科微学术
生物工程学报
ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q
主管单位： 中国科学院 创刊时间：1985年
主办单位： 中国科学院微生物研究所 出版刊期：月刊
中国微生物学会 邮发代号：82-13
主 编： 邓子新 院士 出版日期：每月25日
执行主编： 李寅
收录类型：北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、MEDLINE/PubMed、EI、Scopus、AJ、JST、CSA(NS)、IC、EMBASE
主要栏目：综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学
- 2025年第41卷第4期
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2025,41(4):I-VI, DOI: 10.13345/j.cjb.250263
, CSTR: 32114.14j.cjb.250263
摘要：
2025,41(4):1221-1239, DOI: 10.13345/j.cjb.240742
, CSTR: 32114.14j.cjb.240742
摘要：
细菌膜囊泡(membrane vesicles,MVs)是细菌产生的非复制性球形纳米颗粒，其中由革兰氏阴性菌自发产生的囊泡被称为外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)。OMVs可以介导脂多糖、肽聚糖、蛋白质和核酸等生物分子在群体间进行物质交流，并发挥着不同的生理学功能。近年来，基于其独特的结构和功能，OMVs已被开发应用于疫苗、佐剂、药物递送载体和癌症免疫治疗剂等多种生物制品。本文综述了革兰氏阴性菌OMVs的产生途径、组成成分和生理学功能，归纳总结了近年来OMVs在应用开发、修饰改造以及制备鉴定等方面的研究进展，并对OMVs的未来研究方向提出展望，为拓展OMVs在生物医学领域的应用提供了参考。
细菌膜囊泡(membrane vesicles,MVs)是细菌产生的非复制性球形纳米颗粒，其中由革兰氏阴性菌自发产生的囊泡被称为外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)。OMVs可以介导脂多糖、肽聚糖、蛋白质和核酸等生物分子在群体间进行物质交流，并发挥着不同的生理学功能。近年来，基于其独特的结构和功能，OMVs已被开发应用于疫苗、佐剂、药物递送载体和癌症免疫治疗剂等多种生物制品。本文综述了革兰氏阴性菌OMVs的产生途径、组成成分和生理学功能，归纳总结了近年来OMVs在应用开发、修饰改造以及制备鉴定等方面的研究进展，并对OMVs的未来研究方向提出展望，为拓展OMVs在生物医学领域的应用提供了参考。
2025,41(4):1240-1251, DOI: 10.13345/j.cjb.240851
, CSTR: 32114.14j.cjb.240851
摘要：
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)可引起慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等疾病，被世界卫生组织列为I类致癌物。临床上主要用抗生素对H.pylori进行杀菌清除治疗。抗生素清除H. pylori不彻底引起的持续感染成为胃癌高发的潜在风险。随着抗生素的广泛使用，H. pylori产生了多重耐药(multidrug resistance,MDR)，进而引起慢性胃病治疗失败及耐药菌株传播风险增加。幽门螺杆菌的多重耐药已成为胃肠疾病诊治的严峻挑战之一。本文结合相关文献和课题组的研究结果，综述了H. pylori多重耐药的全球发展趋势、发生机制、对临床诊断的挑战以及对药物研发的挑战，提出了依据H. pylori的cgt基因表达量测定活菌的新方法，胞内化是H. pylori耐药的新形式，O-聚糖抗H. pylori是应对多重耐药的防治新策略。本文为深入理解H. pylori多重耐药的机制及其防治策略提供了新的思路，有望为未来临床治疗和抗菌药物研发开辟新方向。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)可引起慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等疾病，被世界卫生组织列为I类致癌物。临床上主要用抗生素对H.pylori进行杀菌清除治疗。抗生素清除H. pylori不彻底引起的持续感染成为胃癌高发的潜在风险。随着抗生素的广泛使用，H. pylori产生了多重耐药(multidrug resistance,MDR)，进而引起慢性胃病治疗失败及耐药菌株传播风险增加。幽门螺杆菌的多重耐药已成为胃肠疾病诊治的严峻挑战之一。本文结合相关文献和课题组的研究结果，综述了H. pylori多重耐药的全球发展趋势、发生机制、对临床诊断的挑战以及对药物研发的挑战，提出了依据H. pylori的cgt基因表达量测定活菌的新方法，胞内化是H. pylori耐药的新形式，O-聚糖抗H. pylori是应对多重耐药的防治新策略。本文为深入理解H. pylori多重耐药的机制及其防治策略提供了新的思路，有望为未来临床治疗和抗菌药物研发开辟新方向。
2025,41(4):1252-1267, DOI: 10.13345/j.cjb.240833
, CSTR: 32114.14j.cjb.240833
摘要：
含银敷料、镀银涂层等医疗耗材与器械在临床治疗中的广泛应用，以及畜牧业饲料中抗菌剂和重金属剂的大量使用，增加了致病以及环境大肠杆菌对银离子的获得性耐受。为系统性了解大肠杆菌银离子耐受性机制，本文综述了大肠杆菌银离子耐受的复杂调控网络和多种生理机制，即调节外膜孔蛋白、能量代谢调节、外排系统的作用、运动性调节以及银离子还原能力。大肠杆菌通过缺失或突变外膜孔蛋白如OmpR、OmpC、OmpF等来减少银离子的内流；在高浓度银离子胁迫下，通过内源性的Cus系统和外源性的Sil系统提高银离子的外排能力；通过调节ArcA/B蛋白的表达来适应更高浓度的银离子环境。细菌的运动性也与银的耐受能力相关。此外，大肠杆菌还具还原银离子的能力，可降低银离子诱导的氧化应激。本文为理解细菌银离子耐受性的形成和传播提供了新的视角，并对下一代银基抗菌药物和疗法开发进行了展望。
含银敷料、镀银涂层等医疗耗材与器械在临床治疗中的广泛应用，以及畜牧业饲料中抗菌剂和重金属剂的大量使用，增加了致病以及环境大肠杆菌对银离子的获得性耐受。为系统性了解大肠杆菌银离子耐受性机制，本文综述了大肠杆菌银离子耐受的复杂调控网络和多种生理机制，即调节外膜孔蛋白、能量代谢调节、外排系统的作用、运动性调节以及银离子还原能力。大肠杆菌通过缺失或突变外膜孔蛋白如OmpR、OmpC、OmpF等来减少银离子的内流；在高浓度银离子胁迫下，通过内源性的Cus系统和外源性的Sil系统提高银离子的外排能力；通过调节ArcA/B蛋白的表达来适应更高浓度的银离子环境。细菌的运动性也与银的耐受能力相关。此外，大肠杆菌还具还原银离子的能力，可降低银离子诱导的氧化应激。本文为理解细菌银离子耐受性的形成和传播提供了新的视角，并对下一代银基抗菌药物和疗法开发进行了展望。
2025,41(4):1268-1279, DOI: 10.13345/j.cjb.240425
, CSTR: 32114.14j.cjb.240425
摘要：
随着信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)技术的不断发展，mRNA药物在近些年展现出了广阔的应用前景。mRNA自身易被降解且难以直接入胞，因此mRNA递送载体一直是mRNA药物研发的重点之一。尽管脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)已经广泛应用于mRNA的递送，但LNP倾向于在肝脏聚集，并且重复给药后容易诱发机体炎症反应从而导致组织损伤。相比LNP，病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)具有生物相容性高、安全性高的优势，有望为mRNA递送提供新的解决思路。本文从实际应用需求出发，根据VLP实现mRNA递送的几个步骤，即颗粒组装、递送入胞和胞内释放，对该领域的研究进展进行综述，为开发新型VLP递送载体提供依据和设计思路，从而推动VLP载体在mRNA递送领域的发展，为mRNA疗法的研究和应用提供新的可能。
