法取样，将废弃PE制品装入保藏盒中带回实验室−80 ℃保存，供后续实验使用。

LDPE薄膜购自广东省东莞市品诺盛包装材料有限公司；LDPE粉末为上述薄膜经液氮冰冻后，粉碎机粉碎过200目筛所得。

1.1.2 培养基

LB培养基：10 g/L NaCl，10 g/L胰蛋白胨(tryptone)，5 g/L酵母粉(yeast extract)；固体培养基添加20 g/L琼脂粉。

无机盐培养基(minimal salt medium, MSM)：0.700 g/L K₂HPO₄，0.700 g/L KH₂PO₄，0.700 g/L MgSO₄·7H₂O，0.005 g/L NaCl，1.340 g/L NH₄Cl，0.002 g/L FeSO₄·7H₂O，0.002 g/L ZnSO₄·7H₂O，0.001 g/L MnSO₄·H₂O；固体培养基添加20 g/L琼脂粉。

筛选培养基(low density polyethylene- minimal salt medium, LDPE-MSM，即添加聚乙烯粉末的MSM培养基)：0.100%–0.200% PE粉末，0.700 g/L K₂HPO₄，0.700 g/L KH₂PO₄，0.700 g/L MgSO₄·7H₂O，0.005 g/L NaCl，1.340 g/L NH₄Cl，0.002 g/L FeSO₄·7H₂O，0.002 g/L ZnSO₄·7H₂O，0.001 g/L MnSO₄·H₂O；固体培养基添加20 g/L琼脂粉。

1.2 方法 1.2.1 LDPE粉末灭菌清洗

灭菌：2%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)浸泡2 h，75%乙醇浸泡2 h，95%乙醇浸泡2 h，置于灭菌后的超净台吹干。

清洗：将LDPE粉末取出后，用2% SDS孵育2 h，去除生物膜，然后超声30 min使粉末与菌丝分离，滤纸(孔径大小为1–10 μm)过滤，12 000 r/min离心10 min，收集悬浮的粉末样品^[19]，75%乙醇浸泡2 h，再用去离子水清洗干净，55 ℃烘箱烘干8 h至恒重。

1.2.2 LDPE膜片灭菌清洗

灭菌：将膜片裁剪至合适大小后，去离子水清洗3次，75%乙醇浸泡2 h，95%乙醇浸泡2 h，置于灭菌后的超净台吹干。

清洗：将LDPE膜片取出后用蒸馏水清洗3次，2% SDS浸泡2 h，75%乙醇浸泡2 h，超声清洗30 min，再用蒸馏水清洗干净^[20]，55 ℃烘箱烘干8 h至恒重。

1.2.3 聚乙烯降解菌株的分离与筛选

称取垃圾填埋场塑料制品2.0 g加入18 mL的0.80% NaCl溶液中，放置于30 ℃摇床中180 r/min振荡30 min，制成种子液。将种子液按5%接种量加入含有95 mL MSM溶液的250 mL三角瓶中，添加2% LDPE粉末，加入2%酵母粉，在恒温摇床中30 ℃、180 r/min连续振荡培养14 d。将第一次富集液按照5% (体积分数)接种量加入新的含有95 mL MSM溶液三角瓶中，以LDPE为唯一碳源，继续培养14 d后，取二代富集培养液梯度稀释，涂布于LDPE-MSM平板，于30 ℃培养箱倒置培养2–3 d；挑取平板上生长状态情况最好的菌株划线于LB平板中，直至出现单菌落^[21]。

1.2.4 菌株形态学观察

观察菌株在LB平板上的颜色、形状、饱满程度，并通过革兰氏染色观察菌体形态。

1.2.5 PE降解效果验证

粉末降解效果验证：将LDPE降解菌株培养至对数期，离心收集菌体，重悬使其OD₆₀₀至0.8–1.0后，以5% (体积分数)接种量添加到含有0.1%–0.2% LDPE粉末的MSM液体培养基中，在30 ℃、180 r/min摇床中培养20 d，通过LDPE粉末质量损失、表面官能团变化表征菌株的降解效果。

膜片降解效果验证：将LDPE降解菌株培养至对数期，离心重悬后，以5% (体积比)接种量添加到含有0.1%–0.2% LDPE膜片的MSM液体培养基中，在30 ℃、180 r/min摇床中培养，设置时间梯度为30、60、90、120 d，取出膜片后清洗干净，计算其失重率，通过聚乙烯膜片表面形态、亲水性、表面官能团等变化表征菌株降解效果。

1.2.6 菌株16S rDNA测序及系统发育树构建

将降解菌株划线于LB平板中，挑取单菌落，采用16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGACTTA ACCCCAATCGC-3′)，对菌株16S rDNA进行扩增^[22]。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检查，扩增成功的PCR产物送至擎科生物科技有限公司进行测序。

