2025, Vol. 41中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 苟芳, 石云椿, 陈灏, 付文婷, 李良杰, 邢志林, 郭江枫
- GOU Fang, SHI Yunchun, CHEN Hao, FU Wenting, LI Liangjie, XING Zhilin, GUO Jiangfeng
- 粘质沙雷氏菌TF-1对土壤中氯苯类污染物生物降解及其在场地原位修复中的应用
- Serratia marcescens TF-1 for biodegradation of chlorobenzene contaminants in soil and its application in in-situ remediation of chemical industrial sites
- 生物工程学报, 2025, 41(6): 2483-2497
- Chinese Journal of Biotechnology, 2025, 41(6): 2483-2497
- CSTR: 32114.14.j.cjb.241011
- DOI: 10.13345/j.cjb.241011
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文章历史
- Received: December 31, 2024
- Accepted: April 8, 2025
- Published: April 9, 2025
引用本文
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氯代芳烃作为化工生产中常用的原料和中间体，广泛应用于染料、农药、橡胶和有机溶剂生产过程[1-2]。由于环境泄漏和不当处理，氯代芳烃污染在化工场地中普遍存在，其中，污染场地土壤介质中的典型氯代芳烃浓度可达1.11×106 ng/kg，是其他介质中含量的数百倍[2]。在这些污染物中，氯苯类化合物(chlorobenzenes, CBs)的污染占比最大，包括氯苯(chlorobenzene, CB)及其不同氯取代物[3-4]。氯原子与芳香环紧密结合，使得CBs热稳定性强，在环境中难以降解[5-6]。此外，低氯取代物如CB、二氯苯(dichlorobenzene, DCBs)等挥发性强，极易释放到空气、水体和岩层中，对生态环境造成严重威胁[7]。该类物质已被《斯德哥尔摩公约》和美国环保署列为优先控制污染物[8]。因此，采取有效措施去除环境中的CBs污染十分重要。
传统物化法处理该类污染成本高、条件复杂，且易产生有毒副产物[9-10]，相比之下，生物法处理成本低，条件相对简单，无二次污染，被认为是CBs降解的最有效途径之一[10-12]。多年来，科研工作者在CBs降解菌分离、降解机理解析和生物强化等方面开展了广泛的研究[13]。在好氧环境中，已分离出伯克霍尔德菌(Burkholderia)、假单胞菌(Pseudomonas)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)和红球菌(Rhodococcus)等几十种功能菌[14]；而在厌氧条件下，功能菌种类较少，仅有十几种，如脱卤球菌(Dehalobium)、脱卤拟球菌(Dehalococcoides)和脱卤素杆菌属(Dehalobacter)等[10, 14]。通过降解特性和酶学分析发现，好氧条件下CBs在微生物双加氧酶、脱氢酶和氧化酶等作用下转化为无机物，并为微生物提供碳源和能源[9]；而厌氧条件下，CBs在脱卤酶作用下转化为低氯取代物。这些研究为污染场地中CBs生物修复提供了重要的理论支撑。
近年来，研究者们探索了功能菌在CBs生物转化中的应用，并取得了一定进展。有研究利用土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri) DH-1在生物滤池中强化1, 4-二氯苯(1, 4-dichlorobenzene, 1, 4-DCB)的降解，降解率高达100%，实现了污染物稳定去除[15]。此外，还有研究对化工废水管道周边的CBs污染状况及其降解过程进行了长期监测，发现1, 2, 4-三氯苯(1, 2, 4-trichlorobenzene, 1, 2, 4-TCB)、DCBs和CB是主要污染物。模拟研究表明，1, 2, 4-TCB以2%、10%和88%的摩尔比分别脱氯为1, 2-二氯苯(1, 2-dichlorobenzene, 1, 2-DCB)、1, 3-二氯苯(1, 3-dichlorobenzene, 1, 3-DCB)和1, 4-DCB[10]。同时，Kurt等[11]发现沉积物中CB自然衰减速率可达2.0–4.2 g/(m2·d)，通过增强沉积物的生物降解能力，可有效降低CB向水体扩散的风险。这些研究结果表明，生物降解是去除环境中CBs的有效策略。然而，由于实际场地环境复杂，功能菌株在实际场地中的应用效果与实验室存在显著差异，许多菌株在实际场地环境中难以发挥预期作用。当前关于功能菌株在实际场地中降解CBs的应用研究仍十分有限。
