2025, Vol. 41中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 林明海, 胡连信, 郝丽萍, 王泽峰
- LIN Minghai, HU Lianxin, HAO Liping, WANG Zefeng
- 小型城市湿地微生物组及其固碳基因潜力分析
- Microbiome and its genetic potential for carbon fixation in small urban wetlands
- 生物工程学报, 2025, 41(6): 2415-2431
- Chinese Journal of Biotechnology, 2025, 41(6): 2415-2431
- CSTR: 32114.14.j.cjb.240399
- DOI: 10.13345/j.cjb.240399
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文章历史
- Received: May 15, 2024
- Accepted: August 12, 2024
- Published: August 13, 2024
引用本文
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2. 天津大学 地球系统科学学院, 天津 300072
2. School of Earth System Science, Tianjin University, Tianjin 300072, China
全球气候变化是当今人类面临的最紧迫的挑战之一[1]，而气候变暖的主要原因是大气中温室气体(主要是二氧化碳和甲烷)浓度以极快的速度增长[2]。湿地作为一种独特的生态系统，是各种主要温室气体的“源”与“汇”，在调控全球气候变化中起着特殊作用[3]。其中小型城市湿地分布广泛，受人类活动影响，富营养化程度较高，也被证实是重要的温室气体排放源[4]。湖州市位于太湖南岸，拥有众多小型湿地，是“绿水青山就是金山银山”这一理论的发源地[5]，因此研究其碳生物地球化学循环过程具有重要的科学意义。
微生物在湿地生态系统中扮演着重要角色，它们通过光合作用和化学合成作用固定无机碳，又通过分解作用释放碳[6]，参与了植物凋落物等大分子有机物向CO2、CH4等温室气体的转化，以及CO2固定、CH4氧化等关键过程，由此影响着碳的留存和释放[7]。在湿地这个复杂环境中，参与不同代谢过程、具有不同功能的微生物种群组成一个复杂混合的群落，其中大部分是未培养的物种，人们对其群落组成和潜在功能的理解仍然非常有限。1998年Handelsman等[8]提出了宏基因组概念，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，宏基因组与高通量测序(high-throughput sequencing)技术的引入为环境微生物研究带来了突破性进展。
本研究运用高通量测序与宏基因组分析技术，为湖州地区3个小型城市湿地的微生物组构建了基因组数据集，分析了其群落组成、优势物种及在碳循环中的潜在功能，并与典型的自然湿地-若尔盖高原湿地的微生物组进行了同步分析和比较。本研究为深入了解小型城市湿地微生物组的物种多样性、基因组成和功能潜力提供了新的视角，对于揭示微生物驱动的碳循环具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 湿地样本采集与选取在浙江省湖州市(120.13E, 30.88N)选择了3个不同类型的城市湿地采样点，其中A1采样点位于湖州某高校内的景观湖，B2采样点位于相近区域的人工水渠，C3采样点位于湖州城内河，于2022年12月采集了水体中的表层沉积物(0–5 cm)，置于冰上，运回实验室于–40 ℃冰箱保存，后分别用于DNA提取、高通量测序和理化性质分析。样品的理化性质信息见表 1。
| Physical and chemical properties | A1 | B2 | C3 |
| pH | 8.110 | 7.810 | 8.100 |
| Conductivity (μs/cm) | 230.000 | 96.100 | 133.200 |
| Li+ (mg/L) | 0.015 | 0.015 | 0.017 |
| Na+ (mg/L) | 3.372 | 3.813 | 10.471 |
| NH4+ (mg/L) | 1.769 | 1.188 | 1.414 |
| K+ (mg/L) | 3.864 | 2.379 | 5.228 |
| Mg2+ (mg/L) | 1.151 | 1.092 | 2.558 |
| Ca2+ (mg/L) | 13.394 | 10.356 | 13.896 |
| F– (mg/L) | 1.218 | 1.710 | 1.128 |
| Cl– (mg/L) | 1.294 | 1.349 | 4.280 |
