2025, Vol. 41中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 谢卓斌, 王芸, 蒋刚强, 李雨薇, 李文昌, 刘一帆, 吴张秀, 黄媛媛, 唐蜀昆
- XIE Zhuobin, WANG Yun, JIANG Gangqiang, LI Yuwei, LI Wenchang, LIU Yifan, WU Zhangxiu, HUANG Yuanyuan, TANG Shukun
- 一株中度嗜盐异养硝化-好氧反硝化盐单胞菌5505的分离和氮转化特性
- Isolation and nitrogen transformation characterization of a moderately halophilic nitrification-aerobic denitrification strain Halomonas sp. 5505
- 生物工程学报, 2025, 41(6): 2467-2482
- Chinese Journal of Biotechnology, 2025, 41(6): 2467-2482
- CSTR: 32114.14.j.cjb.240749
- DOI: 10.13345/j.cjb.240749
-
文章历史
- Received: September 16, 2024
- Accepted: November 13, 2024
- Published: November 13, 2024
引用本文
|
2. 乌鲁木齐海关技术中心, 新疆 乌鲁木齐 830063;
3. 云南大学 生命科学学院 云南省微生物研究所 生物资源保护与利用重点实验室 微生物资源教育部重点实验室, 云南 昆明 650091
2. Urumqi Customs Technology Center, Urumqi 830063, Xinjiang, China;
3. Yunnan Institute of Microbiology, Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resource, and Key Laboratory for Microbial Resources of the Ministry of Education, School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650091, Yunnan, China
我国含盐废水来源广泛、排放量巨大，这些来自沿海城市生活污水以及皮革、制药、食品加工和化工生产等行业产生的废水，含盐量普遍超过3.5%，不仅含有高浓度氮素，并且富含Cl–、SO42–、Na+和Ca2+等无机离子[1-2]。高盐高氮废水如果不经处理直接排放到自然水体中，会引发一系列环境问题，如土地盐碱化、水体富营养化、藻类暴发、生物多样性降低等，严重威胁人类生存与健康[3]。生物脱氮是目前污水脱氮的主流技术，相较于物理和化学脱氮法，因其清洁高效、耗能更少而使用广泛。但面对盐度普遍在3.5%以上的高盐废水时，高渗透压和盐析作用会使生物酶活性受限，甚至细胞失水死亡，生物脱氮系统功能受抑制甚至丧失[2, 4]，从而导致污水处理效果不达标，很大程度上限制了生物处理法的应用场景。因此，寻求高效节能的高盐废水新型脱氮技术是目前水处理行业急需解决的难题。
传统生物脱氮工艺利用功能微生物的好氧硝化和厌氧反硝化过程，将无机氮还原为含氮气体，从而去除水中的氨氮和硝酸盐[5]。然而，这2个过程需要不同功能微生物参与，且对有机底物和溶解氧的需求不同，导致反应不连续和周期长等问题，限制了传统生物脱氮的效率[6-7]。异养硝化-好氧反硝化菌(heterotrophic nitrification and aerobic denitrification microorganisms, HNADMs)的发现突破了人们对传统生物脱氮理论的认知，这类微生物能够在溶解氧和有机物存在的环境中同步实现硝化和反硝化[8]。研究发现，大部分HNADMs菌依赖于2条主要脱氮途径：NH4+→NH2OH→NO2–→NO3–→N2和NH4+→NH2OH→N2O→N2，某些菌还显示不完全的脱氮途径，受限于目前所研究HNADMs菌的多样性有限[8]，研究人员对这类菌的脱氮机理仍缺乏全面的了解。随着研究的深入，更多具备耐受高(低)温、高氨、寡营养和高有机物的异养硝化-好氧反硝化菌被发现，在新型生物脱氮领域展现出巨大的应用潜力[9-11]。
当前研究发现，大部分异养硝化-好氧反硝化菌源自淡水环境，少数来自海洋，如葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)等都不具备耐盐特性[12-15]。目前发现的耐盐异养硝化-好氧反硝化菌种类较少，包括别样希瓦氏菌(Alishewanella sp.)[16]、栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(Pannonibacter phragmitetus)[17]和墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)[18]等，它们的耐盐上限一般不超过10%，且在盐浓度高于5%时，其脱氮功能会显著受抑。还有研究报道在15%以上NaCl浓度下可以正常生长的异养硝化-好氧反硝化菌，如寡养单胞菌(Stenotrophomonas MSNA-1)[19]和盐田盐单胞菌(Halomonas campisalis) ha3[20]，但它们在10%以上的盐浓度时却难以发挥除氮作用。目前发现Halomonas sp. B01耐盐性较强，在高达18%的NaCl浓度下仍维持稳定的氨氮去除能力[21]。鉴于高盐废水的盐浓度通常在2%–15%不等，石油天然气开采产生的采出水甚至高达40%[22]，因此亟需发现更多高效耐盐菌株，以满足日益增长的高盐废水处理需求。
本研究从新疆盐湖中分离获得一株具备高效异养硝化-好氧反硝化性能的耐盐菌株，探究了多种环境因素对其脱氮性能的影响，结合菌株脱氮前后氮平衡计算，解析耐盐异养硝化-好氧反硝化菌在高盐条件下的脱氮途径，以期为高盐含氮废水的生物净化提供高效的耐盐菌种资源，这对丰富生物脱氮理论及提高污水处理厂脱氮性能具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 菌株来源本研究所使用的菌株从我国新疆盐湖土壤中分离获得，在–80 ℃条件下保藏于20%的甘油保护液中。
1.2 培养基及培养条件R2A基础培养基(g/L)：胰蛋白胨0.25，酸水解酪蛋白0.5，酵母浸粉0.5，可溶性淀粉0.5，K2HPO4 0.3，MgSO4·7H2O 0.1，丙酮酸钠0.3，蛋白胨0.25，葡萄糖0.5，NaCl 50，琼脂20，pH调至7.0–7.2。
溴百里酚蓝(bromothymol blue, BTB)培养基(g/L)：柠檬酸钠5.0，KNO3 2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 50.0，1%溴百里酚蓝(无水乙醇溶解) 1.0 mL，琼脂20.0，pH调至7.0–7.2。
脱氮液体培养基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.1，K2HPO4·3H2O 0.6，KH2PO4 1.5，NaCl 50.0，微量元素2.0 mL，pH 7.0–7.2，碳源、氮源(NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N)根据实验需求加入。
微量元素(g/L)：Na2EDTA 63.70，MnCl2·4H2O 5.06，FeSO4·7H2O 5.00，ZnSO4 2.20，CaCl2 5.50，Na2MoO4·4H2O 1.10，CuSO4·5H2O 1.57，CoCl2·6H2O 1.61，pH调至7.0–7.2。
1.3 菌株分离鉴定及生理生化特性 1.3.1 菌株驯化及分离纯化取5 g土壤加到含100 mg/L (NH4)2SO4的脱氮培养基中，37 ℃、180 r/min富集培养7 d。取驯化后的菌悬液梯度稀释涂布至BTB固体培养基上筛选出阳性菌落。挑选出形态不同的阳性菌落，使用R2A固体培养基多次划线纯化，置于37 ℃的培养箱内培养1−3 d后得到纯菌落。将分离得到的纯菌株接种到100 mg/L氨氮的脱氮液体培养基，于37 ℃、180 r/min条件下培养7 d，检测培养基内剩余NH4+-N浓度，得到高效菌株5505。
1.3.2 菌株鉴定和生理生化特性分析根据细菌16S rRNA基因序列分析并结合形态学、生理生化特征对菌株进行鉴定。
将纯化后的菌株接种于液体培养基中培养48 h离心收集菌体，使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取细菌基因组DNA，采用细菌16S rRNA基因扩增引物27F (5ʹ-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3ʹ)和1492R (5ʹ-TACGGTTACCT TGTTACGACTT-3ʹ)进行PCR扩增，PCR产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果提交至EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)进行相似性比对，选择同源性较高的相关序列利用MEGA 11软件以neighbor-joining法构建菌株系统发育树。