因此，本研究系统地研究了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) TF-1[16]在模拟土壤和实际污染场地土壤中对典型CBs的降解能力。首先，通过批次血清瓶培养，考察了不同条件下CB的降解特性，并进行了动力学分析；其次，在实验室条件下，研究了CB和1, 2-DCB在模拟污染土壤中的同化与共代谢降解特性，拟合了降解动力学常数，确定了最佳修复条件；随后，在实际化工污染场地中，开展了CBs的原位修复研究，并分析了菌株的定殖情况及微生物群落结构的变化；以期为利用功能菌株进行污染土壤的原位生物修复提供重要理论支持和实践指导。
1 材料与方法 1.1 主要试剂CB和1, 2-DCB (>99%，分析纯)购自天津阿法埃莎有限公司；琼脂(分析纯)购自北京索莱宝科技有限公司；酵母提取物(化学纯)和蛋白胨(化学纯)购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；其他化学试剂(分析纯)均购自成都市科龙化学品有限公司。
1.2 菌株、培养基及环境因子优化CB降解菌TF-1分离自某废弃焦化厂收集的氯代芳烃污染土壤，经纯化鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)[16]。
无机盐培养基(MSM)：1 L溶液中含有CaCl2 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.40 g，NH4Cl 2.02 g，KH2PO4 3.00 g，Na2HPO4·12H2O 17.70 g，NaCl 0.50 g，1.25 mL微量元素溶液(用0.22 μm的滤膜过滤进行消毒)。通过添加1 mol/L的NaOH溶液调整pH值为7.0。
微量元素溶液(1 L)：0.010 g H3BO3，0.100 g CaCl2·2H2O，0.010 g CuSO4·5H2O，0.024 g NiCl2·6H2O，0.025 g Na2WO4·2H2O，0.025 g Na2MoO4，0.100 g CoCl2·6H2O，0.100 g FeSO4·7H2O，0.010 g KAl(SO4)2·12H2O，0.130 g ZnCl2，0.500 g MnSO4·H2O，1.000 g NaCl，1.500 g NTA，3.000 g MgSO4，蒸馏水1 L。
将菌株TF-1接种至含有200 mg/L CB的150 mL LB液体培养基中，置于30 ℃、160 r/min的恒温摇床培养。当菌株生长至对数期，取菌液在12 000 r/min条件下离心5 min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0)洗涤2次，置于4 ℃冰箱保存。设置单因素实验，在含60 mg/L CB的50 mL灭菌MSM中接种稀释菌液。
pH值影响实验：分别调节pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，接种量为2% (体积分数)，在30 ℃、160 r/min的摇床中培养。
接种量影响实验：设置接种量(体积分数)分别为1.0%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%，培养条件为30 ℃、160 r/min，pH值为7.0。
温度影响实验：分别设置培养温度为15、20、25、30、35、40 ℃，接种量为2% (体积分数)，培养条件为160 r/min，pH值为7.0。连续10 d每隔24 h取样，测定菌液OD600和CB浓度，所有实验均重复3次。灭菌组为对照组。
1.3 土壤样品采集和预处理实验室土壤样品采集地点为106.489°N、29.475°E，无氯代芳烃污染。土样中有机质含量为24.90 g/kg，总磷含量为0.75 g/kg，总氮含量为1.53 g/kg，pH为6.5。土质为粉壤土，其中砂粒(1.00–0.05 mm)含量约20%，粗粉粒(0.05–0.01 mm)含量约40%，黏粒(<0.001 mm)含量约30%。土壤样品采集自表层以下20–30 cm处，在室温下进行干燥处理，过2 mm筛，装入聚乙烯袋，于4 ℃黑暗条件下密封储存。
1.4 模拟CBs污染土壤的生物降解强化试验实验设计如表 1所示。分别将CB和1, 2-DCB饱和溶液加入到土壤样品中，混合均匀。根据已报道的污染土壤中氯苯的浓度范围[17-18]，设置土样中CBs最终浓度为200 mg/kg，在阴凉处密封避光放置48 h，然后将上述土壤与菌悬液混合(1.25 mL/20 g土壤)培养。前期研究结果表明，柠檬酸钠(sodium citrate, SC)和琥珀酸钠(sodium succinate, SS)可强化CB的生物降解[16]，因此，本研究将土壤中SC和SS的浓度设置为7% (质量比)，土壤含水量设置为15%，各组均在30 ℃下培养。每隔2 d测定CB和1, 2-DCB浓度，共设置22组实验，空白组中土壤灭菌(121 ℃、103 kPa高压蒸汽，0.02%叠氮化钠)处理，所有实验重复3次。参照文献方法连续监测土壤中CBs浓度[19]，并采用一级动力学方程(lnC=–kt+b，其中C为CBs浓度，k为降解动力学常数，t为时间，b为常数)进行拟合，计算降解动力学常数。
| No. | Soil | CB | 1, 2-DCB | Sodium succinate (SS) | Sodium citrate (SC) | TF-1 |
| 1 | Sterilization | + | – | – | – | – |