| NO2– (mg/L) | 1.451 | 1.470 | 1.349 |
| SO42– (mg/L) | 11.587 | 3.733 | 20.455 |
| NO3– (mg/L) | 0.171 | 0.144 | 0.308 |
| PO43– (mg/L) | 0.557 | 0.001 | 0.037 |
本研究所引用的自然湿地的微生物组数据，其样本来源于若尔盖湿地花湖国家保护区(102.52E, 33.56N)，有30 cm水覆盖的沉积物表层(0–10 cm)，湖泊及周边地区拥有丰富的植被。本研究中的城市湿地与自然湿地均属于淡水环境，城市湿地受人为活动干扰较多，如有生活污废水排入、观赏性禽类养殖等；而自然湿地则受人为活动干扰较少。
1.2 沉积物理化性质测量对沉积物的pH、电导率和常见阴阳离子的浓度进行了分析。其中pH采用WTW水质检测仪(pHION3310)测量，电导率采用MultiLab IDS (4010-1W)测量。主要阴、阳离子浓度使用离子色谱仪(thermo dionex ICS 5000+)进行测量。测试离子浓度前对沉积物进行了风干、去杂、磨细、提取等操作[9]，具体为：将取得的样品在通风避光处风干，过20 mm筛后，称取土壤试样5.00 g于样品瓶中，加50 mL水溶解，在恒温振荡机上振荡30 min后，用布氏漏斗双层滤纸过滤，经0.45 μm水相滤膜过滤，取滤后的清液测试离子浓度。
1.3 DNA提取样品DNA使用ALFA-SEQ Advanced Stool DNA Kit进行提取，并在1%琼脂糖凝胶上检测DNA的完整性和纯度。同时用Qubit 3.0和NanoDrop One (ThermoFisher公司)检测DNA浓度和纯度。
1.4 16S rRNA基因扩增子测序与数据处理利用提取的DNA样品进行16S rRNA基因扩增子高通量测序。以基因组DNA为模板，使用带有标签序列(barcode)的特异引物(515F和806R)对V4区域进行PCR扩增，使用的试剂盒为TaKaRa Premix Taq® version 2.0。PCR反应使用BioRad S1000 PCR仪进行，扩增后的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确定片段长度和浓度。接着进行PCR产物的浓度比较，使用GeneTools Analysis Software (v4.03.05.0, SynGene)进行分析，按照等质量原则计算各样品所需体积，实现PCR产物的混合，混合后的产物通过E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit (Omega公司)凝胶回收试剂盒进行回收，再使用TE缓冲液进行洗脱回收目标DNA片段。接着按照NEBNext® UltraTM II DNA Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs公司)标准流程进行建库。最后，使用Illumina Nova 6000平台对构建的扩增子文库进行PE250测序。
对于测序生成的原始序列，使用qiime2 (v2021.4)[10]中的“cutadapt”模块去除了接头(adapter)和引物(primers)，接着采用“demux”模块创建可视化文件，采用“dada2”模块对序列进行质控和降噪[11]，产出扩增子序列变体(amplicon sequence variant, ASV)，基于Silva 138数据库对ASV进行物种分类。最后，使用FAPROTAX中的“collapse table.py”脚本对ASV分类表进行群落功能注释预测[12]，软件内嵌使用的原核功能注释数据库是基于目前已发表的文献资料整理获得。
1.5 宏基因组测序与数据处理利用提取的DNA样品，使用ALFA-SEQ DNA Library Prep Kit生成测序文库，并添加索引代码。采用Qubit4.0荧光仪(Life Technologies公司)和QSEP400高通量核酸蛋白分析系统[Houze Biotechnology (Hangzhou) Co., Ltd.]对文库质量进行评价。最后，在Illumina NovaSeq 6000平台上对文库进行PE150测序。
对于生成的原始序列，先利用MetaWRAP[13]中的“read qc”模块修剪接头并删除adapter。然后，使用“assembly”模块将修剪后的序列组装成contigs。接下来，采用“binning”模块进行自动分箱操作，为提高分箱质量，在此过程中使用MetaBAT2[14]、MaxBin2[15]和Concoct[16]这3种分箱工具，在完成分箱后使用“bin refinement”模块对不同工具产生的分箱输出进行整合和改进。随后，使用dRep[17]工具对bins进行去冗余操作。接着再使用CheckM[18]评估bins的质量。使用GDTB-Tk[19]进行物种分类，以获取分类信息。对获取的组装基因组使用Prokka[20]进行注释；最后使用EnrichM软件对蛋白质序列文件进行功能注释。本研究基于KEGG数据库构建和分析了原核生物的固碳途径。使用phyloFlash对宏基因组中的16S rRNA基因序列数据进行提取和分析[21]，使用“min-ntu-count”模块筛选出丰度较高的细菌和古菌物种，辅助分析微生物群落的组成和相对丰度情况。在R中使用Vegan软件针对扩增子的fubiao s和phyloFlash的结果分析了Shannon指数、Simpson指数和覆盖度(Goods_coverage)。