在R2A培养基上观察菌落形态，参考《常见细菌系统鉴定手册》[23]中的方法并使用梅里埃API 20NE试剂盒对菌株进行生理生化特性分析。
使用R2A固体培养基，分别设置0、1%、3%、5%、7%、9%、10%、12%、15%、18%、20%、22%、25%的NaCl浓度，划线接种后置于37 ℃条件下培养，观察菌株在不同NaCl浓度下的生长状态。
1.4 环境因素对菌株脱氮性能的影响好氧硝化-异养反硝化菌除氮能力明显受多种环境因素相互影响，单一环境因素的改变即可明显改变菌株的除氮能力[24]。采用单因素控制变量法探究不同环境因子对菌株好氧反硝化性能的影响。实验初始条件以乙酸钠为基础碳源，NO3−-N、NO2−-N和NH4+-N质量浓度均为100 mg/L，C/N (质量比)为16:1，pH为7.0，设置2组空白对照，3组平行实验，接菌量为2% (体积分数)，在37 ℃、165 r/min条件下振荡培养72 h。控制培养基内NaCl浓度分别为(质量体积分数)：0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%和20%；控制氮源含量分别为(mg/L)：100、200、300、400、500和1 000；控制C/N分别为(质量比)：2:1、4:1、8:1、16:1、32:1；分别添加不同类型单一碳源：乙酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、甘油；调节摇床转速分别为(r/min)：0、120、165、200；以及调节培养基不同pH：6.0、7.0、8.0和不同培养温度(℃)：15、20、30、37。以上实验按顺序进行以确定最优除氮条件，每隔24 h取菌液在10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液测定溶液中的NO3−-N、NO2−-N和NH4+-N浓度，以考察不同因素对菌株除氮能力的影响。
1.5 不同氮源组合对脱氮效率的影响单因素实验确定菌株最优脱氮条件后，以单一氮源为对照(NO3−-N、NO2−N、NH4+-N)，采用不同氮源组合(NO3−-N和NO2−-N、NO3−-N和NH4+-N、NO2−-N和NH4+-N以及NO3−-N、NO2−-N和NH4+-N)，测定不同类型氮源组合菌株脱氮效率的影响。初始氮保持在100 mg/L，其余条件均保持最优实验条件，间隔6 h取样测定培养基中氮浓度。
1.6 氮平衡初步实验参考文献[25-27]的方法，分别以NO3−-N、NO2−-N和NH4+-N为唯一氮源，在0 h和36 h分别收集菌液进行总氮(total nitrogen, TN)和可溶性总氮(dissolved total nitrogen, DTN)测定。使用超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，功率300 W，间隔/破碎时间3 s，超声处理15 min。破碎后菌液使用0.45 μm过滤器过滤，测定总氮含量。菌液在10 000 r/min条件下离心5 min取上清液，再使用0.22 μm过滤器过滤后，测定可溶性总氮。同时测定培养基内NO3−-N、NO2−N、NH4+-N浓度。
氮平衡相关计算如公式(1)−(4)所示：
| $ \text { 细胞内生物氮 }(\mathrm{mg} / \mathrm{L})=\mathrm{TN}-\mathrm{DTN}$ | (1) |
| $ \text { 气体氮 }(\mathrm{mg} / \mathrm{L})=\mathrm{TN}_{0 \mathrm{~h}}-\mathrm{TN}_{t \mathrm{~h}} $ | (2) |
| $ \text { 同化效率 }(\%)=\text { 细胞内生物氮 } / \mathrm{DTN}_{0 \mathrm{~h}} \times 100 \% $ | (3) |
| $ \begin{aligned} &\text { 脱氮效率 }(\%)=(\text { 气体氮 }+ \text { 细胞内生物氮 }) /\\ &\text { DTN }_{0 \mathrm{~h}} \times 100 \% \end{aligned} $ | (4) |
氨氮(NH4+-N)测定采用纳氏试剂分光光度法；硝酸氮(NO3−-N)测定采用紫外分光光度法；亚硝酸氮NO2−-N)测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；采用吸光度法测定菌液细胞光密度(OD600)值表征菌体生长量；总氮(TN)和可溶性总氮(DTN)测定采用碱性过硫酸钾紫外分光光度法[25]。
数据使用Excel软件统计处理，使用GraphPad Prism软件作图分析。
2 结果与分析 2.1 异养硝化-好氧反硝化菌株5505的鉴定和生理生化特性分析 2.1.1 菌株5505的鉴定菌株5505在R2A固体培养基(图 1A)上菌落呈乳白色，圆形凸起、边缘规则、表面湿润光滑、不透明。通过对菌株16S rRNA基因进行比对和系统发育分析(图 1B)，发现菌株5505与模式菌株栖沙地盐单胞菌(Halomonas ramblicola) RS16T的16S rRNA基因的相似性最高，为98.53%，其次是樊氏盐单胞菌(Halomonas ventosae)和黄蜡色盐单胞菌(Halomonas cerina)，相似性分别为97.28%和97.27%，这3株菌都具有反硝化能力，并且极端嗜盐[28-29]。根据遗传和生理特性比较，菌株5505疑似潜在新物种，还需进一步的菌株多相分类鉴定。
|
| 图 1 菌株5505菌落形态和系统发育树 Fig. 1 Colony morphology and phylogenetic tree of strain 5505. A: Community morphology; B: Neighbor-joining phylogenetic tree showing the phylogenetic relationship of strain 5505 and other closely related Halomonas species based on 16S rRNA gene sequences. The reference sequences used in this study was downloaded from NCBI. A：菌株5505形态特征；B：基于细菌16S rRNA基因序列构建的系统发育树。本研究所用参考序列源自NCBI。 |
| |
菌株生理生化实验结果显示，菌株5505属于革兰氏阴性菌，具有硝酸盐还原能力，能够水解淀粉以及Tween-40、Tween-60，不能水解明胶和纤维素，不产吲哚且无法利用葡萄糖产酸；能够利用葡萄糖酸盐、苹果酸生长，不能利用阿拉伯糖、麦芽糖、已二酸等生长；过氧化氢酶反应阳性，氧化酶弱阳性，脲酶、精氨酸双水解酶和β-半乳糖苷酶反应阴性。
菌株5505在不同NaCl浓度培养基上的生长情况如表 1所示，菌株5505能够在1%−25%的NaCl浓度固体培养基上正常生长，最适耐盐范围为5%−10%。NaCl浓度达到10%以上时，随着NaCl浓度增加培养基表面菌落生长量减少，但菌落总体形态无明显变化。由此可见菌株5505具备耐盐能力强、盐度适应范围广等优点，在高盐高渗废水除氮方面，具有巨大的应用潜力。
| NaCl concentration (%) | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 10 | 12 | 15 | 18 | 20 | 22 | 25 |
| Amount of growth | w | + | + | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ | ++ | ++ | + | + | + |
| +: The amount of growth; w: Weakly growth. | |||||||||||||
如图 2A所示，菌株5505在NaCl浓度4%−10%条件下对NH4+-N的去除率达90%以上；在NaCl浓度5%−15%条件下菌株对NO3−-N脱氮效果最佳，去除率达90%以上(图 2A)；在3%−8%的NaCl浓度范围内，有明显的菌体生长量，并且对NO2−-N有良好的脱氮效果，去除率超过80% (图 2A)。从菌体生长结果来看，NaCl浓度对菌株5505菌体生长量有显著影响，一定范围内NaCl浓度增加与菌体量的增加表现出明显的正相关。
|