| 2 | Sterilization | + | – | + | – | – |
| 3 | Sterilization | + | – | + | – | + |
| 4 | Sterilization | + | – | – | – | + |
| 5 | Sterilization | + | – | – | + | – |
| 6 | Sterilization | + | – | – | + | + |
| 7 | Non-sterilized | + | – | – | – | – |
| 8 | Non-sterilized | + | – | + | – | – |
| 9 | Non-sterilized | + | – | + | – | + |
| 10 | Non-sterilized | + | – | – | + | – |
| 11 | Non-sterilized | + | – | – | + | + |
| 12 | Sterilization | – | + | – | – | – |
| 13 | Sterilization | – | + | + | – | – |
| 14 | Sterilization | – | + | + | – | + |
| 15 | Sterilization | – | + | – | – | + |
| 16 | Sterilization | – | + | – | + | – |
| 17 | Sterilization | – | + | – | + | + |
| 18 | Non-sterilized | – | + | – | – | – |
| 19 | Non-sterilized | – | + | + | – | – |
| 20 | Non-sterilized | – | + | + | – | + |
| 21 | Non-sterilized | – | + | – | + | – |
| 22 | Non-sterilized | – | + | – | + | + |
| + indicates addition; – indicates no addition. | ||||||
菌液扩大培养：TF-1菌株采用分批式机械搅拌通风发酵罐(重庆士继生态环境科技有限公司)进行扩大培养，以无水乙酸钠为碳源。发酵参数设置为：温度35 ℃，转速170 r/min，接种量为2%，单一罐体扩培体积为35 L。实验开始前，首先对空气过滤器进行蒸汽灭菌处理(压力保持在0.12–0.14 MPa，持续0.5 h)，并用无菌空气吹干约20 min。随后对发酵罐进行空消，夹套蒸汽灭菌压力维持在0.12 MPa，持续30 min。灭菌完成后，加入配制好的培养基并预热至90 ℃，然后升温至121 ℃进行实消(压力保持在0.12–0.14 MPa，灭菌时间30 min)。培养基灭菌结束后，冷却至35 ℃并接种预培养的种子液(接种量为2%)。发酵过程中，通过自动控制系统设定发酵参数(转速170 r/min，温度35 ℃)，并每隔4–5 h取样，用于测定OD600，当菌液OD600达到0.8时，发酵停止，将菌液转移至无菌桶中密封，4 ℃保存，用于场地修复试验，保藏时间不超过24 h。
在某化工污染场地选择一块面积为16 m2 (2 m×8 m)的土地进行原位修复实验，该场地为焦化厂原址，搬迁后经评估需进行修复，主要污染物涉及卤代物、汞和多环芳烃等，土质为粉壤土，其中砂粒(1.00–0.05 mm)含量约20%，粗粉粒(0.05–0.01 mm)含量约40%，黏粒(<0.001 mm)含量约30%。设置A、B这2个试验点(间隔4 m，互为对照组)用于生物刺激药剂注入，在A点注入300 L生物药剂(50 L菌液、1 kg SS、250 L自来水)，在B点注入300 L SS溶液(1 kg SS、300 L自来水)，注入深度为地下0.3 m，2点注入工作同时进行。在修复前和注入药剂10 d后，分别从A和B采集土壤样本，检测污染物浓度并测定微生物群落结构。DNA提取和测序方法参照文献[14]。
1.6 CB降解动力学分析将稀释后菌液(2%，体积比)接种到含有不同浓度CB的50 mL MSM中，根据已报道环境中CBs的浓度范围[4-5]，设置CB浓度为20–200 mg/L，浓度梯度为20 mg/L，在30 ℃、160 r/min恒温摇床中培养6 d。测定CB浓度和OD600值，评估CB比降解速率(v0)和菌株比生长速率(µ0)，用插值法计算菌株最大比生长速率(μmax)和CB的最大比降解速率(vmax)。
采用Haldane模型计算动力学参数[20]：
| $ \mu_0=\frac{1}{X} \cdot \frac{\mathrm{~d} X}{\mathrm{~d} t}=\frac{u_{\max } S}{K_{\mathrm{s}}+S+S^2 / K_{\mathrm{i}}} $ | (1) |
| $ v_0=\frac{1}{X} \cdot \frac{\mathrm{~d} S}{\mathrm{~d} t}=\frac{v_{\max } S}{K_{\mathrm{s}}+S+S^2 / K_{\mathrm{i}}} $ | (2) |
式中：µ0为菌株比生长速率，单位为h；X为菌液TF-1的浓度，单位为mg/L；t为时间，单位为h；