此外，MAGs在各个湿地中的丰度覆盖度(coverage)结果已提交至国家微生物科学数据中心(http://nmdc.cn/)，登录号：NMDCX0000427。Coverage按公式(1)计算：
| $ \begin{gathered} \text { Coverage }= \\ \frac{原始序列映射到\text{MAGs}序列中的数量\times 序列长度}{\text{MAGs}序列总长度} \end{gathered} $ | (1) |
其中原始序列映射到MAGs序列中的数量使用CoverM进行统计。
青藏高原若尔盖湿地(101.36E, 32.20N)的沉积物宏基因组数据从欧洲核苷酸档案库(European Nucleotide Archive, ENA)中下载，BioProject编号为PRJNA644254[22]，BioSample编号为SAMN15455434和SAMN15455435。本研究的原始数据已上传至国家微生物科学数据中心(登录号：NMDC10018751)。
2 结果与分析 2.1 沉积物的理化性质表 1展示了3个湿地采样点的沉积物的理化性质。与沉湖湿地[23]、白洋淀湿地[24]、东平湖湿地[25]等自然淡水湿地相比，3处湿地采样点的pH值与其相似(以上3处自然淡水湿地pH均在7.5–9.0之间)，均为偏碱性环境。此外，发现C3处的SO42–浓度与Na+浓度显著高于另外2个采样点位，A1处的PO43–浓度显著高于其他湿地。
2.2 微生物群落组成本研究采用16S rRNA基因扩增子和宏基因组测序技术分析了湖州市内3个小型湿地采样点的微生物组。A1、B2、C3分别获得66 260、64 273、66 824条扩增子序列和35 034 941、37 649 319、42 817 124条高质量DNA序列，并从宏基因组中识别和提取了非扩增的16S rRNA基因序列。分别基于16S rRNA基因扩增子和非扩增的16S rRNA基因序列分析了群落的物种组成，共鉴定出66个门类、362个目类、537个科类、802个属类。为了探索城市湿地与自然湿地的异同，从公共数据库下载了2个代表自然湿地的宏基因组数据(W1、W2)，与本研究的样品进行了比较。
两种分析方法均显示细菌域中(图 1)，伯克氏菌目[Burkholderiales，隶属于变形菌门(Proteobacteria)]和拟杆菌目[Bacteroidales，隶属于拟杆菌门(Bacteroidota)]是所研究城市湿地和自然湿地中丰度最高的细菌目，二者在城市湿地中占比大于26%，在自然湿地中占比大于15%。其他一些功能菌种，如Methyloccocales目(存在甲烷氧化细菌成员，隶属于变形菌门)和Geobacteriales目[存在直接电子传递的细菌成员，隶属于脱硫杆菌门(Desulfobacterota)]的物种，在城市和自然湿地中也均被检测到。2种类型湿地的微生物物种组成上既表现出一定相似性，也存在一定差异性。例如，伯克氏菌目在城市湿地(> 18%)占比大于自然湿地(> 9%)，弯曲菌目[Campylobacterales，隶属于弯曲菌门(Campylobacterota)]与肠杆菌目(Enterobacterales，隶属于变形菌门)也主要存在于城市湿地中(前者在B2水渠占比 > 5.8%，后者在A1景观湖占比 > 11.7%)。在自然湿地样本中，根瘤菌目(Rhizobiales，隶属于变形菌门)和厌氧绳菌目[Anaerolineales，隶属于绿弯菌门(Chloroflexi)]则具有更高的丰度，占比约12.6%，可能受湿地植物覆盖率高的影响。
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| 图 1 基于扩增16S rRNA基因(A、B)与非扩增16S rRNA基因(C、D)的细菌、古菌群落组成及其相对丰度 Fig. 1 The composition of bacterial and archaeal communities based on amplified 16S (A, B) and nonamplified 16S (C, D). At the phylum and order levels, A and C only retain the highest abundance of 15 bacterial orders, while B and D only retain the highest abundance of 5 archaeal orders. "HZ" represents Huzhou, "QZ" represents Qinghai-Xizang Plateau. 门、目层级，A、C均只保留丰度最高的15个细菌目，B、D均只保留丰度最高的5个古菌目。“HZ”代表湖州，“QZ”代表青藏高原。 |