| 图 2 不同因素对菌株生长和脱氮性能影响 Fig. 2 Effect of physical-chemical factors on growth and nitrogen removal of bacterial isolate 5505. A: Salinity (0, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%); B: Nitrogen concentration (100, 200, 300, 400, 500, 1 000 mg/L); C: Types of carbon source (sodium acetate, sodium citrate, sodium pyruvate, glucose, glycerol); D: C/N (2:1, 4:1, 8:1, 16:1, 32:1); E: Shaker speed (0, 120, 165, 200 r/min); F: pH (6.0, 7.0, 8.0); G: Temperature (15, 20, 30, 37 ℃). A：NaCl浓度(0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%)；B：氮源浓度(100、200、300、400、500、1 000 mg/L)；C：碳源类型(乙酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、甘油)；D：C/N (2:1、4:1、8:1、16:1、32:1)；E：溶解氧(0、120、165、200 r/min)；F：pH (6.0、7.0、8.0)。G：温度(15、20、30、37 ℃)。 |
| |
从实验结果来看，菌株5505利用的氮源类型不同，NaCl浓度有效耐受范围也不同。以NH4+-N作为唯一氮源，菌株5505能够耐受10%的NaCl浓度并能进行有效脱氮，去除率高达97.76%；而以NO3−-N作为唯一氮源，菌株5505能够耐受15% NaCl浓度并且去除率高达92.15%；以NO2−-N为唯一氮源，菌株5505所能够耐受的NaCl浓度仅为8%，去除率为88.14%。结果表明，菌株5505在高于3% NaCl浓度条件下可以实现对水中无机氮的高效去除。作为嗜盐菌，一定的盐度对于维持菌株的功能是必需的。
总之，菌株5505能够通过异养硝化作用实现NH4+-N的有效去除，通过好氧反硝化作用有效去除NO3−-N和NO2−-N；其具有广泛的盐浓度适应范围，在1%−25%的NaCl浓度范围内能正常生长，但在3%−8%范围内才能实现对3种底物的高效去除。
2.2.2 氮源浓度如图 2B所示，菌株对NH4+-N和NO2−-N的去除能力会随氮浓度升高而受到明显抑制，在100 mg/L时，菌株对NO2−-N和NH4+-N的脱氮效率达到最佳，分别为88.0%和97.0%。菌株5505具有较强的适应高浓度NH4+-N和NO2−-N的能力，500 mg/L NH4+-N和NO2−-N浓度对菌株5505的菌体生长量无显著影响，OD600分别能保持在1.4和1.0以上；图 2B显示，在以NO3−-N为唯一氮源的反应体系中，硝酸盐对菌株5505除氮性能和菌体生长没有出现显著的抑制，100 mg/L时NO3−-N去除率最高，达97.84%，浓度1 000 mg/L时NO3−-N的去除率仍能保持87.09%，在100−1 000 mg/L范围内，菌株5505不仅生长不受抑制，亦能维持高效的除氮能力。
总体来看，菌株5505在最适8%的NaCl浓度条件下对100−1 000 mg/L不同范围的NO3−-N保持高效的脱氮效果，以NO2−-N和NH4+-N为底物时，存在高浓度底物对细胞生长和内酶系统的抑制作用，使菌株5505出现随氮浓度升高而出现脱氮能力下降的现象。
2.2.3 碳源如图 2C所示，不同碳源对菌株5505的生长量和脱氮效率有显著影响，同种碳源菌株5505对不同氮源脱氮效果基本相同。以乙酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、甘油为碳源时，NO3−-N均可以达到100.0%去除(图 2C)，NO2−-N受碳源种类影响较大，菌株5505利用柠檬酸钠和丙酮酸钠的效果明显优于其他3种碳源，对NO2−-N去除率可达95.0%以上，菌株利用乙酸钠去除NO2−-N时，相较于去除NO3−-N时，去除效率有了明显下降。菌株5505以柠檬酸钠为碳源的降解效果最优，OD600值为0.6时，在24 h后即可完成100.0%的NH4+-N去除(图 2C)。
2.2.4 碳氮比从图 2D可以看出，菌株5505在C/N比为2−32条件下对NO2−-N和NH4+-N均有一定脱氮能力，去除率和OD600表现出随C/N的提高而先增后减的趋势。C/N为8时菌株表现出最优的除氮效果，NO2−-N去除率在48.76%，NH4+-N的去除率达到88.94%。C/N在4−32的范围内，菌株5505对NO3−-N的去除率均达95.0%以上，其中在C/N为16:1时对NO3−-N的去除率可达100.0%；C/N为2:1时，对NO3−-N的去除率也能达到81.0%以上，可以看出菌株5505在降解硝酸盐时对碳源浓度的要求不高(图 2D)。
总体来看，在不同C/N条件下，随着碳源比例的提高，菌株5505对3种唯一氮底物的降解效果均表现出先升高后下降的趋势，这种碳源比例需求主要表现在菌株对NO2−-N和NH4+-N的降解中，而菌株在去除NO3−-N时，碳源比例变化对菌株除氮能力影响并不大。
2.2.5 溶解氧溶解氧水平是影响好氧反硝化过程的关键因素[30]。如图 2E所示，溶解氧水平与菌株5505的生长量和对3类氮源的降解效率均呈正相关，随着转速的提高，培养基中生物量得到明显提升，同时氮源降解效率也明显提高，当转速为200 r/min时，菌株5505对3种氮源的脱氮效率达到最佳，对NO3−-N的去除率达到100.0%，对NO2−-N的去除率达到88.0%以上，对NH4+-N的去除率高达91.0%以上。
2.2.6 pH如图 2F所示，在探究pH条件对菌株5505反硝化脱氮性能影响时，可以观察到pH=7.0−8.0的碱性条件菌株5505的脱氮性能明显高于pH=6.0−7.0的酸性条件，pH为8.0时可以达到NO3−-N去除率为90.0%以上、NO2−-N去除率32.6%、NH4+-N降解率65.0%以上的最优脱氮效果。pH=7.0时对NO3−-N和NH4+-N能分别保持76.5%和24.7%的去除率，但这并不是最优的结果；在pH=6.0时不利于菌株5505的生长，且不能实现有效脱氮。在多数具有好氧反硝化特性菌株的研究中都能观察到类似的结果[31-32]，即碱性环境更有利于提高菌株5505的脱氮效率。
2.2.7 温度温度通常是影响微生物脱氮效果的关键因素之一，低温下微生物生长和酶活性受到显著抑制可能会影响菌株反硝化脱氮性能[31]。菌株5505在不同温度条件下脱氮效果及生长量如图 2G所示，15 ℃条件下菌株对NH4+-N去除率为43.28%，OD600仅为0.12，显著低于其他温度条件，当温度提高到30 ℃以上时，可达到对NH4+-N的100.0%完全去除，脱氮效率以及生长量都得到显著提高。菌株在20 ℃以下菌体生长受温度影响较大，对NO3−-N的脱氮率影响较小。30 ℃和37 ℃时，菌株对NO3−-N去除率分别达到100.0%和94.11%，OD600均可达1.2。温度对以NO2−-N为唯一氮源的菌株除氮效果影响较大，低温条件下菌株生长量和除氮率均不理想，30 ℃和37 ℃时对NO2−-N去除率分别为55.74%和74.43%，OD600为1.0。
总体来看，菌株5505在以NO2−-N为唯一氮源时生长和脱氮效率受温度影响较大，30 ℃以上才能实现高效去除；以NO3−-N为唯一氮源时温度对脱氮效率影响较小，低温条件下菌株生长量受到抑制；以NH4+-N为唯一氮源时菌株生长和脱氮受低温抑制，20 ℃以上即可实现对NH4+-N的高效去除。
2.3 菌株5505在不同氮源组合条件下的脱氮特性在实际废水处理中通常存在多种无机氮共存的情况，如在水产养殖过程中常常存在氨氮和亚硝态氮同时超标的现象。结果显示，不同氮源混合会对菌株的脱氮效果产生不同程度的影响。以NO3−-N为唯一氮源对照组中，前12 h除氮率较低，在12−24 h内降解85.21%，其间观察到明显的硝酸和氨氮积累(图 3A)。以NH4+-N为唯一氮源对照组在12 h内降解94.18%，没有亚硝酸积累(图 3B)。菌株在24 h内对NO2−-N的降解率达到96.20%，中间产物积累不明显，36 h后观察到少量硝酸氮和氨态氮积累(图 3C)。
|
| 图 3 不同氮源组合对脱氮的影响 Fig. 3 Nitrogen removal performance of 5505 with different nitrogen sources. |
| |
当NO3−-N和NH4+-N复合氮源总氮浓度为116.18 mg/L时，24 h后复合氮源降解率达到97.5%，同时观察到12 h时中间亚硝酸盐积累达到最高值32.76 mg/L，24 h后亚硝酸盐含量回落并保持在13.00 mg/L的浓度范围，菌株停止降解，总氮去除率86.0% (图 3D)。当NO2−-N和NH4+-N复合氮源总氮浓度为113.5 mg/L时，与单一氨氮对照组相似，复合氮源中NH4+-N最先在12 h内完成降解，NO2−-N降解速率相对于对照组减缓，可能是硝化过程中亚硝酸盐积累导致，在24 h后NO2−-N清除率达到72.2%，培养基内NO2−-N浓度保持在15.00 mg/L，菌株停止降解(图 3E)。复合氮源NO3−-N和NO2−-N均在24 h后降解率达到最高，分别为95.9%和62.7% (图 3F)。与其他复合氮源相同的是，NO2−-N在24 h达到最高降解率后，亚硝酸盐浓度保持在一定浓度不再降解，氨氮36 h后少量积累。3种氮源复合比例接近1:1:1，总氮浓度130.00 mg/L，与双氮源混合结果相似，12 h内NH4+-N最先完成降解，随后24 h内NO3−-N和NO2−-N达到最高降解率，NO2−-N在一定范围内不再降解(图 3G)。