利用NCBI数据库对菌株的16S rDNA序列进行序列比对分析。利用软件MEGA 11构建序列进化发育树，以初步判断分离菌株的种属地位。

1.3 降解效果表征方法 1.3.1 失重率

为了量化菌株降解率，将培养后的塑料取出，按上述方法去除表面附着菌体，并在55 ℃烘箱过夜烘干后称重。塑料失重率计算公式如下：

$ 重量损失=\frac{初始重量-残余重量}{初始重量}\times 100\%。$

1.3.2 扫描电子显微镜与接触角分析

处理干净的LDPE薄膜裁剪成合适大小后，将膜片固定在扫描电子显微镜的样品台上，对LDPE膜片的表面形貌进行观察并拍照记录^[23]。

将LDPE薄膜固定在样品台上，调整参数使样品清晰呈现在显示屏中央位置；根据指示，使用高速相机定格图像并在显示屏上显示出接触角^[24]。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

采用傅里叶变换红外光谱仪，对LDPE薄膜表面化学结构进行测试，以空气为参考，光谱扫描范围为400–4 000 cm^–1。将操作台升起至一定高度用酒精棉签擦拭，保持干燥清洁；将低密度聚乙烯粉末或膜片置于锗晶片上适当位置，以确保样品可以完全覆盖住透光区，将操作台降下压紧样品，使用OMNIC32软件进行样品采集，每个样品共进行32次采集。用连续变频的红外光照射样品，分子从基态跃迁到激发态，产生分子吸收光谱^[25]。

2 结果与分析 2.1 PE塑料降解菌株的分离与鉴定

将平板上生长状况较好的菌落挑出，纯化直至出现单菌落。共获得4株菌株，即ETX1 (图 1A)、JPEA-9 (图 1B)、JPEA-11 (图 1C)、A-21 (图 1D)，它们均能在PE为唯一碳源的筛选培养基上生长，其中ETX1生长状况最好。该菌株在平板中呈黄棕色，菌落湿润、平滑，单菌落呈规则圆状(图 1A)。革兰氏染色表明，ETX1菌株为革兰氏阴性(图 1E)。

将分离纯化的菌株ETX1接种于LB固体培养基上进行培养，扩增菌株16S rDNA后送公司测序。基于菌株ETX1 16S rDNA同源性比对分析发现，菌株ETX1与辣椒赖氨酸杆菌(Lysinibacillus capsici)相似度最高为100%，结合菌落特征以及菌体形态观察^[24]，该菌初步被鉴定为赖氨酸杆菌(Lysinibacillus sp.) (图 1F)。

2.2 LDPE粉末降解效果表征

LDPE粉末经菌株ETX1孵育20 d后(图 2A)，粉末颜色相较于对照组颜色发黄、颗粒变细、黏性降低，孵育后粉末质量损失为29.41%，对照组粉末质量损失17.61%。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析结果显示，LDPE粉末降解后产生新的官能团(图 2B)。从FTIR图谱可以看出，与对照组相比，处理组出现的特征吸收峰有羰基(–C=O)吸收峰(1 647 cm^–1)和羟基(–OH)吸收峰(3 255 cm^–1)。

2.3 LDPE薄膜降解效果表征

为了验证菌株ETX1对LDPE薄膜的降解能力，将菌株培养至对数期，离心收集菌体细胞后，接种到含有0.10%–0.20% LDPE薄膜的MSM液体培养基中，经30、60、90、120 d孵育后使得LDPE薄膜质量损失分别为(2.10±0.18)%、(2.21±0.15)%、(4.13±0.60)%、(5.23±0.29)% (图 3A)，且在孵育期间，观察到培养瓶变浑浊，菌株附着在膜片上。表明菌株ETX1在以LDPE为碳源的情况下能够有效生长，并使LDPE薄膜减重。

膜片表面形态和疏水性的改变，有利于微生物更好地生长并发挥降解作用。表面官能团的变化可以通过傅里叶变换红外光谱来表征。与对照组相比，经ETX1孵育后的实验组膜片红外光谱出现特殊吸收峰，图 3B中(1)、(2)、(3)处为孵育后LDPE膜片FTIR图谱中出现特殊吸收峰处，实验组(1) 1 081 cm^–1处出现醚基(–C–O–C–)吸收峰，实验组(2) 1 650 cm^–1处出现羰基(–C=O)吸收峰，实验组(3)的3 350 cm^–1处出现羟基(–O–H)吸收峰(图 3B)。羰基吸收峰的出现证明其表面被氧化，而羟基吸收峰的出现表明羰基被水解利用。