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古菌域中，Woesearchaeales目[隶属于纳米古菌门(Nanoarchaeota)]和深古菌目[Bathyarchaeia，隶属于泉古菌门(Crenarchaeota)]在城市湿地中具有较高丰度(前者在C3河流占比0.8%，后者在B2水渠占比0.5%)。而在自然湿地中则检测到了更多的产甲烷古菌，例如嗜盐古菌门(Halobacterota)下的甲烷八叠球菌目(Methanosarciniales)与甲烷微球目(Methanomicrobiales)。
2.2.1 微生物群落多样性基于微生物群落的物种组成，分别计算了Shannon指数、Simpson指数和覆盖度(Goods_coverage)，以估算微生物群落的多样性和数据的覆盖度。从表 2中可以看出，城市湿地中，C3河流比A1景观湖和B2水渠展现了更高的微生物群落多样性，可能因为河流有外源微生物随污水排入而输入。宏基因组16S rRNA基因序列的覆盖度略低于1，因此预测得到的物种多样性要低于扩增子分析，其预测结果可能受测序深度影响。
| Data source | Sample | Shannon | Simpson | Goods_coverage |
| 16S rRNA gene amplicon 1 | A1 | 6.367 | 0.995 | 1.000 |
| 16S rRNA gene amplicon | B2 | 6.369 | 0.991 | 1.000 |
| 16S rRNA gene amplicon | C3 | 6.975 | 0.998 | 1.000 |
| Metagenomic 16S rRNA gene 2 | A1 | 5.511 | 0.985 | 0.979 |
| Metagenomic 16S rRNA gene | B2 | 5.783 | 0.989 | 0.980 |
| Metagenomic 16S rRNA gene | C3 | 5.780 | 0.992 | 0.975 |
| Metagenomic 16S rRNA gene | W1 | 5.931 | 0.993 | 0.986 |
| Metagenomic 16S rRNA gene | W2 | 5.945 | 0.993 | 0.988 |
| 1: Amplicon sequence variants obtained based on 16S rRNA gene amplicon data; 2: Reads mapped to 16S rRNA gene sequences obtained from the metagenome sequencing data. | ||||
本研究共构建了60个完整度 > 50%、污染度 < 10%的组装基因组(MAGs)，基因组的质量和物种分类等信息已上传至国家微生物科学数据中心(登录号：NMDC10018751)。它们代表了所研究环境中丰度较高的优势物种。60个MAGs中有55个属于细菌、5个属于古菌。古菌MAGs分别隶属于Thermoplasmatota门、纳古菌门(Nanoarchaeota)和Altiarchaeota门(图 2)。
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| 图 2 60个组装基因组的系统发育分类树及其在不同样品中的相对丰度 Fig. 2 Phylogenetic tree of the 60 MAGs with heatmap showing their relative abundance in different samples. |
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这60个MAGs代表的物种在城市湿地的3个采样点和高原自然湿地的2个采样点分别呈现了相似的分布特征，但在2种湿地类型之间却存在显著差异。例如，隶属于假单胞菌门(Pseudomonadota，GTDB-R214命名体系，来源于变形菌门) JAGOXX01属的MAG18、MAG12和MAG13在城市湿地中具有相对较高的丰度，但在自然湿地中丰度极低；绿弯菌门(Chloroflexota)的MAG44 (UBA3254属)与MAG39 (UBA5195属)在自然湿地中的丰度则远高于城市湿地。对于古菌物种，MAG56 (纳古菌门UBA7239属)在C3中表现出一定丰度(覆盖度为6.1，登录号：NMDC10018751)，其他4个MAGs则主要分布在自然湿地。