土壤中CBs检测参考文献[19]，方差分析采用单因素方差分析(P<0.05)。菌液浓度y用紫外可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)检测。引入Boltzmann方程，以时间t为横坐标，菌液浓度y为纵坐标，拟合菌株生长曲线，建立TF-1的生长模型。
Boltzmann方程如下：
| $ y=\frac{\mathrm{A}_1-\mathrm{A}_2}{1+\mathrm{e}^{\left(t-t_0\right) / d t}}+\mathrm{A}_2 $ | (3) |
式中：y为菌液吸光度OD600；A1、A2为常数。
CB降解率vCB计算公式如下：
| $ v_{\mathrm{CB}}=\frac{c_0 V_0-c_{\mathrm{t}} V_{\mathrm{t}}}{t \cdot m_{\text {cell }}} $ | (4) |
式中：vCB为CB的降解速率，单位为mol/(gcell·h)；c0为初始CB浓度，单位为mg/L；ct为t时刻CB浓度，单位为mg/L；V0和Vt分别为初始和t时刻溶液体积，单位为L；t为时间，单位为h；mcell为细胞浓度，单位为mg/L。
一阶动力学拟合方程式如下：
| $ \ln c_{\mathrm{t}}=-\mathrm{k} \cdot t+\mathrm{a} $ | (5) |
式中：ct为t时刻CB浓度，单位为mg/L；k为CB降解速率常数；a为拟合常数。
半衰期计算公式如下：
| $ t_{1 / 2}=0.693 / \mathrm{k} $ | (6) |
不同条件下TF-1生长及其对CB降解结果如图 1所示。在pH为7.0、接种量为5%、温度为30 ℃时，TF-1生长和CB降解能力均最强，此时CB的半衰期为35.5 h，最大降解率为88.50%。当pH为5.0–9.0时，CB降解率均保持在30%以上，表明TF-1具有较强的耐酸碱性，可适用于不同酸碱类型土壤，在中性环境中其活性最大；当温度为20–35 ℃时，TF-1均生长良好，一定范围内升高温度，可促进菌株生长，但过高温度会抑制菌株生长、降低酶活。在偏酸和偏碱环境下，菌株生长较差，酸碱环境对细胞质膜的通透性和结构稳定性产生了影响，从而影响菌株的营养吸收，进而抑制生长。液体培养基中，菌体密度与接种量呈正相关，但随着接种量的增加，CB的降解率先升高后下降。这主要是因为在等量的碳源和能源条件下，虽然接种量增加，微生物对CB的降解能力增大，但同时对碳源和能源的消耗也增加，导致降解率下降[21]。
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| 图 1 不同条件下CB生物降解能力 Fig. 1 CB biodegradation capability under different conditions. A: Different pH; B: Different inoculations; C: Different temperature; D: Different CB initial concentrations. A：不同pH；B：不同接种量；C：不同温度；D：不同CB初始浓度。 |
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通过测定CB去除效率，评估TF-1在CB初始浓度为20–200 mg/L的生物降解能力(图 1D)。空白实验中CB浓度保持不变，实验组中CB浓度均逐渐降低，表明TF-1能有效降解CB，降解速率随着CB初始CB浓度的增加，从1.65 mg/(L·h)逐渐降低至0.32 mg/(L·h)，降解半衰期从21.85 h增加到153.19 h。与燕麦食酸菌属(Acidovorax avenae)和罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.) DSM 8910相比，TF-1显示出更高的耐受性，最高耐受浓度高达200 mg/L，其平均降解速率是A. avenae的5倍[22]。高耐有机溶剂菌株分离困难，市场需求量大[23]。在本研究中，CB浓度为200 mg/L时，第1天其降解率为45.56%，展示了TF-1的高耐受性及应用潜力。
2.2 TF-1降解CB的动力学分析采用Haldane抑制动力学模型对CB降解过程进行了拟合，结果如图 2所示。Haldane模型与实验数据拟合度高(R2 >0.90)，模型参数μmax、Ks和Ki分别为0.98 h–1、23.12 mg/L和1 737 mg/L。随CB浓度增加，比生长速率µ0先升高后下降(图 2A)。当CB浓度低于23.12 mg/L时，增加CB浓度有利于提高TF-1的活性；当浓度进一步增加时，CB会抑制菌体生长。与文献报道的功能菌，如潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa) MCB032 (μmax为0.34 h–1)[24]、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickkettii) L2 (μmax为0.36 h–1)[25]相比，TF-1展示出更高的比生长速率(μmax为0.895 h–1)，说明TF-1具有更强的CB利用能力。