随着信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)技术的不断发展，mRNA药物在近些年展现出了广阔的应用前景。mRNA自身易被降解且难以直接入胞，因此mRNA递送载体一直是mRNA药物研发的重点之一。尽管脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)已经广泛应用于mRNA的递送，但LNP倾向于在肝脏聚集，并且重复给药后容易诱发机体炎症反应从而导致组织损伤。相比LNP，病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)具有生物相容性高、安全性高的优势，有望为mRNA递送提供新的解决思路。本文从实际应用需求出发，根据VLP实现mRNA递送的几个步骤，即颗粒组装、递送入胞和胞内释放，对该领域的研究进展进行综述，为开发新型VLP递送载体提供依据和设计思路，从而推动VLP载体在mRNA递送领域的发展，为mRNA疗法的研究和应用提供新的可能。
2025,41(4):1280-1290, DOI: 10.13345/j.cjb.240634
, CSTR: 32114.14j.cjb.240634
摘要：
DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)被认为是生物体内最为严重的一种DNA损伤形式，它不仅会导致基因组失去稳定性，还可能引发细胞死亡。同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)是2种主要的DNA双链断裂修复方法。参与NHEJ途径的核心成分在酵母和人中高度保守，部分细菌如分枝杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌，也具有NHEJ修复能力。NHEJ可能在分枝杆菌潜伏期的双链修复中发挥重要作用。本文对分枝杆菌中NHEJ的修复机制及其关键组分进行了系统综述，并探讨了其在基因编辑领域的应用前景，深入阐述了分枝杆菌NHEJ途径及其最新研究进展，为分枝杆菌NHEJ修复分子机制提供了新见解并为分枝杆菌NHEJ的应用提供了理论基础。
DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)被认为是生物体内最为严重的一种DNA损伤形式，它不仅会导致基因组失去稳定性，还可能引发细胞死亡。同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)是2种主要的DNA双链断裂修复方法。参与NHEJ途径的核心成分在酵母和人中高度保守，部分细菌如分枝杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌，也具有NHEJ修复能力。NHEJ可能在分枝杆菌潜伏期的双链修复中发挥重要作用。本文对分枝杆菌中NHEJ的修复机制及其关键组分进行了系统综述，并探讨了其在基因编辑领域的应用前景，深入阐述了分枝杆菌NHEJ途径及其最新研究进展，为分枝杆菌NHEJ修复分子机制提供了新见解并为分枝杆菌NHEJ的应用提供了理论基础。
2025,41(4):1291-1308, DOI: 10.13345/j.cjb.240815
, CSTR: 32114.14j.cjb.240815
摘要：
生长因子是一类通过与特定的细胞膜受体结合、促进细胞生长的多肽类物质。生长因子具有的独特性质使其广泛用于受损组织的再生修复。为了克服天然提取生长因子以及重组生长因子存在的问题，研究人员开发出多种类型的生长因子模拟物。本文对常见类型的生长因子及其在组织损伤修复中的应用以及目前开发的不同类型的生长因子模拟物的特点进行综述，为推动生长因子在再生医学领域中的应用提供了参考。
生长因子是一类通过与特定的细胞膜受体结合、促进细胞生长的多肽类物质。生长因子具有的独特性质使其广泛用于受损组织的再生修复。为了克服天然提取生长因子以及重组生长因子存在的问题，研究人员开发出多种类型的生长因子模拟物。本文对常见类型的生长因子及其在组织损伤修复中的应用以及目前开发的不同类型的生长因子模拟物的特点进行综述，为推动生长因子在再生医学领域中的应用提供了参考。
2025,41(4):1309-1322, DOI: 10.13345/j.cjb.240702
, CSTR: 32114.14j.cjb.240702
摘要：
硅基微环谐振器(silicon-based microring resonator,SMRR)作为光学生物传感器中的无标签检测典型应用，具备小尺寸、高灵敏度、易集成等优势，适用于物理、化学及生物信号的检测。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病，隐匿性高，而早期干预可以有效缓解AD进程。针对AD的早期诊断，基于SMRR的光学检测平台能有效克服血液筛查中的低丰度标志物和干扰因素问题，展现出超灵敏、低假阳性的检测应用潜力。但目前SMRR在AD检测上的临床应用受限，主要因其存在优化设计差异大、缺乏商用成品芯片、统一检测平台及高成本等问题。同时，AD早期诊断生物标志物存在争议，限制了其辅助诊断作用。本文综述了SMRR的传感原理，总结了其在生物医学领域的研究进展，并以AD为研究对象，探讨了基于SMRR的检测技术主要的应用局限及其在AD早期诊断领域的临床应用潜力。未来，硅基微环谐振器技术的标准化、集成性和普适性可能成为主要的发展方向，本文可为开发成熟的商用检测仪器提供参考，推动其在临床诊断领域的广泛应用。
硅基微环谐振器(silicon-based microring resonator,SMRR)作为光学生物传感器中的无标签检测典型应用，具备小尺寸、高灵敏度、易集成等优势，适用于物理、化学及生物信号的检测。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病，隐匿性高，而早期干预可以有效缓解AD进程。针对AD的早期诊断，基于SMRR的光学检测平台能有效克服血液筛查中的低丰度标志物和干扰因素问题，展现出超灵敏、低假阳性的检测应用潜力。但目前SMRR在AD检测上的临床应用受限，主要因其存在优化设计差异大、缺乏商用成品芯片、统一检测平台及高成本等问题。同时，AD早期诊断生物标志物存在争议，限制了其辅助诊断作用。本文综述了SMRR的传感原理，总结了其在生物医学领域的研究进展，并以AD为研究对象，探讨了基于SMRR的检测技术主要的应用局限及其在AD早期诊断领域的临床应用潜力。未来，硅基微环谐振器技术的标准化、集成性和普适性可能成为主要的发展方向，本文可为开发成熟的商用检测仪器提供参考，推动其在临床诊断领域的广泛应用。
2025,41(4):1323-1339, DOI: 10.13345/j.cjb.240737
, CSTR: 32114.14j.cjb.240737
摘要：
汞污染土壤对环境和人类健康构成了重大威胁。抗汞微生物具备在无机汞和有机汞胁迫条件下存活的能力，并能有效减少汞的含量和毒性。相比传统的物理和化学修复方法，微生物修复技术因其成本低、效果显著且对环境影响较小，近年来备受关注。本文系统阐述了微生物抗汞的分子机制，重点探讨了其在与植物互作联合修复汞污染土壤中的应用潜力，并揭示了微生物在促进转基因植物修复汞污染中的关键作用，为汞污染土壤的生物修复提供了理论基础和科学依据。
汞污染土壤对环境和人类健康构成了重大威胁。抗汞微生物具备在无机汞和有机汞胁迫条件下存活的能力，并能有效减少汞的含量和毒性。相比传统的物理和化学修复方法，微生物修复技术因其成本低、效果显著且对环境影响较小，近年来备受关注。本文系统阐述了微生物抗汞的分子机制，重点探讨了其在与植物互作联合修复汞污染土壤中的应用潜力，并揭示了微生物在促进转基因植物修复汞污染中的关键作用，为汞污染土壤的生物修复提供了理论基础和科学依据。
2025,41(4):1340-1353, DOI: 10.13345/j.cjb.240600
, CSTR: 32114.14j.cjb.240600
摘要：
发展高效安全的递送载体是提高siRNA药物体内稳定性、推进siRNA药物的临床应用的关键。壳聚糖(chitosan,CS)是一类天然阳离子聚合物，在核酸药物的递送中具有巨大的应用前景。为了优化CS/siRNA纳米粒子(nanoparticles,NPs)的物理化学性质，提高其siRNA递送效率，本研究在CS中加入透明质酸(hyaluronic acid,HA)，通过静电作用形成稳定的复合物纳米粒子，同时利用HA对肿瘤细胞表面CD44的靶向作用，实现siRNA的高效递送。首先，系统探究了CS和HA的分子量和质量比对CS/HA NPs的物理化学性质的影响。结果显示，混合体系在HA:CS的质量比为5:5和6:4左右可以形成粒径较小、粒径分布较窄且存储稳定性较高的复合物纳米粒子。在其他条件相同的情况下，CS/HA NPs的尺寸随着CS和HA分子量的提高而增大。在此基础上，选择合适的条件制备CS/HA NPs用于siRNA的递送。细胞实验结果显示，通过引入HA可以有效降低CS递送体系的细胞毒性，提高了纳米粒子的细胞摄取，相关CS/HA/siRNA NPs可以沉默HeLa-Luc细胞中50%–60%荧光素酶基因。与纯CS相比，CS/HA NPs可以与siRNA形成更小的纳米粒子，并由HA介导与肿瘤细胞的特异性相互作用，从而实现siRNA的高效递送。研究结果为天然高分子复合物纳米粒子的构建及siRNA递送提供了有益的参考。