尽管丰度上存在差异，但大部分物种仍同时存在于城市湿地和自然湿地中。例如，隶属于脱硫杆菌门的MAG34 (SpSt-501属)、MAG48 (SpSt-501属)、MAG10 (JAFGDM01属)、MAG30 (UBA2192属)，以及拟杆菌门的MAG9 (Draconibacterium属)等。
2.3 湿地微生物组的代谢功能潜力 2.3.1 微生物编码的碳、氮、磷等代谢途径基于KEGG数据库中的代谢途径模块，分析了60个MAGs所编码的基因和各代谢途径模块的完整度情况，筛选出完整度超过50%的代谢途径模块，主要包括碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、能量代谢(energy metabolism)、磷代谢(phosphorus metabolism)等(图 3)。
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| 图 3 60个组装基因组中具有较高完整度的关键代谢途径 Fig. 3 Bubble diagram of metabolic pathways of 60 MAGs. Only 61 metabolic pathway modules with at least one MAG exceeding 50% completeness are shown. The abbreviated pathway names are at the bottom of the figure. degrad: degradation; PPP: Pentose phosphate pathway; RPPC: Reductive pentose phosphate cycle; path: pathway; Fa-XMP: Formaldehyde assimilation, xylulose monophosphate pathway; MM: Methane metabolism; Fa-SP: Formaldehyde assimilation, serine pathway; Fa-RMP: Formaldehyde assimilation, ribulose monophosphate pathway. 仅展示了61个至少在1个MAG中完整度超过50%的代谢途径模块。 |
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核心碳代谢途径涉及葡萄糖、丙酮酸等单体的降解转化或细胞合成作用，如核糖合成、三羧酸循环等[26]。如图 3所示，超过30个MAGs都存在数种较为完整的核心碳代谢途径，其中MAG45 (拟杆菌门Fluviicola属)编码了完整的糖酵解/糖异生途径(glycolysis/gluconeogenesis)，MAG29 [疣微菌门Verrucomicrobiota童第周菌属(Tichowtungia)]、MAG53 (假单胞菌门UBA7239科)编码了完整的戊糖磷酸循环(pentose phosphate cycle)。
多糖的降解，例如半乳糖降解(galactose degradation)、蔗糖降解(sucrose degradation)等，是湿地中动植物残体被微生物分解进入土壤碳循环的重要过程。有16个MAGs编码了数种较为完整的多糖降解途径，其中属于拟杆菌门的MAG3 (UBA4417属)、MAG6 (UBA4417属)、MAG51 (LD21属)均完整编码了半乳糖与蔗糖的降解途径，尤其是MAG6的基因组中存在118个碳水化合物活化酶(carbohydrate activating enzyme)的基因(登录号：NMDC10018751)，说明其可能在降解多糖化合物中起着重要作用。此外，氨基酸是蛋白质水解后的单体[27]。部分MAGs也编码了氨基酸的降解途径，如MAG20 [拟杆菌门黄杆菌属(Flavobacterium)]完整编码了组氨酸的降解途径。
短链有机酸是糖、氨基酸、长链脂肪酸等发酵后的中间代谢产物[28]，其分解氧化过程也是细菌的重要碳或能量来源。有39个MAGs完整编码了丙酸转化为丙酰辅酶A的途径(propionate to propanoyl-CoA)，其中丙酰辅酶A是重要的代谢中间产物，参与多个生物化学过程，对于维持细胞的能量平衡、合成生物分子以及维持整体代谢功能十分重要[29]。有14个MAGs具有利用乳酸的基因潜力。MAG19 (疣微菌门UBA6082属)和MAG51等均完整编码了丁酸向丁酰辅酶A的转化途径(butyrate to butanoyl-CoA)。
有机碳的代谢产物如乙酸、甲基化合物、CO2等，在厌氧环境下可以被转化为甲烷或其他代谢产物[30]。例如MAG58 (Methanomassiliicoccales目)编码了甲基营养型产甲烷途径(MM-CH4 production，完整度为50%)。这些MAGs所代表的细菌古菌物种在驱动土壤有机质矿化或者向甲烷转化的过程中具有重要的生态功能。