有研究认为，NO2−-N无法被完全去除的原因是没有足够的碳源提供还原力[33]，因此又进行了一次验证实验(数据未显示)，在24 h时向实验组硝铵混合氮源中补充添加碳源溶液使培养基中碳源浓度达到200 mg/L，对照组添加同体积无菌水。结果显示，对照组和实验组均在12 h出现30 mg/L左右亚硝酸盐积累峰值，随后开始下降，24 h检出亚硝酸盐浓度为15 mg/L。24 h时向实验组补加碳源后，36 h时亚硝酸盐剩余量为0，对照组36 h后亚硝酸剩余量仍然为15 mg/L保持不变。以上结果表明补充的碳源可以提供足够的还原力，使积累的亚硝酸盐被清除。
2.4 氮平衡分析菌株5505对3种底物脱氮过程中的氮平衡分析如表 2所示，菌株将大约62.68%的初始NH4+-N同化为细胞内生物氮，19.39%的氮还原为含氮气体，有NO3−-N中间产物检出。大约52.66%的初始NO3−-N被同化为细胞内生物氮，12.99%氮被反硝化还原为含氮气体，伴随少量NO2−-N和NH4+-N检出。大约51.08%初始NO2−-N被同化为细胞内生物氮，17.12%的初始氮通过反硝化还原为含氮气体释放到细胞外，有中间产物NO3−-N检出。
| Nitrogen resource | Initial nitrogen (mg/L) | Nitrogen mass concentration | |||||
| NO3−-N (mg/L) | NO2–-N (mg/L) | NH4+-N (mg/L) | Intracellular-N (mg/L) | Gas-N (mg/L) | DTN clearance rate (%) | ||
| NH4+-N | 105.78±2.23 | 12.85±1.89 | − | 10.04±0.20 | 66.31±11.38 | 20.52±5.86 | 78.36 |
| NO3−-N | 112.63±2.97 | 16.58±2.73 | 6.90±1.02 | 2.76±0.34 | 57.54±12.33 | 19.29±11.80 | 76.70 |
| NO2−-N | 105.26±1.48 | 13.48±0.98 | 33.33±1.12 | − | 55.43±13.41 | 13.68±3.79 | 55.52 |
总体来看，菌株5505对3种初始氮源的利用以同化作用为主，菌株5505以NH4+-N为唯一氮源时有62.68%的初始氮源被细胞同化，均显著高于NO3−-N和NO2−-N单一氮源条件下的同化率，而且异化率也相对更高，说明NH4+-N更容易被菌株5505同化和利用。
氮平衡结果显示，以NH4+-N为唯一氮源的培养基中有NO3−-N检出，分析菌株先通过硝化作用将NH4+-N经羟胺中间体氧化为NO3−-N，再通过反硝化作用进一步还原为含氮气体；NO3−-N作为唯一氮源或混合氮源存在时均观察到大量亚硝酸盐积累，充分说明菌株5505先将NO3−-N还原为NO2−-N，再进一步还原为含氮气体从而达到除氮的目的；在NO2−-N作为唯一氮源的培养基中有NO3−-N的检出，意味着菌株5505能利用NO2−-N转化为NO3−-N[34]。综合以上结果分析其脱氮途径为NH4+→NH2OH→ NO2−→NO3−→NO2−→NO/N2O/N2[34]。
3 讨论与结论本研究从新疆盐湖中筛选出一株具有高效脱氮能力的耐盐异养硝化-好氧反硝化菌5505，通过细菌16S rRNA基因相似性分析，该菌株与H. ramblicola最为相似，可能为潜在新物种。目前，盐单胞菌属有超过160株典型菌株，多来自海洋、盐碱地、盐湖、石油等天然盐环境，能在3%−20% (质量体积分数)盐环境中正常生长[35]。研究发现，盐单胞属菌具有多样的代谢特征和生理功能，一部分能产胞外多糖和表面活性剂，一部分具有降解烷烃和芳烃的能力[36]，还有另一部分因具有清除有害金属Cr、Hg、Pd和Cd的能力而备受关注[36]，因此盐单胞属的一些典型菌株，被认为是“下一代工业生物技术”的强大底盘菌株，在耐盐菌的应用研究中是一类极具工业应用潜力的嗜盐菌[37]。
目前发现具备异养硝化-好氧反硝化能力的盐单胞属菌较少，其来源涉及不同盐环境，如耐压盐单胞菌(Halomonas piezotolerans) HN2[38]来自养殖海水，美丽盐单胞菌(H. venusta) SND-01[39]分离自盐碱地，H. campisalis ha3[20]则源自内蒙古自治区的盐湖，这些菌耐盐性较强，在约3% NaCl浓度下均能有效除氮。目前发现的高效的异养硝化-好氧反硝化菌往往分离自活性淤泥等污染环境，大多为非嗜盐菌，不太适应高盐废水处理。这些分离自天然盐环境的盐单胞属菌也表现出出色的除氮能力，提示天然盐环境中可能孕育丰富的菌株资源。
通过单因素实验发现NaCl浓度对菌株5505的生长和脱氮功能产生严重抑制作用。尽管菌株5505在25%盐度下仍可维持生存能力，但其除氮能力已丧失，较优的除氮能力仅限于3%−8%的盐度范围内。盐浓度升高抑制菌株除氮能力的现象在其他嗜盐菌株中也有所体现，如弧菌(Vibrio sp.) LV-Q1[40]在8% NaCl浓度下脱氮速率大幅降低，H. venusta SND-01在最高10% NaCl浓度下反硝化效率降低至50%以下，Halomonas sp. DN3[41]在6% NaCl浓度时脱氮效率仅为48.59%。与耐盐菌株E. mexicanum SND-01随NaCl浓度升高而脱氮效率显著下降的规律不同，菌株5505在较宽的NaCl浓度范围(3%−8%)内，脱氮效率一直保持在80%以上，表现更为稳定。这表明菌株5505在适宜的盐度范围内具有较强的脱氮能力，但还需要进一步研究菌株5505在高盐环境下的生理和代谢适应机制，以便更好地利用其在高盐环境中的脱氮能力。研究表明，石油采出水中，氯化物含量可高达200 g/L [42]，同时还含有大量碳酸氢盐、硫酸盐等，这些废水化学成分复杂含氮量高，一般生物处理器难以应对，必须经过大量水稀释后才能进入处理系统。菌株5505在一定NaCl浓度范围内保持稳定生长，容易适应盐度突变，有效降低了处理高盐废水时生物处理器对盐浓度的要求，减少了用于高盐废水稀释的水资源的浪费。
为应对高盐胁迫，嗜盐微生物通过多种适应机制维持细胞稳定，包括渗透调节、胞内小分子相容溶质积累、蛋白质稳定以及细胞表面稳定等策略[43]。研究发现，高盐环境中，耐盐微生物多采取协同的高渗透压适应策略，例如盐单胞菌在低盐条件下通过主动转运盐离子和合成相容溶质来维持渗透压平衡，当盐浓度超过一定阈值则需大量合成或摄取相容溶质以平衡渗透压[44-45]。某些耐盐菌株还表现出小分子相容溶质积累(如ectoine)和细胞表面稳定(如超氧化物歧化酶修复)的协同耐盐机制[21]。这些以小分子相容溶质为代表的适应策略使盐单胞菌属具备较广盐度范围的适应能力。
本研究还发现，菌株5505脱氮能力的发挥对盐有依赖性，需要在3%以上NaCl浓度才能对3种底物有稳定高效的清除效率，王伟伟等[46]在嗜盐菌耐盐机制相关研究中证明，嗜盐酶需要维持一定的盐浓度以保持其结构与活性的稳定。目前有研究发现同属菌株Halomonas sp. B01[21]在18%的NaCl浓度中仍能保持一定的去除NH4+-N的能力，具备较强的耐盐脱氮性能。菌株5505相较于一般的HNADMs表现出优异的耐盐能力和反硝化性能，在15%的极端NaCl浓度下仍保持极高NO3−-N清除效率，可以在普通耐盐HNADMs无法有效发挥脱氮功能的极端盐环境中保持高效稳定的脱氮效率。
高浓度的氮会对脱氮菌株功能产生抑制效应，菌株5505在100−1 000 mg/L硝酸盐浓度范围内具有高效的去除效率；在500 mg/L浓度亚硝酸盐浓度下的生长状况明显优于非嗜盐菌Bacillus sp. SC16[14]等同类型菌株，后者在300 mg/L亚硝酸盐浓度下几乎无法存活，而菌株5505能适应500 mg/L浓度的NO2−-N，但除氮能力被严重抑制。耐盐同属菌株H. campisalis ha3[20]最适脱氮NaCl浓度范围为4%−8%，与菌株5505类似，菌株ha3能够有效去除700 mg/L的NO2−-N，但对NH4+-N的去除能力远低于菌株5505；菌株5505的生长在一定程度上受限于高浓度亚硝酸盐的毒害作用，因亚硝酸盐能够抑制细胞内酶系统活性和细菌的需氧生长，不同反硝化微生物对亚硝酸盐的毒性阈值存在差异[14, 47]。亚硝酸盐是氨氮硝化中间途径产物，因此菌株在降解高浓度NH4+-N时可能导致亚硝酸瞬时积累而出现类似亚硝酸盐的抑制作用[48-49]。与高雅娟等[50]研究的非嗜盐菌铜绿假单胞菌U1类似，在高浓度NH4+-N下菌株U1的脱氮效率降低，但U1可以耐受1 500 mg/L的NH4+-N并且降解率达到51.06%，目前尚未见关于其NO3−-N和NO2−-N去除效果的报道。总之，菌株5505具有较强的抵抗亚硝酸盐毒害能力，而控制过高的氨氮浓度可以减轻因过多中间亚硝酸盐积累而导致的对脱氮效果的抑制。
碳源不仅为微生物提供生长代谢所需能量，还可作为反硝化过程的电子供体。不同类型碳源提供电子的能力存在差异，进而影响菌株的脱氮效果[31]。菌株5505能高效利用丙酮酸钠、柠檬酸钠和乙酸钠进行生长和脱氮，而对葡萄糖的利用效果较差，脱氮效率和细胞生长水平较低，相比之下，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) L7利用葡萄糖进行生长和脱氮的效率反而高于对乙酸钠、丙酮酸钠和柠檬酸钠[51]。HNADMs对碳源的依赖机制尚不清楚，可能涉及多种代谢途径的交互作用，但大多数已知的HNADMs都可以利用乙酸盐和琥珀酸盐[52]。结果表明，菌株5505更倾向利用简单的碳源，如有机酸类等对菌株反硝化脱氮更为有利；而对葡萄糖的利用需要进一步分解为更简单的化合物[53]。此外，微生物利用丙酮酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐可使培养基碱性增强，从而提升反硝化效果[53]。菌株5505对碳源比例的需求存在一个阈值，高于或低于此阈值都可能会对菌株5505的除氮能力产生抑制作用。因为过低的碳源浓度无法满足菌株的生长需求，过高的碳源浓度受电子传递过程中限速步骤中间体的积累的影响，无法被快速利用[54]，因此，菌株5505的生长繁殖和脱氮功能均受到抑制。