发展高效安全的递送载体是提高siRNA药物体内稳定性、推进siRNA药物的临床应用的关键。壳聚糖(chitosan,CS)是一类天然阳离子聚合物，在核酸药物的递送中具有巨大的应用前景。为了优化CS/siRNA纳米粒子(nanoparticles,NPs)的物理化学性质，提高其siRNA递送效率，本研究在CS中加入透明质酸(hyaluronic acid,HA)，通过静电作用形成稳定的复合物纳米粒子，同时利用HA对肿瘤细胞表面CD44的靶向作用，实现siRNA的高效递送。首先，系统探究了CS和HA的分子量和质量比对CS/HA NPs的物理化学性质的影响。结果显示，混合体系在HA:CS的质量比为5:5和6:4左右可以形成粒径较小、粒径分布较窄且存储稳定性较高的复合物纳米粒子。在其他条件相同的情况下，CS/HA NPs的尺寸随着CS和HA分子量的提高而增大。在此基础上，选择合适的条件制备CS/HA NPs用于siRNA的递送。细胞实验结果显示，通过引入HA可以有效降低CS递送体系的细胞毒性，提高了纳米粒子的细胞摄取，相关CS/HA/siRNA NPs可以沉默HeLa-Luc细胞中50%–60%荧光素酶基因。与纯CS相比，CS/HA NPs可以与siRNA形成更小的纳米粒子，并由HA介导与肿瘤细胞的特异性相互作用，从而实现siRNA的高效递送。研究结果为天然高分子复合物纳米粒子的构建及siRNA递送提供了有益的参考。
2025,41(4):1354-1371, DOI: 10.13345/j.cjb.240556
, CSTR: 32114.14j.cjb.240556
摘要：
为研究以Ⅱ型单纯疱疹病毒gD胞外域(ectodomain)为免疫原的circRNA疫苗诱导BALB/c小鼠出现的特异性免疫反应，并进行免疫研究评价，为单纯疱疹病毒mRNA疫苗的研发提供实验依据和技术参考，本研究通过PCR技术和同源重组技术，从pT7AMP-gD Ectodomain质粒中获得gD基因，将gD基因克隆至pUC57载体，获得重组pUC57-circ-gD质粒并进行测序鉴定。进行PCR获得后续实验模板DNA后，以单纯疱疹病毒囊膜糖蛋白gD Ectodomain为免疫原，并同时将模板DNA进行体外转录(in vitro transcription,IVT)及环化，将得到的pUC57-circ-gD mRNA进行RNase R酶酶切验证、反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)成环验证，以确定是否成环；转染293T细胞，72 h后收集细胞上清，进行蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)以鉴定蛋白表达；采用脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)对合成的mRNA以微流控包封法进行包封；包封后，将其应用于模型动物BALB/c小鼠中实验，在第21、35天于眼底静脉丛采血，第49天麻醉后摘除眼球采血，后续进行酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测，并对病毒中和抗体进行测定，在第49天取脾脏，后续通过固相酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot,ELISpot)检测细胞因子IFN-γ的分泌情况。结果表明成功构建了重组质粒，测序结果正确；RNase R酶切验证后证实了环状RNA的存在，mRNA转染293T细胞后Western blotting验证有清晰的特异性条带；对疫苗进行质量检测，通过尺寸排阻高效液相色谱法(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测到疫苗的纯度约为90%，测量mRNA-LNP的粒径为82.76 nm，包封率达到98%左右；小鼠进行3次免疫后，在观察期内小鼠体重的增加和良好的存活率证明了该疫苗的安全性；在免疫后的小鼠血清中，IgG抗体滴度增加；在脾脏细胞中，检测到分泌特异性IFN-γ的T细胞数量升高。后续ELISA、中和抗体检测、ELISpot实验及攻毒实验说明pUC57-circ-gD mRNA免疫原性及持久性良好，并且可以抵御病毒的攻击。本研究为circRNA疫苗相关研究提供了参考。
为研究以Ⅱ型单纯疱疹病毒gD胞外域(ectodomain)为免疫原的circRNA疫苗诱导BALB/c小鼠出现的特异性免疫反应，并进行免疫研究评价，为单纯疱疹病毒mRNA疫苗的研发提供实验依据和技术参考，本研究通过PCR技术和同源重组技术，从pT7AMP-gD Ectodomain质粒中获得gD基因，将gD基因克隆至pUC57载体，获得重组pUC57-circ-gD质粒并进行测序鉴定。进行PCR获得后续实验模板DNA后，以单纯疱疹病毒囊膜糖蛋白gD Ectodomain为免疫原，并同时将模板DNA进行体外转录(in vitro transcription,IVT)及环化，将得到的pUC57-circ-gD mRNA进行RNase R酶酶切验证、反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)成环验证，以确定是否成环；转染293T细胞，72 h后收集细胞上清，进行蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)以鉴定蛋白表达；采用脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)对合成的mRNA以微流控包封法进行包封；包封后，将其应用于模型动物BALB/c小鼠中实验，在第21、35天于眼底静脉丛采血，第49天麻醉后摘除眼球采血，后续进行酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测，并对病毒中和抗体进行测定，在第49天取脾脏，后续通过固相酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot,ELISpot)检测细胞因子IFN-γ的分泌情况。结果表明成功构建了重组质粒，测序结果正确；RNase R酶切验证后证实了环状RNA的存在，mRNA转染293T细胞后Western blotting验证有清晰的特异性条带；对疫苗进行质量检测，通过尺寸排阻高效液相色谱法(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测到疫苗的纯度约为90%，测量mRNA-LNP的粒径为82.76 nm，包封率达到98%左右；小鼠进行3次免疫后，在观察期内小鼠体重的增加和良好的存活率证明了该疫苗的安全性；在免疫后的小鼠血清中，IgG抗体滴度增加；在脾脏细胞中，检测到分泌特异性IFN-γ的T细胞数量升高。后续ELISA、中和抗体检测、ELISpot实验及攻毒实验说明pUC57-circ-gD mRNA免疫原性及持久性良好，并且可以抵御病毒的攻击。本研究为circRNA疫苗相关研究提供了参考。
2025,41(4):1372-1381, DOI: 10.13345/j.cjb.240764
, CSTR: 32114.14j.cjb.240764
摘要：
铁蛋白由于其靶向性、可逆性自组装、高生物相容性及易被修饰等优点，被认为是一种理想的递送系统。本研究旨在表达纯化3种融合铁蛋白，对其进行鉴定，并探究其肿瘤靶向性。合成3种融合铁蛋白基因并克隆至原核表达载体，使用镍柱进行亲和层析纯化重组蛋白，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)、Western blotting、圆二色谱对融合铁蛋白进行鉴定。使用异硫氰酸荧光素酯(fluorescein 5-isothiocyanate,FITC)与融合铁蛋白进行反应，利用激光共聚焦扫描显微镜进行体外肿瘤细胞靶向。同时将荧光染料胺活性琥珀酰亚胺酯(sulfo-cyanine7,Cy7-SE)与融合铁蛋白进行反应尾静脉注射入黑色素瘤小鼠进行体内肿瘤成像，探究融合铁蛋白的肿瘤靶向性。结果显示，本研究构建的融合铁蛋白使用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside,IPTG)进行诱导表达可获得约21 kDa的可溶性融合铁蛋白，通过镍柱进行亲和层析纯化获得纯度较高的融合铁蛋白。Western blotting检测重组蛋白能被相应抗体识别。Native-PAGE、圆二色谱鉴定目的蛋白为具有α螺旋的多聚体。通过体内外肿瘤摄取实验，证明了融合铁蛋白能够被肿瘤细胞和肿瘤组织摄取。本研究成功表达纯化融合铁蛋白并进行鉴定，验证了其在体内外的肿瘤摄取情况，为铁蛋白在生物医药领域的应用奠定了基础。