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| 图 2 CB为生长底物时TF-1的动力学分析 Fig. 2 Kinetic analysis of TF-1 when CB is the growth substrate. A: Specific growth kinetics; B: Specific degradation kinetics. A：比生长动力学；B：比降解动力学。 |
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图 2B展示了不同CB浓度下TF-1的比降解速率，Haldane动力学模型拟合较好(R2 >0.90)，降解抑制动力学与生长抑制动力学曲线趋势相似，进一步证实高浓度CB对TF-1的生物降解有抑制作用。模型参数vmax、Ks、Ki分别为3.99 h–1、23.12 mg/L和1 737 mg/L，与文献报道的苍白杆菌(Ochrobactrum sp.) ZJUTCB-1[20]相比(vmax为3.315 h–1)，TF-1的vmax更高。这些结果进一步证明，TF-1具有较强的适应性和生物降解能力，在处理CB污染方面展现出良好的应用潜力。
2.3 CBs在模拟污染土壤中的降解及动力学分析 2.3.1 CB在土壤中的降解TF-1在土壤中强化降解CB的拟合曲线如图 3所示。在灭菌土壤中，CB浓度在14 d内从100 mg/gsoil降至93–98 mg/gsoil，降解率仅为2%–7%；但接种TF-1菌悬液后，灭菌土壤中CB的降解率迅速提升至60%，半衰期为8.95 d，表明TF-1对土壤中CB的去除作用显著。CB在土壤中的降解符合一级动力学，在未灭菌土壤中，当不添加菌株TF-1和底物时，CB的降解速率常数仅为0.004 5 d–1 (表 2)，远低于ST-CB-TF-1组的降解速率常数(0.077 d–1)，这表明未灭菌的土壤中虽然存在其他能够降解CB的微生物，但活性较低，进一步凸显了生物强化的效果[26-27]。
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| 图 3 CB在污染土壤中的降解曲线 Fig. 3 Degradation curve of CB in contaminated soil. Each test group served as a control to the others, with an initial concentration set at 100 mg/kg for all. The concentration versus time curve was fitted using first-order kinetics. 各试验组间互为对照，设置初始浓度均为100 mg/kg，浓度随时间变化曲线采用一阶动力学拟合。 |
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| Samples | First-order kinetic equation | Degradation rate constant k (d−1) | Half-life t1/2 (d) | Correlation coefficient R2 |
| ST-CB | lnC=–0.000 6 t+4.59 | 0.000 6 | 1 130.00 | 0.926 |
| ST-CB-SC | – | – | – | – |
| ST-CB-SS | lnC=–0.000 1 t+4.60 | 0.000 1 | 6 880.00 | 0.602 |
| ST-CB-TF-1 | lnC=–0.077 0 t+4.61 | 0.077 0 | 8.95 | 0.991 |
| ST-CB-SC-TF-1 | lnC=–0.238 0 t+4.64 | 0.238 0 | 2.91 | 0.982 |
| ST-CB-SS-TF-1 | lnC=–0.381 0 t+4.43 | 0.381 0 | 1.78 | 0.876 |
| UST-CB | lnC=–0.004 5 t+4.59 | 0.005 0 | 154.00 | 0.886 |
| UST-CB-SC | lnC=–0.354 0 t+4.59 | 0.354 0 | 1.96 | 0.985 |
| UST-CB-SS | lnC=–0.259 0 t+4.69 | 0.259 0 | 2.68 | 0.976 |
| UST-CB-SC-TF-1 | lnC=–0.104 0 t+4.62 | 0.104 0 | 6.66 | 0.995 |
| UST-CB-SS-TF-1 | lnC=–0.500 0 t+4.80 | 0.500 0 | 1.39 | 0.943 |
| ST indicates sterilized; UST indicates non-sterilized; SC indicates sodium citrate; SS indicates sodium succinate. | ||||