本研究的结果表明，pH=7.0−8.0的碱性条件更有利于提高菌株5505的除氮效果。在以往的研究中也认为，碱性环境更利于异养硝化-好氧反硝化的进行。例如，菌株WT14[48]在碱性环境下对NH4+-N的耐受值是中性环境下的51.8倍，而在关于Alishewanella sp. F2的研究中也发现，在碱性环境下菌株对NO2−-N和NO3−-N的去除效果显著提升，中性和酸性环境下仅有少量去除[16]。此外，菌株5505在除氮过程中受温度影响显著，以往研究中认为温度不会抑制反硝化基因的转录，但可能会导致反硝化基因表达的延迟[55]。如施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) YZN-001[56]在10 ℃和4 ℃条件下要达到30 ℃相同的NH4+-N清除率，所需时间分别被延长至72 h和2周。因此菌株5505在低于30 ℃环境时会由于基因表达延迟导致除氮效果不佳。
通过对菌株5505的研究，发现该菌株主要通过同化作用来实现对无机氮的去除，这在以往的非耐盐菌研究中并不常见。通常，HNADMs以异化作用为主导。而报道显示，嗜盐的Halomonas sp. DN3[41]、H. venusta SND-01[39] Vibrio sp. LV-Q1[40]和Halomonas sp. 3H[57]都是以同化除氮为主。同化生物质氮的很大一部分用于细胞氨基酸的合成[58]，这些来自高盐环境的菌株，其较高的同化率可能有助于在高盐寡营养的盐湖等环境中有效积累物质[4]。此外，相关研究发现，Halomonas sp. B01在NaCl浓度增加时，ectoine的合成量也显著增加[21]，耐盐细菌随盐度的提高，已有文献证实，随着NaCl浓度的递增，耐盐细菌Halomonas sp. B01的ectoine合成量呈显著上升[21]。推测菌株5505通过优化代谢机制，在高盐环境中增强ectoine的合成与积累，以维持细胞内渗透压稳定性。
此外，菌株5505对NH4+-N的利用存在明显的偏好性，HNADMs在好氧条件下优先利用NH4+-N，异养硝化能力优于好氧反硝化能力也在以往的相关研究中被证实[59-60]。向混合氮源中添加NH4+-N，相较于单一氮源状态下OD600显著提高，菌株5505在铵复合氮源中优先利用NH4+-N同化进行细胞生长，而硝酸通过反硝化还原为亚硝酸在12 h时检出后被清除，NH4+还能充当一部分电子供体角色使反硝化作用效率提高。同时观察到不同氮源组合中，NO2−-N作为异养硝化和好氧反硝化的必要中间产物被大量积累，而这些主要来自NO3−[33]。复合氮源促进了菌株5505的脱氮效果，但缺少碳源作为电子供体为积累的NO2−-N提供足够的还原力，导致NO2−-N无法被完全去除，通过提高C/N或者向培养基添加Cu2+可使积累的NO2−-N完全清除[61]，在混合氮源中NH4+-N的加入使菌株5505对NO3−-N的脱氮效率得到提高，这种特性在H. venusta TJPU05研究中也有发现，这提高了菌株在处理混合氮源废水时的适应能力和应用潜力。
氮平衡分析发现，菌株5505在硝化过程中成功检测到硝酸盐，且没有检测到亚硝酸盐，与H. venusta TJPU05结果相似，表明菌株5505的硝化过程不会产生亚硝酸盐，或者产生的亚硝酸盐很快转化为其他物质[62]，避免了在处理类似海水养殖尾水等高氨废水时，因积累大量亚硝酸盐对其他生物产生毒害作用。在以NO3−-N为唯一氮源培养基中，检测到少量氨态氮，可能是由于细胞死亡裂解释放出微量的氨氮，或提示菌株5505氮代谢途径存在同化硝酸盐还原(assimilatory nitrate reduction to ammonium, ANRA)或异化硝酸盐还原(dissimilatory nitrate reduction to ammonium, DNRA)途径，具体机制还有待进一步探究[59]。总体而言，高盐条件下的菌株5505对氮源的利用方式偏向于细胞的同化合成分泌，在多氮源同时存在时，菌株5505优先利用NH4+-N。
综上所述，从我国新疆盐湖分离出的一株耐盐的异养硝化-好氧反硝化菌5505，对高盐水体中的NH4+-N、NO3−-N和NO2−-N能实现高效同步去除。本研究拓宽了对盐单胞菌属作为底盘菌株的认知，为盐单胞菌属的功能性研究和高盐含氮废水的生物净化提供优秀的耐盐菌种资源，对丰富生物脱氮理论及提高污水处理厂脱氮性能具有重要意义。
作者贡献声明
谢卓斌：完成了主要实验工作以及稿件的撰写修改；王芸：方案设计，全文指导与修改；蒋刚强：提供盐湖土壤样品和稿件润色修改；李雨薇：菌株的富集和筛选；李文昌、刘一帆、吴张秀和黄媛媛：进行了部分实验数据的收集和整理；唐蜀昆：提供技术支持。
作者利益冲突公开声明
作者利益冲突公开声明作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
| [1] |
SRIVASTAVA A, PARIDA VK, MAJUMDER A, GUPTA B, GUPTA AK. Treatment of saline wastewater using physicochemical, biological, and hybrid processes: insights into inhibition mechanisms, treatment efficiencies and performance enhancement[J]. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2021, 9(4): 105775. DOI:10.1016/j.jece.2021.105775
|
| [2] |
袁建华, 赵天涛, 彭绪亚. 极端条件下异养硝化-好氧反硝化菌脱氮的研究进展[J]. 生物工程学报, 2019, 35(6): 942-955. YUAN JH, ZHAO TT, PENG XY. Advances in heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacteria for nitrogen removal under extreme conditions[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(6): 942-955 (in Chinese). DOI:10.13345/j.cjb.180427 |
| [3] |
2022年中国生态环境状况公报(摘录)[J]. 环境保护, 2023, 51(9): 66-83. China ecological environment status bulletin 2022 (excerpt)[J]. Environmental Protection, 2023, 51(9): 66-83 (in Chinese). |
| [4] |
SONG Q, CHEN XG, HUA Y, CHEN SX, REN LT, DAI XH. Biological treatment processes for saline organic wastewater and related inhibition mechanisms and facilitation techniques: a comprehensive review[J]. Environmental Research, 2023, 239(1): 117404.
|
| [5] |
BASSIN JP. New processes for biological nitrogen removal[M]//Advanced Biological Processes for Wastewater Treatment. Cham: Springer International Publishing, 2017: 143-203.
|
| [6] |
于鑫, 李亮, 胡筱敏. A/O-MBR处理高浓度氨氮油页岩干馏废水[J]. 工业水处理, 2017, 37(4): 83-86. YU X, LI L, HU YM. Treatment of high concentration of ammonia nitrogen oil shale retorting wastewater by A/O-MBR process[J]. Industrial Water Treatment, 2017, 37(4): 83-86 (in Chinese). |
| [7] |
YAN YM, LU HW, ZHANG J, ZHU SG, WANG YQ, LEI Y, ZHANG R, SONG LY. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification (SND) for nitrogen removal: a review and future perspectives[J]. Environmental Advances, 2022, 9: 100254. DOI:10.1016/j.envadv.2022.100254