2.4 LDPE膜片扫描电子显微镜与接触角分析

通过SEM观察发现，相比于对照组(图 4A)，实验组(图 4B)膜片表面出现明显老化、破损和褶皱，LDPE膜片原本光滑紧密结构也因菌株ETX1的生物降解作用出现破坏，在处理组膜片表面出现较深的沟壑^[26]。

接触角结果显示(图 4C、4D)，水滴在对照组膜片的角度为91.9°，表明对照组膜片极度疏水，但处理组膜片水接触角为78.3°，接触角的降低表明经菌株ETX1孵育后膜片亲水性增加，更有利于微生物的附着^[24]。

3 讨论与结论

在PE塑料废弃物的生物降解研究方面，降解菌株资源十分匮乏，降解途径的解析进展缓慢^[20]。本研究从垃圾填埋场中分离出一株PE降解菌株ETX1，根据其菌株形态以及16S rDNA系统发育树分析，确定菌株ETX1为赖氨酸杆菌(Lysinibacillus sp.)。菌株ETX1在20 d内能使LDPE粉末质量损失29.41%，降解效果优于Zhang等^[27]分离出的菌株曲霉菌(Aspergillus sp.)，其培养28 d后HDPE粉末质量损失仅为3.90%。菌株ETX1在30 d内能使LDPE薄膜失重达2.10%，减重率接近Mukherjee等^[28]分离出的赖氨酸杆菌(Lysinibacillusa sp.)，该菌孵育经表面活性剂处理的PE膜片30 d后，减重率为2.97%。菌株ETX1孵育30 d和60 d的膜片减重相近，可能是在降解前期，菌株生长缓慢，降解速率增长慢，随着体系中微生物菌体密度变大，降解速率也随之增强^[29]。SEM结果显示膜片表面出现明显孔洞，表明微生物定植表面后，可将PE结构破坏并产生小分子物质被微生物利用，微生物迅速繁殖、聚集，使其结构破坏加剧^[30]。羰基等官能团被迅速水解成羟基导致孵育后的膜片亲水性明显提高，FTIR中出现羟基吸收峰，证明其氧化官能团被进一步水解，因此ETX1降解PE时可能先由氧化酶引入氧原子，再由水解酶进一步将其转化为更小的分子，如烷酸和线性脂肪醇^[31]。

目前，已经报道过能降解聚乙烯的赖氨酸杆菌(Lysinibacillus sp.)中有木聚糖赖氨酸杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)、纺锤型赖氨酸杆菌(Lysinibacillus fusiformis)等^[32]，但辣椒赖氨酸杆菌(Lysinibacillus capsici)具有降解聚乙烯能力还是首次证实。Montazer等^[33]分离的鞘脂单胞菌(Sphingobacterium sp.)能使经400 h紫外照射的LDPE薄膜在4周内质量损失26.8%，相比之下，ETX1孵育后膜片出现更深的沟壑、更明显的侵蚀痕迹，这可能是ETX1有更好的附着定植能力。Tao等^[34]分离出的红球菌(Rhodococcous sp.)孵育未预处理的LDPE塑料30 d后，膜片减重1%，而菌株ETX1孵育后LDPE膜片减重和的FTIR的羰基吸收峰都要强于Rhodococcous sp.，这可能是菌株ETX1在降解过程中存在氧化酶如漆酶、锰多加氧酶的高效表达，能够在相同条件下有更好的降解效果。菌株ETX1可以使得LDPE膜片亲水性提升15.45%，这说明在降解过程中ETX1存在羟基化酶的高效表达，使其可以迅速定殖在PE膜片表面，并羟基化支链碳^[35]。

近期研究表明，塑料表面氧化是生物降解塑料的瓶颈^[36]。本研究发现的菌株ETX1无需对LDPE薄膜预处理，在120 d内使膜片减重5.23%。结合SEM观察、接触角和FTIR分析，确定菌株ETX1具有降解LDPE塑料的能力。

菌株ETX1能够直接降解LDPE，推测其在以LDPE作为唯一碳源生长时，可能存在氧化酶的高效表达，这一特征可能是其实现降解能力的重要机制，这类酶被证实能够高效解聚LDPE^[15]。基于基因组、转录组和代谢组等组学技术，挖掘菌株ETX1降解基因，纯化PE降解相关氧化酶，探究PE生物降解的机制，是今后研究的重要方向。

作者贡献声明

王玉威：方案设计、实验操作、初稿写作；张李婷：数据管理、方案设计、经费支持、稿件润色修改；徐敏：数据管理、实验操作、提供材料；崔中利、曹慧：监督指导、稿件润色修改。

作者利益冲突公开声明

作者声明没有任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。