铁蛋白由于其靶向性、可逆性自组装、高生物相容性及易被修饰等优点，被认为是一种理想的递送系统。本研究旨在表达纯化3种融合铁蛋白，对其进行鉴定，并探究其肿瘤靶向性。合成3种融合铁蛋白基因并克隆至原核表达载体，使用镍柱进行亲和层析纯化重组蛋白，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)、Western blotting、圆二色谱对融合铁蛋白进行鉴定。使用异硫氰酸荧光素酯(fluorescein 5-isothiocyanate,FITC)与融合铁蛋白进行反应，利用激光共聚焦扫描显微镜进行体外肿瘤细胞靶向。同时将荧光染料胺活性琥珀酰亚胺酯(sulfo-cyanine7,Cy7-SE)与融合铁蛋白进行反应尾静脉注射入黑色素瘤小鼠进行体内肿瘤成像，探究融合铁蛋白的肿瘤靶向性。结果显示，本研究构建的融合铁蛋白使用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside,IPTG)进行诱导表达可获得约21 kDa的可溶性融合铁蛋白，通过镍柱进行亲和层析纯化获得纯度较高的融合铁蛋白。Western blotting检测重组蛋白能被相应抗体识别。Native-PAGE、圆二色谱鉴定目的蛋白为具有α螺旋的多聚体。通过体内外肿瘤摄取实验，证明了融合铁蛋白能够被肿瘤细胞和肿瘤组织摄取。本研究成功表达纯化融合铁蛋白并进行鉴定，验证了其在体内外的肿瘤摄取情况，为铁蛋白在生物医药领域的应用奠定了基础。
2025,41(4):1382-1394, DOI: 10.13345/j.cjb.240976
, CSTR: 32114.14j.cjb.240976
摘要：
传统肿瘤治疗，如放疗和化疗，常损伤正常细胞，可能引发新肿瘤。与之相比，溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)则能选择性攻击肿瘤细胞，减少对正常细胞的影响。多数临床试验中的溶瘤病毒经过基因改造，以增强其靶向肿瘤细胞和激活免疫反应的能力。为了开发特异治疗宫颈癌的溶瘤腺病毒，本研究构建了特异性治疗宫颈癌的溶瘤腺病毒，该病毒通过递送靶向原癌基因的碱基编辑器实现肿瘤细胞的高效杀伤，即通过抑制肿瘤生长和直接裂解肿瘤来高效杀伤癌细胞。本研究利用人端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)启动子启动病毒早期复制蛋白(early region 1A,E1A)，成功构建了P-hTERT-E1A-GFP载体，并验证了其在宫颈癌细胞中的启动活性。鉴于MYC原癌基因在肿瘤学研究中的重要作用，筛选高效MYC原癌基因编辑位点是本研究的关键步骤。针对MYC基因设计3个gRNA靶点，将其与ABE8e碱基编辑器质粒共转染至HEK293T细胞，经嘌呤霉素筛选后，Sanger测序分析显示各靶点编辑效率分别为43%(MYC-1)、25%(MYC-2)和35%(MYC-3)，明确MYC-1为最优编辑位点。通过构建P-ABEs-hTERT-E1A-GFP和P-MYC gRNA-hTERT-E1A-GFP载体，成功进行了病毒包装并验证了其特异性和有效性。实验结果表明，这种新型溶瘤腺病毒能有效抑制体外培养的HeLa宫颈癌细胞的生长。本研究基于HeLa细胞模型，为宫颈癌治疗提供了新的实验依据和潜在策略。
传统肿瘤治疗，如放疗和化疗，常损伤正常细胞，可能引发新肿瘤。与之相比，溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)则能选择性攻击肿瘤细胞，减少对正常细胞的影响。多数临床试验中的溶瘤病毒经过基因改造，以增强其靶向肿瘤细胞和激活免疫反应的能力。为了开发特异治疗宫颈癌的溶瘤腺病毒，本研究构建了特异性治疗宫颈癌的溶瘤腺病毒，该病毒通过递送靶向原癌基因的碱基编辑器实现肿瘤细胞的高效杀伤，即通过抑制肿瘤生长和直接裂解肿瘤来高效杀伤癌细胞。本研究利用人端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)启动子启动病毒早期复制蛋白(early region 1A,E1A)，成功构建了P-hTERT-E1A-GFP载体，并验证了其在宫颈癌细胞中的启动活性。鉴于MYC原癌基因在肿瘤学研究中的重要作用，筛选高效MYC原癌基因编辑位点是本研究的关键步骤。针对MYC基因设计3个gRNA靶点，将其与ABE8e碱基编辑器质粒共转染至HEK293T细胞，经嘌呤霉素筛选后，Sanger测序分析显示各靶点编辑效率分别为43%(MYC-1)、25%(MYC-2)和35%(MYC-3)，明确MYC-1为最优编辑位点。通过构建P-ABEs-hTERT-E1A-GFP和P-MYC gRNA-hTERT-E1A-GFP载体，成功进行了病毒包装并验证了其特异性和有效性。实验结果表明，这种新型溶瘤腺病毒能有效抑制体外培养的HeLa宫颈癌细胞的生长。本研究基于HeLa细胞模型，为宫颈癌治疗提供了新的实验依据和潜在策略。
2025,41(4):1395-1414, DOI: 10.13345/j.cjb.240690
, CSTR: 32114.14j.cjb.240690
摘要：
为了通过包封柯萨奇病毒A21型(Coxsackievirus A21,CVA21)病毒全基因组mRNA制备溶瘤纳米颗粒CVA21(CVA21@ONP)，探究其复活CVA21病毒诱导宿主细胞凋亡的能力以及其在免疫正常的BALB/c荷瘤小鼠中的抗肿瘤免疫效应，本研究采用脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)包封CVA21病毒全基因组mRNA制备CVA21@ONP，通过空斑实验和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)确定杀伤效果，通过流式细胞术检测HT29、CT26-iRFP细胞凋亡情况。小鼠经瘤内给药CVA21@ONP，检测近红外荧光蛋白(infra-red fluorescent protein,iRFP)表达的肿瘤生长状况，流式细胞术检测脾脏中免疫细胞的种类与变化。结果表明CVA21@ONP能在HT29与U87MG细胞中成功组装CVA21病毒。空斑实验显示CVA21@ONP对人源和鼠源细胞均具有良好的杀伤效果，流式检测结果显示实验组凋亡细胞显著增加，瘤内检测到CVA21@ONP组iRFP蛋白表达量显著下降。通过流式检测发现CVA21@ONP治疗有效降低了脾脏中包括髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)和调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)在内的免疫抑制细胞的水平，同时增强了T细胞依赖性的抗肿瘤免疫效应。本研究经瘤内给药验证了CVA21@ONP的溶瘤性能，可进一步挖掘其治疗潜力并推动肿瘤治疗领域的发展。
为了通过包封柯萨奇病毒A21型(Coxsackievirus A21,CVA21)病毒全基因组mRNA制备溶瘤纳米颗粒CVA21(CVA21@ONP)，探究其复活CVA21病毒诱导宿主细胞凋亡的能力以及其在免疫正常的BALB/c荷瘤小鼠中的抗肿瘤免疫效应，本研究采用脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)包封CVA21病毒全基因组mRNA制备CVA21@ONP，通过空斑实验和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)确定杀伤效果，通过流式细胞术检测HT29、CT26-iRFP细胞凋亡情况。小鼠经瘤内给药CVA21@ONP，检测近红外荧光蛋白(infra-red fluorescent protein,iRFP)表达的肿瘤生长状况，流式细胞术检测脾脏中免疫细胞的种类与变化。结果表明CVA21@ONP能在HT29与U87MG细胞中成功组装CVA21病毒。空斑实验显示CVA21@ONP对人源和鼠源细胞均具有良好的杀伤效果，流式检测结果显示实验组凋亡细胞显著增加，瘤内检测到CVA21@ONP组iRFP蛋白表达量显著下降。通过流式检测发现CVA21@ONP治疗有效降低了脾脏中包括髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)和调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)在内的免疫抑制细胞的水平，同时增强了T细胞依赖性的抗肿瘤免疫效应。本研究经瘤内给药验证了CVA21@ONP的溶瘤性能，可进一步挖掘其治疗潜力并推动肿瘤治疗领域的发展。
2025,41(4):1415-1427, DOI: 10.13345/j.cjb.240597
, CSTR: 32114.14j.cjb.240597
摘要：
为提高本课题组前期筛选得到的一株肠道益生菌——乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) HRQ-1的胃肠液耐受能力、运输储存稳定性以及缓慢释放性能，本研究以乳酸片球菌为芯材，海藻酸钠和壳聚糖为壁材，采用挤压法制备乳酸片球菌微胶囊。通过单因素和正交试验确定乳酸片球菌微胶囊的最佳制备工艺条件，并以包埋率、存活率、储存稳定性、肠胃液耐受性及释放速率为评定指标，对乳酸片球菌微胶囊最佳配比进行研究。结果表明，在乳酸片球菌微胶囊最佳包埋条件下，包埋率达到(89.60±0.02)%；在最佳的冻干保护剂配方条件下，冻干存活率达到(76.42±0.13)%，制得的微胶囊粒径平均值为(1.16±0.03) mm；通过连续胃肠液模拟实验证实乳酸片球菌微胶囊活菌数得到保证且可在肠液中缓慢释放，通过4℃与室温储存过程活菌数量变化曲线可知制备该微胶囊可实现菌株有效活菌数的保障。本研究中乳酸片球菌微胶囊的制备配方与工艺为活菌药物制备提供技了术支持。
