Q20L及G247D定点突变对葡萄糖异构酶酶活和最适pH的改善

摘要:

用双引物法对GI基因进行体外定点突变，构建了突变体Q20L和G247D。含突变基因的重组表达质粒pTKD-GIQ20L及pTKDGIG247D在E.coli K38菌株中表达。纯化的突变酶与野生型酶相比：(1) GIQ20L的最适反应温度下降5℃，热稳定性为野生型酶的78%，对底物的亲和性增强；(2) GIG247D的酶活提高约33%，最适pH下降0.6个单位，但热稳定性降低。初步分析认为,Gln 20位于α0～α1螺旋之间，其亲水侧链被Leu的疏水侧链取代后，分子表面增强的疏水作用，反而不利于蛋白质的稳定，使GIQ20L的热稳定性降低。Gly247是酶活性中心β折叠(242～247aa)的最后一个残基。引入电负性极强的Asp后，可能改变分子的静电场分布，影响了活性部位的电荷传递过程，使GIG247D酶活提高。引入的电荷，可能改变活性中心可解离基团的pKa，使其最适pH下降。另外Asp247的侧链在周围空间结构中显得过于拥挤，易与其他侧链产生排斥，由此影响到β-折叠的稳定性，接近亚基结合面的Asp247，可能进一步影响到亚基间相互作用的稳定性，最终导致酶热稳定性的降低。GI酶活和最适pH的改善更利于工业生产。

Abstract: