γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是自然界普遍存在的一种四碳非蛋白质氨基酸，主要以兼性离子的方式存于水溶液中^[1-2]。在微生物中，GABA的生成过程与菌体的耐酸机制直接相关^[3-5]。研究发现，大多真核微生物细胞内GABA的存在可促进孢子生长^[6]；另外，GABA在酵母抵御活性氧及有机酸等逆境胁迫中也发挥着重要作用^{[4, 7]}。在植物中，GABA影响着植物碳源和氮源的存储，能诱导生物体中乙烯的合成或调节胞内pH的平衡，同时防止植物体受氧化胁迫或渗透压等外界环境的影响，并在抵抗真菌和害虫等多种生理生化反应中均有参与^[8]。此外，在动物体内GABA同样发挥着重要的生理功效，主要表现为：(1)血压与心率的调节^[9]；(2)促进生长激素分泌^[10]；(3)抗衰老^[11]；(4)保肝利肾^[12]；(5)治疗哮喘^[13]；(6)其余功能：除上述功能外，GABA还具备其他多种生理功效，如改善机体的脂质代谢、减缓血管动脉硬化、防止皮肤的老化、预防肥胖、抑制癌细胞生长和促进生殖等^[13-14]，因此GABA在医药领域得到越来越多的关注。GABA减少活动量、促进生长的作用，使其还可以作为一种新型饲料添加剂应用于畜牧业。

目前工业制备GABA包括化学合成和生物转化两种常用方法，生物转化法相比较化学合成法具有反应过程简单、条件温和的优势，而围绕生物转化法的核心便是谷氨酸脱羧酶。谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)是一种依赖于磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate，PLP)的II类氨基酸脱羧酶，可催化L-谷氨酸或谷氨酸盐脱羧生成GABA，并释放出CO₂^[15]。GAD广泛分布于从单细胞生物到哺乳动物的各种有机体活细胞中。微生物生长条件较简单、生长速度快、代谢过程特殊，成为生物酶的重要来源。利用微生物中的GAD生物转化生产GABA不受资源、环境和空间等因素的限制，具有显著的优点^[16]。但不同来源的GAD在结构和功能上具有一定的差异，因此利用蛋白质工程、生物信息学等技术的支持在现有GAD结构的基础上进行定向改造或者获得新来源的GAD，对得到高效益的GAD具有不可忽视的作用。

蛋白质工程是在基因重组、分子生物学等学科的基础上，融合了蛋白质晶体学、动力学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域，其内容主要有两个方面：(1)根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；(2)确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质空间结构和生物功能的目标，最终设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。例如，Tu等在对蛋白质分子结构进行分析的基础上，在不影响酶活性的同时，通过增加构象的刚性来提高酶的热稳定性^[17-18]。因为不同来源GAD的结构差异较大，且结构与功能之间关系的研究报道较少。因此，本文主要就已有的不同来源谷氨酸脱羧酶的结构进行综述，加深对其催化机制的了解。

1 谷氨酸脱羧酶的来源

GAD广泛存在于动植物和微生物中(表 1)，且GAD在动物中枢神经系统中的作用一直是研究的热点。不同来源的GAD在酶学性质上不仅种属间具有一定差异，而且在亚种之间也有一定差异。通常微生物来源的GAD在酸性范围内具有活性，当pH偏中性时酶活消失；其最适反应pH值在3.8−5.0之间，主要集中在pH 4.0−5.0。植物来源的GAD最适pH为弱酸性，主要集中在pH 5.5−6.0。动物来源的GAD最适pH为中性，在pH 7.0左右。不同GAD最适反应温度差别相对较大，与其生长温度范围有很大关系，生长温度范围较高的微生物、植物的GAD其最适反应温度也相对较高，主要在30−50 ℃之间。

2 谷氨酸脱羧酶的催化机理

GAD是一种PLP依赖酶，PLP可以催化外消旋化、转氨、脱羧、消除、克莱森缩合等多种反应，且PLP催化的大多数反应是从Schiff碱的碳上提取质子，去质子化通常由赖氨酸的氨基进行，赖氨酸是通过PLP从醛亚胺内部释放出来，导致碳负离子中间体即醌类中间体的形成，该中间体由Schiff碱和吡啶环共振稳定^[28]。

PLP催化GAD脱羧生成GABA的具体催化过程如图 1所示。首先，PLP在无底物时同酶活性部位的赖氨酸ε-NH₂以Schiff碱结合，形成内部的醛亚胺结构；在L-Glu进入GAD的底物结合口袋时，辅酶PLP与L-Glu作用形成外部的醛亚胺，继而由GAD催化脱羧形成一种结构极不稳定的醌类中间体；该中间体会立即转化成与PLP结合的醛亚胺结构，同时释放产物GABA，PLP与GAD在反应结束后恢复至初始状态^[28]。