为提高本课题组前期筛选得到的一株肠道益生菌——乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) HRQ-1的胃肠液耐受能力、运输储存稳定性以及缓慢释放性能，本研究以乳酸片球菌为芯材，海藻酸钠和壳聚糖为壁材，采用挤压法制备乳酸片球菌微胶囊。通过单因素和正交试验确定乳酸片球菌微胶囊的最佳制备工艺条件，并以包埋率、存活率、储存稳定性、肠胃液耐受性及释放速率为评定指标，对乳酸片球菌微胶囊最佳配比进行研究。结果表明，在乳酸片球菌微胶囊最佳包埋条件下，包埋率达到(89.60±0.02)%；在最佳的冻干保护剂配方条件下，冻干存活率达到(76.42±0.13)%，制得的微胶囊粒径平均值为(1.16±0.03) mm；通过连续胃肠液模拟实验证实乳酸片球菌微胶囊活菌数得到保证且可在肠液中缓慢释放，通过4℃与室温储存过程活菌数量变化曲线可知制备该微胶囊可实现菌株有效活菌数的保障。本研究中乳酸片球菌微胶囊的制备配方与工艺为活菌药物制备提供技了术支持。
2025,41(4):1428-1439, DOI: 10.13345/j.cjb.250006
, CSTR: 32114.14j.cjb.250006
摘要：
内毒素是常见外致热原，内毒素超标会导致脓毒血症、感染性休克甚至死亡等严重后果，因此其检测在医疗、制药和食品领域至关重要。鲎试剂检测法的广泛应用导致鲎数量急剧下降，且该方法存在批间差异和难以定量等限制。重组C因子检测法批次间稳定、灵敏度高且可定量，可代替鲎试剂，但高成本和复杂操作限制了该方法的推广。为简化制备重组C因子的步骤，同时降低重组C因子的生产成本，本研究利用高产抗凋亡载体qBac-IIIG、优选信号肽和优化密码子的策略，使用杆状病毒蛋白表达系统制备重组C因子，分泌至细胞培养上清液中的重组C因子无需纯化，可直接用细胞培养上清液检测内毒素。表达重组C因子的1 L发酵体系中发酵液的内毒素检测灵敏度可达到0.05 EU/mL，每L发酵液可以支持50万个检测反应。本研究提高了重组C因子的产量和活性，节省了蛋白纯化步骤，降低了生产成本，为重组C因子内毒素检测法的推广应用奠定基础。
内毒素是常见外致热原，内毒素超标会导致脓毒血症、感染性休克甚至死亡等严重后果，因此其检测在医疗、制药和食品领域至关重要。鲎试剂检测法的广泛应用导致鲎数量急剧下降，且该方法存在批间差异和难以定量等限制。重组C因子检测法批次间稳定、灵敏度高且可定量，可代替鲎试剂，但高成本和复杂操作限制了该方法的推广。为简化制备重组C因子的步骤，同时降低重组C因子的生产成本，本研究利用高产抗凋亡载体qBac-IIIG、优选信号肽和优化密码子的策略，使用杆状病毒蛋白表达系统制备重组C因子，分泌至细胞培养上清液中的重组C因子无需纯化，可直接用细胞培养上清液检测内毒素。表达重组C因子的1 L发酵体系中发酵液的内毒素检测灵敏度可达到0.05 EU/mL，每L发酵液可以支持50万个检测反应。本研究提高了重组C因子的产量和活性，节省了蛋白纯化步骤，降低了生产成本，为重组C因子内毒素检测法的推广应用奠定基础。
2025,41(4):1440-1454, DOI: 10.13345/j.cjb.240581
, CSTR: 32114.14j.cjb.240581
摘要：
为了制备能够特异性识别CD63蛋白胞外大环中保守结构域的抗体，本研究利用毕赤酵母分泌表达CD63单链抗体(single chain variable fragment,scFv)，纯化后得到能特异性结合CD63蛋白以及SK-MEL-28细胞表面CD63分子的CD63 scFv。对筛选得到的CD63单克隆抗体细胞株进行可变区测序得到重链可变区(variable heavy chain,VH)与轻链可变区(variable light chain,VL)，经柔性肽连接构成scFv，通过密码子优化后全基因合成CD63 scFv序列并克隆至毕赤酵母表达质粒pPICZα-A，质粒经Sac I线性化后电转到毕赤酵母X33，1%甲醇诱导表达scFv，发酵上清通过Ni柱纯化，并用SDS-PAGE和Western blotting进行了鉴定。通过免疫印迹、免疫荧光、基于细胞的酶联免疫吸附实验、流式细胞术对CD63 scFv的生物活性进行鉴定。本研究成功构建了能够分泌表达抗CD63 scFv的毕赤酵母菌株，抗体分子量约为30 kDa，能与CD63蛋白特异性结合。抗CD63 scFv在毕赤酵母中的表达是一种经济有效的抗体获取方法，为大规模生产抗CD63抗体奠定了基础。
为了制备能够特异性识别CD63蛋白胞外大环中保守结构域的抗体，本研究利用毕赤酵母分泌表达CD63单链抗体(single chain variable fragment,scFv)，纯化后得到能特异性结合CD63蛋白以及SK-MEL-28细胞表面CD63分子的CD63 scFv。对筛选得到的CD63单克隆抗体细胞株进行可变区测序得到重链可变区(variable heavy chain,VH)与轻链可变区(variable light chain,VL)，经柔性肽连接构成scFv，通过密码子优化后全基因合成CD63 scFv序列并克隆至毕赤酵母表达质粒pPICZα-A，质粒经Sac I线性化后电转到毕赤酵母X33，1%甲醇诱导表达scFv，发酵上清通过Ni柱纯化，并用SDS-PAGE和Western blotting进行了鉴定。通过免疫印迹、免疫荧光、基于细胞的酶联免疫吸附实验、流式细胞术对CD63 scFv的生物活性进行鉴定。本研究成功构建了能够分泌表达抗CD63 scFv的毕赤酵母菌株，抗体分子量约为30 kDa，能与CD63蛋白特异性结合。抗CD63 scFv在毕赤酵母中的表达是一种经济有效的抗体获取方法，为大规模生产抗CD63抗体奠定了基础。
2025,41(4):1455-1466, DOI: 10.13345/j.cjb.240630
, CSTR: 32114.14j.cjb.240630
摘要：
棘白菌素B (echinocandin B,ECB)是第三代棘白菌素类抗真菌药物阿尼芬净的关键前体，是由构巢曲霉菌株发酵得到的次级代谢产物，其发酵效价受ECB合成通路及细胞形态的显著影响。本研究旨在通过对ECB生物合成过程中与转录激活、羟基化、细胞形态等相关的关键基因进行改造，以提高ECB的发酵效价，同时改变构巢曲霉细胞形态以降低发酵液黏稠度。结果表明过表达ecdB和ecdK基因使ECB发酵产量分别比野生菌株提高了25.8%和23.7%，达到(2 030.5±99.2) mg/L和(1 996.4±151.4) mg/L。但与细胞壁合成相关的fksA基因的缺失导致其细胞壁受损，影响了菌株生长和产物合成。对过表达ecdB的工程菌株进行50 L罐分批补料发酵调控，ECB发酵效价达到2 234.5 mg/L。本研究为后续菌株的代谢工程改造奠定了基础。
棘白菌素B (echinocandin B,ECB)是第三代棘白菌素类抗真菌药物阿尼芬净的关键前体，是由构巢曲霉菌株发酵得到的次级代谢产物，其发酵效价受ECB合成通路及细胞形态的显著影响。本研究旨在通过对ECB生物合成过程中与转录激活、羟基化、细胞形态等相关的关键基因进行改造，以提高ECB的发酵效价，同时改变构巢曲霉细胞形态以降低发酵液黏稠度。结果表明过表达ecdB和ecdK基因使ECB发酵产量分别比野生菌株提高了25.8%和23.7%，达到(2 030.5±99.2) mg/L和(1 996.4±151.4) mg/L。但与细胞壁合成相关的fksA基因的缺失导致其细胞壁受损，影响了菌株生长和产物合成。对过表达ecdB的工程菌株进行50 L罐分批补料发酵调控，ECB发酵效价达到2 234.5 mg/L。本研究为后续菌株的代谢工程改造奠定了基础。
2025,41(4):1467-1477, DOI: 10.13345/j.cjb.240636
, CSTR: 32114.14j.cjb.240636
摘要：
CD20是B细胞淋巴瘤表面标志蛋白，其膜外区是特异性抗体和药物的作用靶点。为了获得靶向CD20的特异性适配体，首先根据密码子简并性对CD20胞外区基因进行优化，使之易于在大肠杆菌中表达；然后将优化后的基因克隆到pGEX-4T-1载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达；蛋白纯化后用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定；通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选出与融合蛋白特异性结合的ssDNA适配体，并用流式细胞术检测适配体与CD20的亲和力；再通过细胞毒性试验检测适配体抑制B淋巴瘤细胞的效果。本研究建立了CD20的原核表达方法，获得了特异性结合CD20胞外区蛋白的适配体，为靶向CD20的治疗药物的开发奠定了基础。