|
| [8] |
SONG T, ZHANG XL, LI J, WU XY, FENG HX, DONG WY. A review of research progress of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification microorganisms (HNADMs)[J]. Science of the Total Environment, 2021, 801: 149319. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.149319
|
| [9] |
董怡华, 王凌潇, 任涵雪, 陈峰. 一株耐低温异养硝化-好氧反硝化菌的分离鉴定及其脱氮特性[J]. 生物技术通报, 2023, 39(12): 237-249. DONG YH, WANG LX, REN HX, CHEN F. Isolation and identification of a psychrotolerant heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium and its nitrogen-removing characteristics[J]. Biotechnology Bulletin, 2023, 39(12): 237-249 (in Chinese). |
| [10] |
刘诗园, 张婷, 高雅娟, 李晨晨, 杨永宇, 张国伟, 谭骞骞, 靳永胜. 耐高浓度氨氮微生物Y5的脱氮特性及应用研究[J]. 工业水处理, 2024, 44(7): 162-170. LIU SY, ZHANG T, GAO YJ, LI CC, YANG YY, ZHANG GW, TAN QQ, JIN YS. Nitrogen removal characteristics and application of bacterium Y5 tolerant to high concentration ammonia nitrogen[J]. Industrial Water Treatment, 2024, 44(7): 162-170 (in Chinese). |
| [11] |
吴朕君, 杜亚飞, 王艺涵, 陈莉杰, 郭婷, 杨耀党, 李顺义. 低C/N污水的同步短程硝化反硝化脱氮机理研究[J]. 环境工程, 2023, 41(S2): 118-124. WU ZJ, DU YF, WANG YH, CHEN LJ, GUO T, YANG YD, LI SY. The mechanisms of simultaneous short-cut nitrification denitrification for low C/N wastewater[J]. Environmental Engineering, 2023, 41(S2): 118-124 (in Chinese). |
| [12] |
张宇红, 刘香宇, 董先博, 许家琪, 徐子祾. 好氧反硝化细菌SY-D-22的分离、优化及脱氮机理[J]. 微生物学通报, 2023, 50(5): 1815-1825. ZHANG YH, LIU XY, DONG XB, XU JQ, XU ZL. Aerobic denitrifying bacterium SY-D-22: isolation, optimization of denitrification conditions, and characterization of denitrification mechanism[J]. Microbiology China, 2023, 50(5): 1815-1825 (in Chinese). |
| [13] |
夏远舰, 杨小丽, 李海华, 赵博. 异养硝化-好氧反硝化菌Acinetobacter johnsonii sp. N26的脱氮性能及代谢途径[J]. 微生物学通报, 2023, 50(4): 1374-1395. XIA YJ, YANG XL, LI HH, ZHAO B. Optimization of nitrogen removal performance and metabolic pathway of a heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacterial strain Acinetobacter johnsonii sp. N26[J]. Microbiology China, 2023, 50(4): 1374-1395 (in Chinese). |
| [14] |
SANG CG, FU YW, GUO SQ, LUO JJ, ZHANG QZ. Isolation and characterization of an aerobic denitrifier Bacillus sp. SC16 from an intensive aquaculture pond[J]. Water, 2020, 12(12): 3559. DOI:10.3390/w12123559
|
| [15] |
HUANG F, PAN LQ, HE ZY, ZHANG MY, ZHANG MZ. Identification, interactions, nitrogen removal pathways and performances of culturable heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacteria from mariculture water by using cell culture and metagenomics[J]. Science of the Total Environment, 2020, 732: 139268. DOI:10.1016/j.scitotenv.2020.139268
|
| [16] |
CHENG R, WANG XY, ZHU H, YAN BX, SHUTES B, XU YY, FU BR, WEN HY. Isolation and characterization of a salt-tolerant denitrifying bacterium Alishewanella sp. F2 from seawall muddy water[J]. Scientific Reports, 2020, 10(1): 10002. DOI:10.1038/s41598-020-66989-5
|
| [17] |
WANG XY, ZHU H, SHUTES B, FU BR, YAN BX, YU XF, WEN HY, CHEN X. Identification and denitrification characteristics of a salt-tolerant denitrifying bacterium Pannonibacter phragmitetus F1[J]. AMB Express, 2019, 9(1): 193. DOI:10.1186/s13568-019-0918-y
|
| [18] |
CUI Y, CUI YW, HUANG JL. A novel halophilic Exiguobacterium mexicanum strain removes nitrogen from saline wastewater via heterotrophic nitrification and aerobic denitrification[J]. Bioresource Technology, 2021, 333: 125189. DOI:10.1016/j.biortech.2021.125189
|
| [19] |
ZENG XY, HUANG JJ, HUA BB, CHAMPAGNE P. Nitrogen removal bacterial strains, MSNA-1 and MSD4, with wide ranges of salinity and pH resistances[J]. Bioresource Technology, 2020, 310: 123309. DOI:10.1016/j.biortech.2020.123309
|
| [20] |
GUO Y, ZHOU XM, LI YG, LI K, WANG CX, LIU JF, YAN DJ, LIU YL, YANG DH, XING JM. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by a novel Halomonas campisalis[J]. Biotechnology Letters, 2013, 35(12): 2045-2049. DOI:10.1007/s10529-013-1294-3
|
| [21] |