3 谷氨酸脱羧酶的结构特征

随着结构生物学的发展和对GAD研究的深入，研究者们已经得到了来自大肠杆菌、短乳杆菌、拟南芥和人的总共7个GAD的晶体结构(表 2)。

3.1 微生物来源的谷氨酸脱羧酶

目前在很多细菌、真核生物中发现了GAD，其中对大肠杆菌GAD的研究最为深入，并得到了E. coli GAD的晶体结构。

E. coli GAD存在GadA和GadB两种亚型，由染色体上的gadA和gadB两段基因编码，它们与gadC编码的Glu/GABA反转运体——GadC共同组成大肠杆菌的耐酸系统^[29-30]。E. coli GAD是由6个相同的亚基组成的六聚体，六聚体被分成两层，每层由3个亚基组成，两层的亚基呈中心对称。每个亚基由N端、C端和PLP结合区三部分组成，每个PLP结合区中都有一分子PLP通过共价键与GAD的赖氨酸相结合^[31]。GAD每个亚基又可以划分为大(58–346)、小(347–466)两个结构域。大结构域中包含辅因子结合位点，即PLP结构域，以及300–313残基形成的β-发夹结构。该结构域由7条混合的β-折叠片和8个α-螺旋组成。小结构域则由一个四股反平行β-折叠片和3条α-螺旋组成。

E. coli GAD六聚体在酸性pH时具有活性，其整体结构与中性pH时基本一致，主要变化发生在N端、C端以及300–313残基的β-发夹结构^[31]。N端3–15残基在中性pH时不呈现任何形式的二级结构，且在6个亚基中的结构都不相同，其形状类似一个“钩子”，可以延伸到另一层并与另一亚基相连，对六聚体的形成具有重要作用(图 2)；另外，在酸性pH时3−15残基在所有亚基中都会形成垂直于六聚体平面的α-螺旋构象^[33]。

在中性pH下，由第300−313位氨基酸残基组成的β-发夹结构与二聚体中的另外一个亚基C端的463–466位残基相互作用，改变了酶活性中心的空间构象，增大了底物与酶结合的空间位阻。此时的C末端延伸到催化口袋里，H465与K276-PLP结合形成稳定的支撑，T466与活性位点结合，阻止了底物与活性位点的结合，从而使酶活降低(图 3)^[34]。

3.2 植物来源的谷氨酸脱羧酶

与其他来源的GAD相比，植物中的GAD具有特殊的生理功能，其C末端存在钙调蛋白结合区(CaM-binding domains，CaMBD)，可以感知Ca²⁺信号，达到激活GAD的目的^[35]。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)谷氨酸脱羧酶(AtGad1)与细菌GadB结构相似，具有39%的序列同一性，这两种酶具有相同的折叠和亚基结合方式^[32-33]。AtGad1在植物体内参与发育和抵御酸性胁迫，在生理pH的条件下(pH 7.0−8.0)主要以二聚体的形式存在，而酸性条件(pH 6.0−7.0)时二聚体被诱导组合成六聚体，从而达到AtGad1最高的催化活性；AtGad1六聚体的每个亚基由N端(残基1−57)、包含辅因子结合位点的大结构域(残基58−347)、小结构域(残基348−448)和含有钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合区(CaMBD)的C端组成^[35]。AtGad1和GadB最主要的差异在C端，GadB通过C端14个残基来调节其催化活性对pH的依赖性，而AtGad1 C末端约20个残基连接的CaMBD使其依赖于CaM调节酶活^[32-33]。

在Gad1中，活性位点和辅助因子结合模式都有很好的保守性。PLP通过Schiff碱基与Lys277共价连接。吡啶环夹在Gln163和Ala246之间，而Asp244与吡啶环氮形成盐桥；Gad1对应于GadB中Thr62的位置被丝氨酸所取代，其可以与底物结合时充当供氢体^[32] (图 4)。

Gad1和GadB的N端关键功能模块有显著差异，在Gad1中，残基1−15主要是无序的，而低pH时，GadB中每个亚基的3−15残基形成一个α-螺旋，并结合在两个对细胞定位很重要的三螺旋束中，GadB的N端三螺旋束以可逆和pH依赖的方式形成，这改变了蛋白质在细胞中的定位。但是由于少量氨基酸的变化，这两种功能都不存在于植物蛋白Gad1中。相应的Gad1的N端残基不能形成这样的束，因为Gad1的N端没有七肽重复序列^[31]。Gad1 loop区包含16−20残基，其构象有利于卤化物与Ser16和Arg427的结合，即使Ser16在结构上是保守的，但在Arg427的位置上放置一个负电荷残基(Glu423)的突变可以防止卤化物通过静电斥力与Gad1结合^[28]。