湿地的碳循环与氮循环和磷循环也密切相关，例如泥炭地中的初级生产力通常受氮或磷可用性的限制[31]。在研究中也检测到了氮、磷相关的代谢途径与基因，如磷代谢中调控和转运磷酸盐的关键基因PhoU与Pit，氮代谢中的异化型硝酸盐还原途径(dissimilatory nitrate reduction)、NtrY-NtrX双组分调节系统等。
2.3.2 微生物编码的固碳途径和关键基因湿地作为地球之肾，固碳能力是森林的3倍[32]，除了植物光合作用，微生物固碳也在其中发挥了重要作用。迄今发现的原核生物固定CO2的6种经典途径包括：卡尔文循环(Calvin cycle)、还原三羧酸循环(Reductive citrate cycle)、还原乙酰辅酶A途径(Wood-ljungdahl pathway，又称为Reductive acetyl-CoA)、3-羟基丙酸循环(3-hydroxypropionate bicycle)、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环(3-hydroxypropionate/ 4-hydroxybutyrate)、二羧酸/4-羟基丁酸循环(dicarboxylate/4-hydroxybutyrate)[33]。根据固碳基因的存在与缺失，对60个MAGs编码固碳途径的完整度进行了分析。如图 4所示，部分MAGs各自编码的固碳途径完整度超过70%，涉及还原乙酰辅酶A途径、还原三羧酸循环与卡尔文循环。
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| 图 4 60个MAGs的固碳途径完整度气泡图及关键基因存在与缺失热图 Fig. 4 Bubble diagram of carbon fixation pathways and heatmap showing presence/absence of key genes for 60 MAGs. |
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卡尔文循环是植物和藻类光合作用固碳的初始途径[34]，是生物体中最常见的CO2固定方式[35]。参与卡尔文循环的核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶(rubisco)存在I型和II型这2种形式，负责催化1, 5-二磷酸核酮糖与CO2反应，实现固碳[36]。I型rubisco酶由cbb L (或称rbc L)基因编码，常见于类绿色菌群(植物、蓝藻、绿藻、α变形菌、β变形菌和γ变形菌等)、类红色菌群(红藻、褐藻、α变形菌和β变形菌等)[37]。如图 5A所示，有4个MAGs编码该途径的完整度大于70%。本研究中隶属于蓝细菌门的MAG17 [片状微囊藻(Microcystis panniformis)]编码了卡尔文循环途径(完整度80%)并携带关键基因cbb L。物种丰度分析发现，该物种在5个样品中都存在，在A1 (景观湖)处丰度最高(覆盖度为25.8，登录号：NMDC10018751)。基于16S rRNA基因扩增子的分析同样显示，该菌种在A1采样点的序列丰度最高(1.76%，登录号：NMDC10018751)，说明其是该湖泊环境中最主要的光合固碳藻。除了单细胞藻类，还发现一些细菌如MAG20 (拟杆菌门黄杆菌属Flavobacterium)，MAG22 (弯曲菌门Aliarcobacter属)与MAG45 (拟杆菌门Fluviicola属)也编码了完整度较高(大于70%)的卡尔文循环，说明这些细菌物种也可能是光合固碳的重要参与者，进一步表明了执行卡尔文循环固碳这一功能类群的微生物群体具有一定的生物多样性。
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| 图 5 本研究中细菌MAGs所编码的固碳途径 Fig. 5 The carbon fixation pathways encoded by the assembled bacterial genomes in this study. A: Calvin cycle; B: Reductive citrate cycle; C: Wood-ljungdahl pathway; D: Reduced glycine pathway. Gene names in blue bold represent key genes, in green represent key genes involved in CO2 fixation. A：卡尔文循环；B：还原三羧酸循环；C：乙酰辅酶A途径；D：还原型甘氨酸途径。其中蓝色加粗的基因代码为关键基因，绿色加粗为直接催化CO2固定的关键基因。 |