王特. Halomonas sp. B01 SND脱氮特性及其耐盐脱氮机理研究[D]. 大连: 大连海事大学. 2020. WANG T. Nitrogen removal characteristics and salt-tolerant of Halomonas sp. B01 SND[D]. Dalian: Dalian Maritime University, 2020 (in Chinese). |
| [22] |
CASTILLO-CARVAJAL LC, SANZ-MARTÍN JL, BARRAGÁN-HUERTA BE. Biodegradation of organic pollutants in saline wastewater by halophilic microorganisms: a review[J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2014, 21(16): 9578-9588. DOI:10.1007/s11356-014-3036-z
|
| [23] |
东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001. DONG XZ, CAI MY. Handbook for Identification of Common Bacterial Systems[M]. Beijing: Science Press, 2001 (in Chinese). |
| [24] |
异养硝化-好氧反硝化影响因素研究进展[J]. 水处理技术, 2016, 42(1): 1-6. XIAN SS, CHEN MX, XIONG R, TAN ZL. Research advances of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification under different factors[J]. Technology of Water Treatment, 2016, 42(1): 1-6 (in Chinese). |
| [25] |
ZHANG N, ZHANG YT, BOHU T, WU SH, BAI ZH, ZHUANG XL. Nitrogen removal characteristics and constraints of an Alphaproteobacteria with potential for high nitrogen content heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Microorganisms, 2022, 10(2): 235. DOI:10.3390/microorganisms10020235
|
| [26] |
YI MM, WANG H, MA XN, WANG C, WANG M, LIU ZG, LU MX, CAO JM, KE XL. Efficient nitrogen removal of a novel Pseudomonas chengduensis strain BF6 mainly through assimilation in the recirculating aquaculture systems[J]. Bioresource Technology, 2023, 379: 129036. DOI:10.1016/j.biortech.2023.129036
|
| [27] |
LANG XD, LI QW, JI MM, YAN GX, GUO SH. Isolation and niche characteristics in simultaneous nitrification and denitrification application of an aerobic denitrifier, Acinetobacter sp. YS2[J]. Bioresource Technology, 2020, 302: 122799. DOI:10.1016/j.biortech.2020.122799
|
| [28] |
LUQUE R, BÉJAR V, QUESADA E, MARTÍNEZ-CHECA F, LLAMAS I. Halomonas ramblicola sp. nov., a moderately halophilic bacterium from Rambla Salada, a Mediterranean hypersaline rambla[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2012, 62(12): 2903-2909.
|
| [29] |
GONZÁLEZ-DOMENECH CM, MARTÍNEZ-CHECA F, BÉJAR V, QUESADA E. Denitrification as an important taxonomic marker within the genus Halomonas[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2010, 33(2): 85-93. DOI:10.1016/j.syapm.2009.12.001
|
| [30] |
SONG ZF, AN J, FU GH, YANG XL. Isolation and characterization of an aerobic denitrifying Bacillus sp. YX-6 from shrimp culture ponds[J]. Aquaculture, 2011, 319(1/2): 188-193.
|
| [31] |
FU WL, WANG Q, CHEN SH, WANG YS, WANG YR, DUAN PF, YI GF, LIU C, ZHANG X, RAO ZM. Isolation and identification of an efficient aerobic denitrifying Pseudomonas stutzeri strain and characterization of its nitrite degradation[J]. Catalysts, 2021, 11(10): 1214. DOI:10.3390/catal11101214
|
| [32] |
高效好氧反硝化盖氏假单胞菌YZ-7的鉴定及其脱氮性能研究[J]. 南方农业学报, 2023, 54(5): 1549-1558. LI Q, SUN ZX, ZHOU Y. Identification and denitrification performance of an efficient aerobic denitrification bacterium Pseudomonas gessardii YZ-7[J]. Journal of Southern Agriculture, 2023, 54(5): 1549-1558 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.05.027 |
| [33] |
ZHANG Y, SHI Z, CHEN MX, DONG XY, ZHOU JT. Evaluation of simultaneous nitrification and denitrification under controlled conditions by an aerobic denitrifier culture[J]. Bioresource Technology, 2015, 175: 602-605. DOI:10.1016/j.biortech.2014.10.016
|
| [34] |
HE XL, SUN Q, XU TY, DAI M, WEI DS. Removal of nitrogen by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification of a novel halotolerant bacterium Pseudomonas mendocina TJPU04[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2019, 42(5): 853-866. DOI:10.1007/s00449-019-02088-8
|
| [35] |
DELA HABA RR, ARAHAL DR, SÁNCHEZ-PORRO C, CHUVOCHINA M, WITTOUCK S, HUGENHOLTZ P, VENTOSA A. A long-awaited taxogenomic investigation of the family Halomonadaceae[J]. Frontiers in Microbiology, 2023, 14: 1293707. DOI:10.3389/fmicb.2023.1293707
|
| [36] |
BISWAS J, JANA SK, MANDAL S. Biotechnological impacts of Halomonas: a promising cell factory for industrially relevant biomolecules[J]. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 2023, 39(2): 348-377.