在接种菌悬液和添加共代谢底物的土壤中，CB生物降解速率常数(表 2)显著高于未添加的ST-CB组(0.000 6 d–1)和UST-CB组(0.004 5 d–1)，说明生物刺激与生物强化相结合更具优势[28-29]。此外，添加TF-1菌液和SC时，灭菌土壤中CB的降解效果更好，表明TF-1可能与土著微生物在利用SC方面存在竞争关系。UST-CB-SC-TF-1和UST-CB-SS-TF-1组中CB的降解速率常数分别为0.104 d–1和0.5 d–1，半衰期分别为6.66 d和1.386 d，表明与SC相比，SS具有更显著的生物刺激效果，更适合在自然环境中用于强化污染降解。
2.3.2 1, 2-DCB在土壤中的降解TF-1在土壤中强化降解1, 2-DCB的拟合曲线如图 4所示。在灭菌且不添加TF-1和底物的土壤中，未发现1, 2-DCB的生物降解。1, 2-DCB在土壤中的降解符合一级动力学方程(表 3)，在未灭菌且不添加TF-1和底物的土壤中，土著微生物能够缓慢降解1, 2-DCB (图 4)，降解速率常数为0.003 5 d–1，半衰期为198 d。
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| 图 4 1, 2-DCB在污染土壤中的降解曲线 Fig. 4 Degradation curve of 1, 2-DCB in soil. Each test group served as a control to the others, with an initial concentration set at 100 mg/kg for all. The concentration versus time curve was fitted using first-order kinetics. 各试验组间互为对照，设置初始浓度均为100 mg/kg，浓度随时间变化曲线采用一阶动力学拟合。 |
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| Samples | First-order kinetic equation | Degradation rate constant k (d–1) | Half-life t1/2 (d) | Correlation coefficient R2 |
| ST-1, 2-DCB | – | – | – | – |
| ST-1, 2-DCB-SC | lnC=–0.002 0 t+4.60 | 0.002 0 | 346.50 | 0.654 |
| ST-1, 2-DCB-SS | lnC=–0.000 5 t+4.53 | 0.000 5 | 1 236.00 | 0.028 |
| ST-1, 2-DCB-TF-1 | lnC=–0.021 9 t+4.58 | 0.022 0 | 31.64 | 0.902 |
| ST-1, 2-DCB-SC-TF-1 | lnC=–0.037 7 t+4.57 | 0.038 0 | 18.38 | 0.895 |
| ST-1, 2-DCB-SS-TF-1 | lnC=–0.025 0 t+4.59 | 0.025 0 | 27.72 | 0.973 |
| UST-1, 2-DCB | lnC=–0.003 5 t+4.62 | 0.004 0 | 198.00 | 0.408 |
| UST-1, 2-DCB-SC | lnC=–0.016 0 t+4.57 | 0.016 0 | 43.31 | 0.812 |
| UST-1, 2-DCB-SS | lnC=–0.040 0 t+4.56 | 0.040 0 | 28.97 | 0.863 |
| UST-1, 2-DCB-SC-TF-1 | lnC=–0.038 0 t+4.61 | 0.038 0 | 18.24 | 0.989 |
| UST-1, 2-DCB-SS-TF-1 | lnC=–0.068 7 t+4.56 | 0.069 0 | 10.09 | 0.906 |
| ST indicates sterilized; UST indicates non-sterilized; SC indicates sodium citrate; SS indicates sodium succinate. | ||||
在添加菌株TF-1的无菌土壤中(ST-1, 2-DCB-TF-1组)，1, 2-DCB的降解速率常数达0.021 9 d–1，半衰期为31.64 d (表 3)，表明TF-1的强化效果显著。灭菌土壤中，当添加菌株TF-1，并分别添加底物SS (ST-1, 2-DCB-SS-TF-1)和SC (ST-1, 2-DCB-SC-TF-1)时，1, 2-DCB的降解速率常数分别为0.037 7 d–1和0.025 d–1，半衰期分别为27.72 d和18.38 d，表明生物强化和生物刺激在1, 2-DCB的降解过程中同样具有协同作用。在未灭菌土壤中，SS和SC均能刺激土壤中土著微生物对1, 2-DCB的转化，其中SS的促进效果更为显著。所有组合中，UST-CB-SS-TF-1组对1, 2-DCB的降解速率最高，降解速率常数为0.068 7 d–1，半衰期为10.087 d，表明同时添加菌液和琥珀酸钠是1, 2-DCB修复的最佳方案。此外，与微生物对CB的降解相比，其对1, 2-DCB的降解能力较弱，说明随着氯取代数的增加，微生物对CBs化合物的好氧降解能力显著下降[18]，这一特性在原位修复过程中应予以重点关注。