3.3 动物来源的谷氨酸脱羧酶

动物GAD在动物体内作为一种神经递质，存在GAD65和GAD67两种亚型，它们都以二聚体形式存在，但具有不同的结构特征。GAD在动物体内的作用机制一直是研究的热点。

GAD67单体由C端、PLP结合域以及N端三部分组成，N端包括两个平行的α-螺旋；PLP结合域包括9个α-螺旋围绕的一个九股的平行β-折叠片；C端结构域包含3个α-螺旋和一个四股反平行β-折叠片；GAD67的两个活性位点位于二聚体PLP结合域的中心，在单体A中，活性中心包含单独的GABA分子，GABA的羧基与Arg567形成盐桥，与Gln190形成氢键；在单体B的活性中心，观察到GABA两种无序的结构构象，PLP和GABA之间的连续电子密度揭示了PLP-GABA中间体的存在^[30](图 5)。

值得注意的是，每个活性位点基本上都被另一个单体延伸过来的Loop环(残基432−442，称为“催化环”)所覆盖。催化环使保守残基Tyr434非常接近碱基堆积His291和GABA (图 6)；在单体A的活性位点，Tyr434的侧链羟基与碱基堆积His291的Nε2形成氢键；在单体B的活性位点，Tyr434被翻转成另一种构象，其中羟基的氢键键合到Tyr291的主链氮^[36] (图 5)。在前一构象(图 5A)中，Tyr434的羟基距离PLP-GABA部分的质子化位点(Cα)为2.8Å，在活性位点可观察到游离GABA^[30]。因此，我们认为Tyr434直接负责Cα的质子化，Tyr434与His291之间的氢键有利于降低单体A活性中心Tyr434的pKa。在单体B的活性位点，Tyr434的羟基不能使PLP-GABA部分的Cα质子化，因为它离Cα的距离大于6 Å^[30]。这与PLP-GABA中间体的存在是一致的，Tyr434的扭转也有助于底物从活性位点进入和产物流出。综上所述，这些结构为GAD67生产GABA提供合理的理论支撑。

在动物体内GAD67和GAD65都负责转化GABA，而GAD67始终处于活性状态来保持机体内L-Glu/GABA的正常代谢；GAD65通常以脱辅酶的形式存在细胞中，仅在机体迫切需要GABA时才具有活性^[36-37]。GAD65和GAD67采用相同的折叠和二聚体组合方式，PLP在GAD65的两个活性位点通过共价键连接到Lys396上^[30]。也可以观察到类似于在GAD67中看到GABA两个离散无序的构象，但是没有观察到共价PLP-GABA中间体的存在(图 7)。值得注意的是，与GAD67相比，GAD65中与催化环对应的区域是无序的，活性位点完全暴露(图 7)。

催化环所包裹的整个C末端区域的动态构象是GAD65失活的关键，C末端结构域在催化环的稳定性中起着重要作用。对GAD67来说，活性位点上Tyr434的持续存在有利于质子化位点的质子化和GABA的不间断产生。

4 展望

随着对不同来源GAD的性质及其产物GABA在神经系统中不可或缺作用的逐步了解，使得GABA在医药领域得到越来越多的关注；而且，GABA减少活动量、促进生长的作用使其可以作为一种新型饲料添加剂应用于畜牧业^[38]。因此，获得生产效率高且安全应用的GAD生物酶便成为了研究的目标。然而目前报道的微生物GAD活性相对较低，而且大多数都具有潜在的不安全性，例如，大肠杆菌在发酵过程容易产生内毒素，因此寻找活性高且能安全用于GABA生产的微生物仍需不断努力。

近年来，结合分子生物学、蛋白质组学、生物信息学等领域的发展，可以从基因编辑及蛋白质定向改造方面入手获得新型优质的生物酶^[39]。例如，本实验室对多聚半乳糖醛酸酶和葡萄糖氧化酶进行蛋白质结构改造，使酶的性能能更好地应用于生产需要^[40]。对蛋白质进行的理性设计是基于对结构深入认知后展开的，也是用来确定与催化效率相关的重要因素^[18]。然而目前获得的GAD结构较少，对于全面了解该酶的催化机制，以及在此基础上进行结构改良获得高转化效率的GAD具有一定的局限性。因此，获得更多不同来源的GAD结构，分析确定其保守残基及底物结合方式，对于更全面地了解GAD的催化机制、提高催化效率具有重要的指导意义，这也是我们需要努力的方向。