|
| [37] |
YE JW, CHEN GQ. Halomonas as a chassis[J]. Essays in Biochemistry, 2021, 65(2): 393-403. DOI:10.1042/EBC20200159
|
| [38] |
DONG LX, GE ZW, QU W, FAN YP, DAI QP, WANG JX. Characteristics and mechanism of heterotrophic nitrification/aerobic denitrification in a novel Halomonas piezotolerans strain[J]. Journal of Basic Microbiology, 2022, 62(2): 124-134. DOI:10.1002/jobm.202100446
|
| [39] |
HUANG MQ, CUI YW, YANG HJ, XU MJ, CUI YB, CHEN ZB. A halophilic aerobic-heterotrophic strain Halomonas venusta SND-01: nitrogen removal by ammonium assimilation and heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Bioresource Technology, 2023, 374: 128758. DOI:10.1016/j.biortech.2023.128758
|
| [40] |
GAO ZX, WANG Y, CHEN H, LV YK. Biological nitrogen removal characteristics and mechanisms of a novel salt-tolerant strain Vibrio sp. LV-Q1 and its application capacity for high-salinity nitrogen-containing wastewater treatment[J]. Journal of Water Process Engineering, 2024, 59: 105098. DOI:10.1016/j.jwpe.2024.105098
|
| [41] |
XIE YM, TIAN XL, HE Y, DONG SL, ZHAO K. Nitrogen removal capability and mechanism of a novel heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium Halomonas sp. DN3[J]. Bioresource Technology, 2023, 387: 129569. DOI:10.1016/j.biortech.2023.129569
|
| [42] |
IGUNNU ET, CHEN GZ. Produced water treatment technologies[J]. International Journal of Low-Carbon Technologies, 2014, 9(3): 157-177. DOI:10.1093/ijlct/cts049
|
| [43] |
微生物高盐渗透适应策略及其耐盐强化研究进展[J]. 微生物学报, 2022, 62(9): 3306-3317. CHEN L, JIN AN, MA XJ, WU D, FENG HJ. Research progress on osmotic pressure adaptation strategy and salt tolerance enhancement of microorganisms under high salinity environment[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(9): 3306-3317 (in Chinese). |
| [44] |
PENG SL, KAI M, YANG XY, LUO YY, BAI LH. Study on the osmoregulation of "Halomonas socia" NY-011 and the degradation of organic pollutants in the saline environment[J]. Extremophiles, 2020, 24(6): 843-861. DOI:10.1007/s00792-020-01199-5
|
| [45] |
HOBMEIER K, CANTONE M, NGUYEN QA, PFLÜGER-GRAU K, KREMLING A, KUNTE HJ, PFEIFFER F, MARIN-SANGUINO A. Adaptation to varying salinity in Halomonas elongata: much more than ectoine accumulation[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 846677. DOI:10.3389/fmicb.2022.846677
|
| [46] |
嗜盐菌耐盐机制相关基因的研究进展[J]. 微生物学通报, 2015, 42(3): 550-558. WANG WW, TANG HZ, XU P. Salt-tolerance related genes in halophilic bacteria and archaea[J]. Microbiology China, 2015, 42(3): 550-558 (in Chinese). |
| [47] |
WEON SY, LEE CW, LEE SI, KOOPMAN B. Nitrite inhibition of aerobic growth of Acinetobacter sp.[J]. Water Research, 2002, 36(18): 4471-4476. DOI:10.1016/S0043-1354(02)00185-9
|
| [48] |
ZHANG SN, CHEN JL, LIU F, LV ST, WU JS. Effect of free ammonia and free nitrous acid on nitrogen removal of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacteria[J]. Journal of Water Process Engineering, 2023, 56: 104316. DOI:10.1016/j.jwpe.2023.104316
|
| [49] |
水体中亚硝酸盐积累的生物过程及影响因素研究进展[J]. 生物工程学报, 2020, 36(8): 1493-1503. NIE M, LI ZL. Bioprocess of nitrite accumulation in water-a review[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(8): 1493-1503 (in Chinese). DOI:10.13345/j.cjb.190578 |
| [50] |
耐高浓度氨氮的异养硝化好氧反硝化菌株U1的鉴定及其脱氮特性[J]. 微生物学通报, 2022, 49(7): 2442-2456. GAO YJ, JIN JC, GAO J, GAO YX, WU HJ, ZHANG WT, LI CC, ZHANG GW, JIN YS. Identification and denitrification characteristics of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification strain U1 resistant to high concentrations of ammonia nitrogen[J]. Microbiology China, 2022, 49(7): 2442-2456 (in Chinese). |
| [51] |
ZHANG QL, LIU Y, AI GM, MIAO LL, ZHENG HY, LIU ZP. The characteristics of a novel heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7[J]. Bioresource Technology, 2012, 108: 35-44. DOI:10.1016/j.biortech.2011.12.139
|
| [52] |
HU B, LU JY, QIN YX, ZHOU M, TAN Y, WU P, ZHAO JQ. A critical review of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification process: influencing factors and mechanisms[J]. Journal of Water Process Engineering, 2023, 54: 103995. DOI:10.1016/j.jwpe.2023.103995
|
| [53] |
LIU YX, HU TT, SONG YJ, CHEN HP, LV YK. Heterotrophic nitrogen removal by Acinetobacter sp. Y1 isolated from coke plant wastewater[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2015, 120(5): 549-554. DOI:10.1016/j.jbiosc.2015.03.015
|
| [54] |
LU JY, TAN Y, TIAN SH, QIN YX, ZHOU M, HU H, ZHAO XH, WANG ZF, HU B. Effect of carbon source on carbon and nitrogen metabolism of common heterotrophic nitrification-aerobic denitrification pathway[J]. Chemosphere, 2024, 361: 142525. DOI:10.1016/j.chemosphere.2024.142525
|
| [55] |
SALEH-LAKHA S, SHANNON KE, HENDERSON SL, GOYER C, TREVORS JT, ZEBARTH BJ, BURTON DL. Effect of pH and temperature on denitrification gene expression and activity in Pseudomonas mandelii[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(12): 3903-3911. DOI:10.1128/AEM.00080-09
|
| [56] |
ZHANG JB, WU PX, HAO B, YU ZN. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(21): 9866-9869. DOI:10.1016/j.biortech.2011.07.118
|
| [57] |
WANG CJ, HU HY, SHI JJ, CHEN LX, WANG LX, BAO ZH. Copper-ion-mediated removal of nitrous oxide by a salt-tolerant aerobic denitrifier Halomonas sp. 3H[J]. Environmental Technology & Innovation, 2023, 30: 103045.
|
| [58] |
CHEN JL, SHEN L, LI Y, CAO HP, CHEN CX, ZHANG GL, XU ZH, LU YH. Insights into the nitrogen transformation mechanism of Pseudomonas sp. Y15 capable of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification[J]. Environmental Research, 2024, 240(1): 117595.
|
| [59] |
高效异养硝化-好氧反硝化菌Glutamicibacter sp. WS1低温下对多种氮源的脱氮特性及氮代谢机制[J]. 环境科学, 2023, 44(9): 5006-50016. WEI BH, LUO X, LÜ PY, MA WK, SU JW, LI W, CUI JS. Nitrogen removal characteristics and metabolism mechanism of high-efficiency cold-tolerant heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium Glutamicibacter sp. WS1 for various nitrogen sources at low temperature[J]. Environmental Science, 2023, 44(9): 5006-50016 (in Chinese). |
| [60] |
SUN YL, FENG L, LI A, ZHANG XN, YANG JX, MA F. Ammonium assimilation: an important accessory during aerobic denitrification of Pseudomonas stutzeri T13[J]. Bioresource Technology, 2017, 234: 264-272. DOI:10.1016/j.biortech.2017.03.053
|
| [61] |
金属离子对粪产碱杆菌C16的脱氮和亚硝酸盐积累的影响[J]. 微生物学通报, 2014, 41(11): 2254-2263. WANG Y, LIU YX, AN H, ZHANG H. Influence of metal ions on nitrogen removal and NO2−-N accumulation by Alcaligenes faecalis C16[J]. Microbiology China, 2014, 41(11): 2254-2263 (in Chinese). |
| [62] |
MAN QL, ZHANG PL, HUANG WQ, ZHU Q, HE XL, WEI DS. A heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium Halomonas venusta TJPU05 suitable for nitrogen removal from high-salinity wastewater[J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2022, 16(6): 69.
|