2.4 化工污染场地中CBs原位修复试验基于以上研究结果，利用菌株TF-1联合SS对重庆某化工污染场地进行原位修复试验。选择A点和B点同时进行试验，A点注入TF-1菌液和SS溶液，对照组B点只注入SS溶液。修复前后试验场地中典型苯环类污染物浓度变化情况如表 4所示，污染物主要包括苯、CB、1, 2-DCB、1, 4-DCB、苯酚和苯并[a]芘。A点的污染物去除率为84.2%–100%，尤其对CB、1, 2-DCB、1, 4-DCB和苯并[a]芘的去除效果显著，CB、1, 4-DCB和苯并[a]芘甚至可以完全去除；B点的去除率为36.6%–73.3%。
| Organic pollution | Detection limit (mg/kg) |
Pollutant concentration (mg/kg) | ||||
| Remediation test site A | Remediation test site B | |||||
| Before remediation | After remediation | Before remediation | After remediation | |||
| Benzene | 0.1 | 4.50 | 0.21 | 3.90 | 1.5 | |
| CB | 0.1 | 26.70 | ND | 21.60 | 13.7 | |
| 1, 2-DCB | 0.1 | 43.90 | 3.10 | 47.20 | 12.6 | |
| 1, 4-DCB | 0.1 | 6.80 | ND | 9.40 | 4.8 | |
| Phenol | 0.1 | 73.60 | 11.60 | 56.70 | 25.9 | |
| Benzo[a]pyrene | – | 0.71 | ND | 0.65 | 0.5 | |
| ND: Not detected. | ||||||
对修复前后试验点的微生物群落结构进行分析，结果如图 5所示。结合降解效率，分析了微生物群落结构演变与污染物降解效率的协同关系。修复前A点菌属丰度排前4的为未分类的细菌p25 (Bacteriap25) (7.33%)、Vicinamibacteraceae (unclassified genus) (6.48%)、棒状杆菌属(Rokubacteriales) (5.12%)和未分类的芽单胞菌科菌(Gemmatimonadaceae) (5.00%)，这些菌属在污染物胁迫下可能以耐受为主，缺乏高效降解功能。引入TF-1和琥珀酸钠(SS) 10 d后，A点菌群发生显著重构，Serratia丰度跃升至13.91% (修复前未检出)，证实TF-1成功定殖并成为核心功能菌；同时，固氮弧菌属(Azoarcus) (6.59%)和东氏菌属(Dongia) (4.71%)的富集表明其与TF-1形成协同降解网络。Serratia的代谢产物(如铁载体或电子穿梭体)可能通过种间互作激活Azoarcus的脱氯功能，从而加速1, 2-DCB和1, 4-DCB的矿化(降解率100%)。
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| 图 5 化工污染场地修复前后微生物群落组成 Fig. 5 Composition of the microbial community before and after the remediation of the chemically polluted site. Test sites A and B are adjacent plots with similar physicochemical characteristics; site A was injected with TF-1 bacterial solution and SS solution, while the control site B was injected with SS solution only. 试验点A和B为相邻地块，理化特征相近；其中A点注入TF-1菌液和SS溶液，对照组B点只注入SS溶液。 |
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对比B点，修复前丰度排名前4的菌属包括Vicinamibacteraceae (unclassified genus) (7.50%)、MND1 (6.39%)、维西纳杆菌目中未分类菌属Vicinamibacterales (unclassified genus) (5.48%)和Rokubacteriales (2.49%)。修复后Azoarcus丰度显著提升至11.07%，表明SS可能通过调控碳源分配或电子传递途径特异性富集该菌属。但缺乏高效降解菌引入，导致污染物去除率显著低于A点(CB去除率：A点100% vs. B点36.6%)。
3 讨论与结论已有研究表明，有些沙雷氏菌对包括苯并[a]芘在内的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)具有降解潜力[30-32]，推测TF-1可能强化了苯并[a]芘的去除。此外，注入生物药剂不仅能够增强土著微生物的活性，还能通过功能菌株与土著微生物的协同作用进一步促进苯并[a]芘的降解。结合前述研究可知，SS不仅可作为外源碳源协同提升菌株TF-1的降解能力，还能有效激发原位微生物的活性，从而显著增强污染物的去除效果。另外，前期通过非靶向代谢组学分析了功能菌株降解CB的中间产物及机理，检测的中间产物包括3-氯环己烷-3, 5-二烯-1, 2-二醇、3-氯乙醇、2-氯-顺丁烯二酸盐、4-氧合-2-烯二酸酯、3-氧己二酸，最终通过三羧酸循环代谢为无机氯离子[33]。表明该菌株在场地应用中无有毒终产物产生，符合污染物绿色治理的目标。