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还原三羧酸循环可以将CO2固定为储能的有机物质[38]，常见于绿硫细菌、亚硝酸盐氧化菌等细菌物种中。该途径的关键基因包括：por CDAB/nif J (编码丙酮酸：铁氧化还原蛋白氧化还原酶)、oor ABDC (编码2-氧戊二酸：铁氧还原蛋白氧化还原酶)和acl AB (编码柠檬酸裂解酶)[39]。此外，本研究也同时发现ppc和IDH基因分别编码了催化磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)与CO2反应生成草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和催化2-氧戊二酸与CO2反应生成异柠檬酸的异柠檬酸脱氢酶。如图 5B所示，有5个MAGs编码该途径的完整度大于70%。其中MAG6 (拟杆菌门UBA4417属)编码的完整度最高(81.82%)。该物种主要存在于A1湿地中(覆盖度为7.9，登录号：NMDC10018751)。
还原乙酰辅酶A途径是产生能量和固定无机碳最重要的代谢途径之一[40]，发现于可利用氢的化能自养厌氧菌，如同型产乙酸菌、产甲烷古菌等[41]。一氧化碳脱氢酶(carbon monoxide dehydrogenase, CODH)和乙酰辅酶A合成酶(acetyl-coenzyme A synthetase, ACS)是该途径的关键酶[42]，编码基因分别为acs A和acs B。在该途径中，编码基因为fdh的甲酸脱氢酶首先将CO2转化为甲酸(formate)，本研究中也将其归类为关键固碳酶(图 5C)。有3个MAGs编码了还原乙酰辅酶A途径(完整度大于70%)，分别为MAG44 (绿弯菌门UBA3254属)、MAG55 (脱硫杆菌门Syntrophorhabdus属)与MAG60 (Thermoplasmatota门Methanomassiliicoccales目)。其中，MAG55的编码完整度最高(85.7%)，并含有关键基因acs AB，其主要存在于自然湿地中(w1覆盖度为21.7，w2覆盖度为27.2，登录号：NMDC10018751)。
剩余3种经典固碳途径在60个MAGs中编码完整度均低于50%，可能在目标研究环境中不占优势。除了经典固碳途径外，还原型甘氨酸途径(reductive glycine pathway)作为第7种固碳途径，被发现可以支持微生物的自养生长[43]。如图 4所示，本研究有11个MAGs编码了该途径(完整度高于70%)。该过程的关键固碳酶为氨基甲基转移酶(aminomethyltransferase)、甘氨酸脱氢酶(glycine dehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase)，对应的编码基因分别为gcv TP和fdh (图 5D)。其中，MAG6 (拟杆菌门UBA4417属)、MAG19 (疣微菌门UBA6082属)、MAG27 (假单胞菌门UBA5518属)编码完整程度均大于85%，但缺失fdh基因；而与MAG6同属的MAG3的编码完整度为71.43%，说明这些物种可能具有通过还原型甘氨酸途径固定CO2的基因潜力。
2.3.3 基于16S rRNA基因扩增子结果预测群落功能宏基因组组装基因组技术可以分析环境微生物组中高丰度优势菌种的基因组和代谢功能信息，但低丰度物种的信息则可能缺失。作为补充，本研究还基于16S rRNA基因扩增子结果预测了小型城市湿地微生物群落驱动元素循环的功能，但该方法也仅能分析其中检测到的已知功能的物种(即已在FAPROTAX数据库中得到注释的物种)的信息。分析结果展示了微生物组丰富的营养代谢类型和生物地球化学功能(图 6)。如碳元素循环中的纤维素水解、木聚糖和几丁质水解、有机物发酵(fermentation)、乙酸化、甲醇氧化(methanol oxidation)、产甲烷、甲烷氧化(methanotrophy)；氮元素循环中的硝酸还原(nitrate reduction)、氮固定(nitrogen fixation)、硝酸盐呼吸(nitrate respiration)等；硫元素循环中的硫酸盐呼吸(sulfate respiration)、硫代硫酸盐呼吸(thiosulfate respiration)等；金属元素循环中的铁锰呼吸等，都存在于该生境中。
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| 图 6 基于16S rRNA基因扩增子分析的物种组成来预测微生物群落的功能 Fig. 6 Prediction of microbial community function from taxonomy composition based on 16S rRNA gene analysis. |
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然而，部分代谢途径在3处湿地的作用程度有所差异，这可能与湿地环境理化性质的差异影响了微生物的生态位有关。例如，C3湿地中SO42–浓度较高(20.455 mg/L)，而硫酸盐呼吸代谢在C3湿地的丰度最高，能够进行硫酸盐呼吸的脱硫杆菌属(Desulfurobacterium)[44]也存在于该环境中。
3 讨论与结论湿地在调节气候变化中起到重要作用，小型城市湿地由于受人类活动影响大，富营养化程度高，是重要的温室气体排放源。但目前对小型城市湿地微生物组及其参与碳循环的研究较少，且鲜有针对城市湿地和自然湿地的比较。本研究通过宏基因组技术同步分析和比较了湖州市小型城市湿地和若尔盖高原自然湿地的微生物组的组成、元素代谢途径及其在固碳和碳代谢中的潜在功能，揭示了城市湿地和自然湿地微生物组成的主要异同，发掘了细菌固碳的基因潜力，发现了其中固碳功能菌群的多样性。
小型城市湿地与自然湿地的微生物组具有一定相似性，均展现了丰富的物种多样性，且其中丰度最高的优势菌目均为伯克氏菌目和拟杆菌目，说明其驱动元素循环的核心功能可能具有一定的保守性。但二者在具体物种丰度上也体现了一定的差异性：例如，细菌域的伯克氏菌目在城市湿地占比大于自然湿地(18% vs. 9%)。该目级类群的一些成员能够有效降解环境污染物，如土壤中的甲苯等芳香族污染物、三氯乙烯等氯化溶剂等[45]，因此其高丰度存在指示了更高程度的人类活动污染；弯曲菌目与肠杆菌目也主要存在于城市湿地中，弯曲菌目下的许多物种栖息在动物的消化道中，如人和动物肠道致病菌空肠弯曲菌属(Campylobacter)[46]；肠杆菌目下的成员主要栖息于土壤、水中以及与植物、昆虫、动物和人类等生物体共生，其中许多成员已被证实是人类和动物的病原体[47]。这些物种的存在可能与生活污水或水禽排泄物的输入有关。与城市湿地相比，自然湿地则在古菌域中检测到了更多的产甲烷古菌种类，例如嗜盐古菌门甲烷八叠球菌目与甲烷微球目。若尔盖湿地是青藏高原甲烷排放的核心区[48]，已有研究认为产甲烷八叠球菌和产甲烷微菌是其中主要的产甲烷菌类群[49]，本研究的分析结果与此一致。可见物种组成的具体差异在一定程度上体现了不同湿地类型受污染程度和元素循环功能上的差异。
固碳是湿地的重要生态功能，微生物在固碳中发挥了重要作用[50]。本研究基于组装基因组解码和代谢途径重构，揭示了在2种湿地类型中细菌具有重要的固碳基因潜力。发现了23种细菌(分别属于拟杆菌门下黄杆菌属、UBA4417属，脱硫杆菌门Syntrophorhabdus属等)编码了卡尔文循环、还原三羧酸循环、还原乙酰辅酶A途径和还原型甘氨酸途径(完整度高于70%)，而且同一环境中至少存在5种具有固碳潜力的细菌，说明固碳功能类群具有丰富的物种多样性、功能冗余性与途径多样性特征。其中，隶属于Syntrophorhabdus属(脱硫杆菌门)和UBA4417属(拟杆菌门)的固碳基因潜力此前鲜有报道，可能是潜在的新型固碳细菌。这些菌种在湿地微生物组中具有相对较高的丰度，表明原核生物可能是湿地固碳的重要驱动者。不同类型湿地所发现的固碳菌物种有所差异，说明该功能类群的分布具有一定的空间异质性，例如藻类固碳菌与能够降解藻类代谢产物的固碳细菌主要分布在城市湿地中(如MAG17、MAG6)，这可能与城市湿地受人类活动影响导致富营养化程度较高有关。
除了固碳以外，这些细菌大多还编码了其他多种代谢途径，例如MAG6除了具有基于还原三羧酸循环的固碳潜力外，同时还编码了降解蔗糖、乳糖和活化多种碳水化合物大分子的基因。Zheng等[51]研究发现拟杆菌门是深海沉积物中的主要细菌门，具有降解来源于藻类的海洋多糖的能力，并且比其他细菌拥有更多参与降解多糖的基因。本研究中的MAG6所代表的拟杆菌成员也可能在湿地中降解藻类来源的多糖的同时异养固碳的过程中发挥着重要作用。此外，Syntrophorhabdus属的代表性成员Syntrophorhabdus aromaticivorans则是一种可降解间苯二甲酸酯的互营细菌[52]，展示了该属成员的功能多样性。
综上所述，湿地微生物组中存在多种自养或异养固碳细菌，具有通过卡尔文循环、还原三羧酸循环、还原乙酰辅酶A途径和还原型甘氨酸途径固碳的基因潜力。说明该功能类群具有丰富的物种多样性和功能冗余性，其中包括隶属于Syntrophorhabdus属(脱硫杆菌门)和UBA4417属(拟杆菌门)的潜在的新型固碳细菌，且这些菌种在湿地微生物组中具有相对较高的丰度，表明原核生物可能是湿地固碳的重要驱动者。而不同类型湿地所发现的固碳菌物种有所差异，说明该功能类群的分布具有一定的空间异质性。这些固碳菌对于增强小型城市湿地的碳汇功能具有重要意义。此外，发现多个物种编码了大量碳水化合物激活酶，参与糖类、蛋白类、有机酸等复杂有机化合物的降解，或甲烷生成、氮硫磷元素的循环过程。这些研究结果从物种和功能组成角度，加深了研究人员对小型城市湿地微生物组和碳等主量元素循环过程的认识。
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