CD20是B细胞淋巴瘤表面标志蛋白，其膜外区是特异性抗体和药物的作用靶点。为了获得靶向CD20的特异性适配体，首先根据密码子简并性对CD20胞外区基因进行优化，使之易于在大肠杆菌中表达；然后将优化后的基因克隆到pGEX-4T-1载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达；蛋白纯化后用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定；通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选出与融合蛋白特异性结合的ssDNA适配体，并用流式细胞术检测适配体与CD20的亲和力；再通过细胞毒性试验检测适配体抑制B淋巴瘤细胞的效果。本研究建立了CD20的原核表达方法，获得了特异性结合CD20胞外区蛋白的适配体，为靶向CD20的治疗药物的开发奠定了基础。
2025,41(4):1478-1489, DOI: 10.13345/j.cjb.240431
, CSTR: 32114.14j.cjb.240431
摘要：
青少年(adolescents and young adults,AYA)是结核病的主要患病群体之一。为了研究针对这个群体的独特性诊断标志物，本研究招募了81名AYA受试者，通过定量蛋白质组学的方法，绘制了AYA结核病患者高质量的血清蛋白质图谱。血清蛋白组数据表明，活动性肺结核(active tuberculosis,ATB)患者中血红蛋白和载脂蛋白相对丰度显著降低。通路富集分析表明，ATB组下调蛋白显著富集于抗氧化、细胞脱毒相关通路，表明存在广泛的氧化应激损伤。通过随机森林(random forest,RF)和极致梯度提升(extreme gradient boosting,XGBoost)联合评估蛋白重要性，获得了一组区分ATB和非ATB的候选蛋白标志物。基于特征递归消除的支持向量机算法，发现载脂蛋白A1(apolipoprotein A-I,APOA1)、血红蛋白亚基α(hemoglobin subunit alpha-1,HBA1)、血红蛋白亚基β(hemoglobin subunit beta,HBB)这3个蛋白的组合在诊断ATB过程中具有最高的准确性和敏感性。临床生化常规检测的血红蛋白(hemoglobin,HGB)和白蛋白(albumin,ALB)含量可以作为评估APOA1、HBB蛋白表达变化的血液生化指标。本研究建立了AYA结核病患者的血清蛋白组全貌，获得了该类群结核病的新诊断标志物。
青少年(adolescents and young adults,AYA)是结核病的主要患病群体之一。为了研究针对这个群体的独特性诊断标志物，本研究招募了81名AYA受试者，通过定量蛋白质组学的方法，绘制了AYA结核病患者高质量的血清蛋白质图谱。血清蛋白组数据表明，活动性肺结核(active tuberculosis,ATB)患者中血红蛋白和载脂蛋白相对丰度显著降低。通路富集分析表明，ATB组下调蛋白显著富集于抗氧化、细胞脱毒相关通路，表明存在广泛的氧化应激损伤。通过随机森林(random forest,RF)和极致梯度提升(extreme gradient boosting,XGBoost)联合评估蛋白重要性，获得了一组区分ATB和非ATB的候选蛋白标志物。基于特征递归消除的支持向量机算法，发现载脂蛋白A1(apolipoprotein A-I,APOA1)、血红蛋白亚基α(hemoglobin subunit alpha-1,HBA1)、血红蛋白亚基β(hemoglobin subunit beta,HBB)这3个蛋白的组合在诊断ATB过程中具有最高的准确性和敏感性。临床生化常规检测的血红蛋白(hemoglobin,HGB)和白蛋白(albumin,ALB)含量可以作为评估APOA1、HBB蛋白表达变化的血液生化指标。本研究建立了AYA结核病患者的血清蛋白组全貌，获得了该类群结核病的新诊断标志物。
2025,41(4):1490-1499, DOI: 10.13345/j.cjb.240601
, CSTR: 32114.14j.cjb.240601
摘要：
Split-Cre系统是指被拆分为无活性的N端和C端这2个片段的Cre酶在一定条件下重组为有酶活性的全长Cre的基因工程工具。该系统常结合LoxP元件使用，近年来在多基因操纵、多基因活性标记以及神经环路示踪等方面有着重要的应用。为了开发更高效的Split-Cre系统，本研究利用海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus,Rma)内含肽对Cre进行拆分，在“红绿灯”报告细胞系中筛选出了能够高效介导Cre酶重组的S102拆分位点，并且通过双腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将S102 Split-Cre系统递送至小鼠体内，证明了Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在小鼠体内同样具有高效的活性。本研究为Split-Cre的基础和应用研究提供了可靠的参考。
Split-Cre系统是指被拆分为无活性的N端和C端这2个片段的Cre酶在一定条件下重组为有酶活性的全长Cre的基因工程工具。该系统常结合LoxP元件使用，近年来在多基因操纵、多基因活性标记以及神经环路示踪等方面有着重要的应用。为了开发更高效的Split-Cre系统，本研究利用海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus,Rma)内含肽对Cre进行拆分，在“红绿灯”报告细胞系中筛选出了能够高效介导Cre酶重组的S102拆分位点，并且通过双腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将S102 Split-Cre系统递送至小鼠体内，证明了Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在小鼠体内同样具有高效的活性。本研究为Split-Cre的基础和应用研究提供了可靠的参考。
2025,41(4):1500-1514, DOI: 10.13345/j.cjb.240940
, CSTR: 32114.14j.cjb.240940
摘要：
本研究旨在提供一种非动物源纳米抗体文库设计、合成及筛选方案，探索框架区的选择及互补决定区(complementarity determining region,CDR)的设计对于合成纳米抗体文库的影响，为增加合成纳米抗体文库的有效性、多样性及实用性奠定理论和技术基础。本研究基于天然纳米抗体的高通量测序结果，确定了1个新的框架(IGHV3S65*01-IGHJ4*01)，依据CDR中每个位置氨基酸的出现频率，分别设计简并引物，通过重叠延伸PCR (overlap PCR)合成纳米抗体编码片段。经过40次电转化，获得了包含6×109个克隆的全合成纳米抗体文库(single-frame synthesized nanobody library,SS-Library)，经辅助噬菌体M13K07救援后，展示文库滴度为1013 PFU/mL。随机挑取48个单菌落进行菌落PCR验证，插入率达95.8%，Sanger测序结果显示38个克隆序列完整，均未见半胱氨酸以及终止密码子，且未出现完全相同的序列，提示文库多样性良好。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)、小鼠IgG (immunoglobulin G,IgG)为靶标，对文库进行筛选验证，分别获得了2种针对BSA、10种针对AchE以及15种针对IgG的纳米抗体。每种抗原分别挑取了1个阳性克隆进行重组表达，结果表明3种纳米抗体均为可溶性表达。采用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和生物膜干涉技术(bio-layer interferometry,BLI)对重组表达纳米抗体结合活性进行了测定，结果表明，抗AchE和IgG的纳米抗体可以特异性结合相应抗原，亲和力常数分别为294 nmol/L和250 nmol/L。本研究提出的纳米抗体合成文库制备方法简单易行、偏好性低，有望成为一种通用的纳米抗体发现平台，用于先导特异性纳米抗体的制备与开发。