SS在联合修复体系中可通过多重机制实现协同作用，提升污染物去除效率。从代谢角度看，SS作为易于利用的可溶性碳源，在微生物三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA)中快速生成ATP和NADH，并提供多种中间产物。这不仅能促进微生物的增殖和活性提升，还能诱导单加氧酶和双加氧酶等关键降解酶的表达，加速污染物生物转化[34]。在土壤环境调控方面，SS可通过其代谢产物调节酸碱平衡，同时增强疏水性污染物(如多环芳烃和氯代芳烃)的溶解性和生物可利用性，从而克服污染物因疏水性而导致的直接生物降解受限的问题。同时，SS还能作为辅助碳源驱动微生物共代谢过程，其提供的能量可支撑微生物降解复杂污染物[35]。此外，SS还能通过优化微生物群落协同代谢网络，强化降解功能菌与辅助功能菌间的相互作用，显著提高降解途径的完整性和效率[36]。更重要的是，其代谢产物可作为电子供体促进氧化还原反应，加速污染物脱氯及最终矿化。这一多维度的协同作用机制为SS在联合修复中的重要作用提供了科学依据。
另外，已有研究证实Azoarcus对污染物的高效降解依赖于其独特的代谢网络，如Azoarcus可通过细胞色素P450单加氧酶催化氯氰菊酯酯键断裂[37]；还能利用苯甲酰-CoA途径实现甲苯完全矿化[38-39]。此外，Azoarcus的代谢灵活性与其多底物转运蛋白和电子传递系统密切相关，Azoarcus以延胡索酸为电子穿梭体降解苯酚[40]。这种兼具氧化(如硝酸盐/硫酸盐为电子受体)与共代谢能力的特性，使Azoarcus在SS富碳环境中通过分泌胞外多聚物(extracellular polymeric substances, EPS)强化污染物吸附与酶促反应，从而占据生态位优势。基于上述机制，未来可通过多组学联合分析靶向挖掘加氧酶、脱卤酶等关键功能基因，并结合合成生物学优化其代谢通路，以提升污染修复应用潜力。因此，在未来功能菌株的分离纯化和应用研究中，Azoarcus可作为重点研究对象。
然而，当前在功能菌株的筛选和实际应用中仍存在一些挑战。实验室条件与实际场地环境的差异可能导致功能菌株在实际应用中的效果不佳。此外，功能菌株的筛选和优化通常耗时且复杂，需要大量的实验数据支持。为了克服这些挑战，研究者可以结合人工智能和深度学习等前沿技术，以提高功能菌株筛选和优化的效率，为环境污染治理提供全面技术支持。
本研究系统评估了Serratia marcescens TF-1对CBs的生物降解特性及其在复杂污染场地中的应用潜力，主要结论如下：(1) 在pH 7.0、接种量5%、温度30 ℃的条件下，菌株TF-1具有最佳的CB降解能力，降解半衰期为35.5 d，最大降解率为88.50%。在CB初始浓度为20–200 mg/L时，TF-1的降解速率从1.65 mg/(L·h)降至0.32 mg/(L·h)，显示出较强的耐受性和高效的降解性能。Haldane动力学模型表明，在CB浓度低于23.12 mg/L时，TF-1表现出较高的生长活性和降解能力，但在高浓度污染条件下，CB毒性抑制明显。结果为实际修复中菌株用量和污染物浓度的调控提供了理论依据。(2) TF-1在灭菌和未灭菌土壤中均能有效降解CB和1, 2-DCB。尤其在未灭菌土壤中与生物刺激底物SS联合使用时，CB的降解速率常数达到0.104 d–1，半衰期为6.66 d；1, 2-DCB的降解速率常数为0.068 7 d–1，半衰期为10.087 d。上述结果表明，SS在自然环境下更适合与TF-1协同强化CBs的降解。结果阐明了生物刺激剂SS与TF-1的协同增效机制，为生物强化与生物刺激的耦合修复策略提供了依据。(3) 在化工污染场地应用试验中，TF-1和SS联合作用可实现CBs的高效去除，去除率达到84.2%–100%，其中CB、1, 4-DCB和苯并[a]芘完全去除。生物药剂修复后，微生物群落发生显著变化，沙雷氏菌(Serratia)、固氮弧菌(Azoarcus)和东芽菌属(Dongia)在土壤中富集，表明TF-1能在土壤中定殖。Azoarcus菌属在修复中由非优势菌属变为优势菌属，可能在污染物降解中发挥关键作用。结果为能菌-土著微生物互作网络的生态调控提供了理论依据。
本研究不仅丰富了CBs生物修复的理论基础，还为污染土壤原位生物修复提供了实践指导。在未来的研究中，将进一步通过代谢组学和功能基因分析深入揭示TF-1和Azoarcus的具体降解机制，推动微生物修复技术在环境治理中的应用。
作者贡献声明
苟芳：负责研究的整体设计、实验操作、数据分析和论文撰写。石云椿：协助实验实施，参与数据分析和论文初稿撰写。陈灏：负责部分实验操作，并对数据处理提供支持。付文婷：参与实验设计，提供方法学支持，并协助论文修改。李良杰：负责部分实验检测与数据收集。邢志林：负责研究的总体指导，提供研究经费支持，指导并修改论文。郭江枫：对研究思路提出建议，协助实验操作、数据分析。
作者利益冲突公开声明
作者声明没有任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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