本研究旨在提供一种非动物源纳米抗体文库设计、合成及筛选方案，探索框架区的选择及互补决定区(complementarity determining region,CDR)的设计对于合成纳米抗体文库的影响，为增加合成纳米抗体文库的有效性、多样性及实用性奠定理论和技术基础。本研究基于天然纳米抗体的高通量测序结果，确定了1个新的框架(IGHV3S65*01-IGHJ4*01)，依据CDR中每个位置氨基酸的出现频率，分别设计简并引物，通过重叠延伸PCR (overlap PCR)合成纳米抗体编码片段。经过40次电转化，获得了包含6×109个克隆的全合成纳米抗体文库(single-frame synthesized nanobody library,SS-Library)，经辅助噬菌体M13K07救援后，展示文库滴度为1013 PFU/mL。随机挑取48个单菌落进行菌落PCR验证，插入率达95.8%，Sanger测序结果显示38个克隆序列完整，均未见半胱氨酸以及终止密码子，且未出现完全相同的序列，提示文库多样性良好。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)、小鼠IgG (immunoglobulin G,IgG)为靶标，对文库进行筛选验证，分别获得了2种针对BSA、10种针对AchE以及15种针对IgG的纳米抗体。每种抗原分别挑取了1个阳性克隆进行重组表达，结果表明3种纳米抗体均为可溶性表达。采用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和生物膜干涉技术(bio-layer interferometry,BLI)对重组表达纳米抗体结合活性进行了测定，结果表明，抗AchE和IgG的纳米抗体可以特异性结合相应抗原，亲和力常数分别为294 nmol/L和250 nmol/L。本研究提出的纳米抗体合成文库制备方法简单易行、偏好性低，有望成为一种通用的纳米抗体发现平台，用于先导特异性纳米抗体的制备与开发。
2025,41(4):1515-1534, DOI: 10.13345/j.cjb.240777
, CSTR: 32114.14j.cjb.240777
摘要：
血红蛋白是红细胞内的主要蛋白质，负责在血液中运输氧气。从贫血的诊断到血液疾病的筛查，血红蛋白浓度的测定在医疗诊断和健康管理中发挥着不可替代的作用。基于抗原-抗体相互作用的免疫学检测方法具有高灵敏度和准确性。为了开发具有高特异性和高亲和力的抗体，提高血红蛋白检测的准确性，本研究将人血红蛋白免疫双峰驼并构建噬菌体展示纳米抗体文库，应用固相筛选法进行抗体筛选，并探明筛选得到的纳米抗体与血红蛋白的结合活性。首先，将人血红蛋白免疫双峰驼，并构建了库容量为2.85×108菌落形成单位(colony forming unit,CFU)的纳米抗体文库。其次，经过3轮“吸附-洗脱-富集”实验淘选，得到10条血红蛋白特异性纳米抗体序列，并对其进行真核表达。最后，使用酶联免疫吸附实验和生物膜干涉技术表征纳米抗体的理化稳定性、结合活性和特异性。结果表明，纳米抗体在20–40℃温度范围内具有较好的稳定性；当pH值为7.0时，纳米抗体结合活性最高；纳米抗体可耐受10%的甲醇溶液。其中，纳米抗体VHH-12与血红蛋白结合活性最高，其半数最大效应浓度值(half maximal effective concentration,EC50)为10.63 nmol/L，平衡解离常数(equilibrium dissociation constant,KD)为2.94×10–7 mol/L。VHH-12与卵清蛋白、牛血清蛋白等8种蛋白质均无交叉反应性，与猪、羊、兔、牛血红蛋白表现出一定的交叉反应性。本研究成功淘选出1条血红蛋白特异性高亲和力纳米抗体，有望应用于疾病诊断和健康监测。
血红蛋白是红细胞内的主要蛋白质，负责在血液中运输氧气。从贫血的诊断到血液疾病的筛查，血红蛋白浓度的测定在医疗诊断和健康管理中发挥着不可替代的作用。基于抗原-抗体相互作用的免疫学检测方法具有高灵敏度和准确性。为了开发具有高特异性和高亲和力的抗体，提高血红蛋白检测的准确性，本研究将人血红蛋白免疫双峰驼并构建噬菌体展示纳米抗体文库，应用固相筛选法进行抗体筛选，并探明筛选得到的纳米抗体与血红蛋白的结合活性。首先，将人血红蛋白免疫双峰驼，并构建了库容量为2.85×108菌落形成单位(colony forming unit,CFU)的纳米抗体文库。其次，经过3轮“吸附-洗脱-富集”实验淘选，得到10条血红蛋白特异性纳米抗体序列，并对其进行真核表达。最后，使用酶联免疫吸附实验和生物膜干涉技术表征纳米抗体的理化稳定性、结合活性和特异性。结果表明，纳米抗体在20–40℃温度范围内具有较好的稳定性；当pH值为7.0时，纳米抗体结合活性最高；纳米抗体可耐受10%的甲醇溶液。其中，纳米抗体VHH-12与血红蛋白结合活性最高，其半数最大效应浓度值(half maximal effective concentration,EC50)为10.63 nmol/L，平衡解离常数(equilibrium dissociation constant,KD)为2.94×10–7 mol/L。VHH-12与卵清蛋白、牛血清蛋白等8种蛋白质均无交叉反应性，与猪、羊、兔、牛血红蛋白表现出一定的交叉反应性。本研究成功淘选出1条血红蛋白特异性高亲和力纳米抗体，有望应用于疾病诊断和健康监测。
2025,41(4):1535-1546, DOI: 10.13345/j.cjb.240834
, CSTR: 32114.14j.cjb.240834
摘要：
作为最普遍的蛋白质糖基化修饰方式，N-糖基化起始于内质网中多萜醇寡糖(dolichol-linked oligosaccharide,DLO)前体的合成。甘露糖基转移酶Alg1催化添加DLO结构中的第1个甘露糖，是该生化途径中的关键酶。人体中ALG1基因的缺陷会导致先天性糖基化疾病(congenital disorders of glycosylation,CDG)。为了建立人源Alg1(Homo sapiens Alg1,HsAlg1)的体外表达和活性检测体系，本研究构建了全长的pET28a-His6-HsAlg1和截除跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)的pET28a-His6-HsAlg123−464这2种质粒并在大肠杆菌中表达，以多萜醇磷酸壳二糖(dolichyl-pyrophosphate GlcNAc2,DPGn2)为反应底物，采用液质联用的方法检测HsAlg1和HsAlg123−464重组蛋白的活性。结果显示，HsAlg1具有转糖基活性，蛋白纯化后活性降低，重新加入膜组分后得到部分回补，而HsAlg123−464不能催化转糖基反应。上述结果表明HsAlg1蛋白的N端TMD在催化反应中起到了重要的作用。本研究为后续表达并检测ALG1-CDG相关突变蛋白的活性奠定了基础。
作为最普遍的蛋白质糖基化修饰方式，N-糖基化起始于内质网中多萜醇寡糖(dolichol-linked oligosaccharide,DLO)前体的合成。甘露糖基转移酶Alg1催化添加DLO结构中的第1个甘露糖，是该生化途径中的关键酶。人体中ALG1基因的缺陷会导致先天性糖基化疾病(congenital disorders of glycosylation,CDG)。为了建立人源Alg1(Homo sapiens Alg1,HsAlg1)的体外表达和活性检测体系，本研究构建了全长的pET28a-His6-HsAlg1和截除跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)的pET28a-His6-HsAlg123−464这2种质粒并在大肠杆菌中表达，以多萜醇磷酸壳二糖(dolichyl-pyrophosphate GlcNAc2,DPGn2)为反应底物，采用液质联用的方法检测HsAlg1和HsAlg123−464重组蛋白的活性。结果显示，HsAlg1具有转糖基活性，蛋白纯化后活性降低，重新加入膜组分后得到部分回补，而HsAlg123−464不能催化转糖基反应。上述结果表明HsAlg1蛋白的N端TMD在催化反应中起到了重要的作用。本研究为后续表达并检测ALG1-CDG相关突变蛋白的活性奠定了基础。
2025,41(4):1547-1558, DOI: 10.13345/j.cjb.240767
, CSTR: 32114.14j.cjb.240767
摘要：
活性氧(reactive oxygen species,ROS)是放射治疗引发肿瘤患者副作用的重要介导因素之一。由谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)和跨膜肽构成的融合抗氧化酶可有效抵御ROS损伤。将2种抗氧化酶进一步与基质金属蛋白酶-2/9底物X肽及跨膜肽R9融合后，得到的融合抗氧化酶GST-SOD1-X-R9(GS1XR)跨膜进入肿瘤细胞的能力降低，从而实现对正常细胞的靶向防护。然而，非人源GST的应用可能具有免疫原性风险，为解决这一问题，本研究利用无缝克隆技术构建含人源GST基因的表达载体，用于非人源GST基因的替换，进而表达和纯化了新型跨膜融合抗氧化酶GS1R和GS1XR。随后，以GS1为对照，评估新型GS1R和GS1XR对H2O2诱导的L-02细胞氧化损伤的保护作用。实验结果表明，新型GS1XR的GST比活性与改造前蛋白保持一致，但SOD比活性有所提高。200 μmol/L H2O2可短暂激活核因子-红细胞2-相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路，然而，24 h后激活效应减弱，导致细胞活力下降至48.4%。GS1R和GS1XR可清除胞内ROS，直接抵御氧化损伤，并促进Nrf2入核激活抗氧化通路，使细胞活力恢复至正常水平，且两者保护作用相当。相比之下，缺乏跨膜能力的GS1仅能清除胞外ROS，保护效果有限。综上所述，2种新型融合抗氧化酶在抵御ROS介导的正常细胞氧化损伤方面均展现出良好的应用潜力，本研究为其在相关领域的进一步研究奠定了基础。
活性氧(reactive oxygen species,ROS)是放射治疗引发肿瘤患者副作用的重要介导因素之一。由谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)和跨膜肽构成的融合抗氧化酶可有效抵御ROS损伤。将2种抗氧化酶进一步与基质金属蛋白酶-2/9底物X肽及跨膜肽R9融合后，得到的融合抗氧化酶GST-SOD1-X-R9(GS1XR)跨膜进入肿瘤细胞的能力降低，从而实现对正常细胞的靶向防护。然而，非人源GST的应用可能具有免疫原性风险，为解决这一问题，本研究利用无缝克隆技术构建含人源GST基因的表达载体，用于非人源GST基因的替换，进而表达和纯化了新型跨膜融合抗氧化酶GS1R和GS1XR。随后，以GS1为对照，评估新型GS1R和GS1XR对H2O2诱导的L-02细胞氧化损伤的保护作用。实验结果表明，新型GS1XR的GST比活性与改造前蛋白保持一致，但SOD比活性有所提高。200 μmol/L H2O2可短暂激活核因子-红细胞2-相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路，然而，24 h后激活效应减弱，导致细胞活力下降至48.4%。GS1R和GS1XR可清除胞内ROS，直接抵御氧化损伤，并促进Nrf2入核激活抗氧化通路，使细胞活力恢复至正常水平，且两者保护作用相当。相比之下，缺乏跨膜能力的GS1仅能清除胞外ROS，保护效果有限。综上所述，2种新型融合抗氧化酶在抵御ROS介导的正常细胞氧化损伤方面均展现出良好的应用潜力，本研究为其在相关领域的进一步研究奠定了基础。
2025,41(4):1559-1572, DOI: 10.13345/j.cjb.240775
, CSTR: 32114.14j.cjb.240775
摘要：
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰在细胞周期调控中起着关键作用。为了研究m6A调控有丝分裂的机制，本研究首先进行了液相色谱-串联质谱和m6A斑点印迹试验，发现细胞内总m6A修饰水平在有丝分裂期间升高。通过免疫荧光技术，发现沉默甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)和甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like 14,METTL14)会导致有丝分裂延迟、纺锤体组装异常和染色体分离缺陷。之后对HeLa细胞中转录组范围内的m6A靶点进行分析，发现polo样蛋白激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)是调节有丝分裂的关键m6A修饰基因。最后，采用免疫印记和RNA pulldown试验，发现PLK1 mRNA的m6A修饰被YTH结构域家族蛋白1(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1,YTHDF1)结合并抑制PLK1的蛋白表达，从而调控细胞周期。PLK1 mRNA的去甲基化提高了PLK1蛋白的表达，导致有丝分裂异常。本研究揭示了m6A在有丝分裂调控中的关键作用及其作为癌症等疾病的治疗靶点的潜力。
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰在细胞周期调控中起着关键作用。为了研究m6A调控有丝分裂的机制，本研究首先进行了液相色谱-串联质谱和m6A斑点印迹试验，发现细胞内总m6A修饰水平在有丝分裂期间升高。通过免疫荧光技术，发现沉默甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)和甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like 14,METTL14)会导致有丝分裂延迟、纺锤体组装异常和染色体分离缺陷。之后对HeLa细胞中转录组范围内的m6A靶点进行分析，发现polo样蛋白激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)是调节有丝分裂的关键m6A修饰基因。最后，采用免疫印记和RNA pulldown试验，发现PLK1 mRNA的m6A修饰被YTH结构域家族蛋白1(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1,YTHDF1)结合并抑制PLK1的蛋白表达，从而调控细胞周期。PLK1 mRNA的去甲基化提高了PLK1蛋白的表达，导致有丝分裂异常。本研究揭示了m6A在有丝分裂调控中的关键作用及其作为癌症等疾病的治疗靶点的潜力。
2025,41(4):1573-1587, DOI: 10.13345/j.cjb.240722
, CSTR: 32114.14j.cjb.240722
摘要：
胶原蛋白作为动物体内多种组织和功能的重要基质蛋白，在生物材料领域应用广泛。而在I型胶原蛋白的三螺旋结构中，Gly-Xaa-Yaa三联体中Gly的错义突变是引发成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)的重要原因。其临床表现具有高度异质性，涵盖从轻度骨骼脆弱(I型)到严重肢体畸形(III型)，乃至致死性围产期型(II型)的广泛疾病谱。本研究以重组胶原蛋白作为研究模型，旨在进一步明确发生在整合素结合序列GFPGER N端的Gly→Ala/Val突变是否会影响胶原蛋白的结构和功能，探讨错义突变对胶原蛋白生物学功能的影响机制。通过在GFPGER序列N端的7个Gly位点分别引入Ala和Val突变，系统评估了氨基酸替换对重组胶原蛋白的三螺旋结构、热稳定性、整合素结合能力和细胞黏附能力的影响。研究发现，所有Gly错义突变体均能形成稳定的三螺旋结构，但热稳定性略有下降。通过胰蛋白酶酶解实验，发现Gly→Val替换导致重组胶原蛋白对胰蛋白酶的敏感性增加，表明突变位点周围可能存在局部的构象扰动。此外，Gly→Val突变体的整合素结合能力和HT1080细胞黏附能力均显著降低，且这种效应比Gly→Ala突变体更为显著。这表明当Gly被更大体积的Val替代时，对胶原蛋白的结构和功能影响更为负面。本研究为理解成骨不全症的分子机制提供了新见解，同时为胶原蛋白的序列设计和生物材料开发提供了重要的理论参考和实验基础。
胶原蛋白作为动物体内多种组织和功能的重要基质蛋白，在生物材料领域应用广泛。而在I型胶原蛋白的三螺旋结构中，Gly-Xaa-Yaa三联体中Gly的错义突变是引发成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)的重要原因。其临床表现具有高度异质性，涵盖从轻度骨骼脆弱(I型)到严重肢体畸形(III型)，乃至致死性围产期型(II型)的广泛疾病谱。本研究以重组胶原蛋白作为研究模型，旨在进一步明确发生在整合素结合序列GFPGER N端的Gly→Ala/Val突变是否会影响胶原蛋白的结构和功能，探讨错义突变对胶原蛋白生物学功能的影响机制。通过在GFPGER序列N端的7个Gly位点分别引入Ala和Val突变，系统评估了氨基酸替换对重组胶原蛋白的三螺旋结构、热稳定性、整合素结合能力和细胞黏附能力的影响。研究发现，所有Gly错义突变体均能形成稳定的三螺旋结构，但热稳定性略有下降。通过胰蛋白酶酶解实验，发现Gly→Val替换导致重组胶原蛋白对胰蛋白酶的敏感性增加，表明突变位点周围可能存在局部的构象扰动。此外，Gly→Val突变体的整合素结合能力和HT1080细胞黏附能力均显著降低，且这种效应比Gly→Ala突变体更为显著。这表明当Gly被更大体积的Val替代时，对胶原蛋白的结构和功能影响更为负面。本研究为理解成骨不全症的分子机制提供了新见解，同时为胶原蛋白的序列设计和生物材料开发提供了重要的理论参考和实验基础。
2025,41(4):1588-1604, DOI: 10.13345/j.cjb.240799
, CSTR: 32114.14j.cjb.240799
摘要：
本研究通过高通量启动子筛选，优化了百脉根生根瘤菌碳酸酐酶(Mesorhizobium loti carbonic anhydrase,MlCA)的异源表达，以降低碳捕获与储存(carbon capture and storage,CCS)成本。为简化传统载体的复杂性，构建了超级折叠绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein,sfGFP)与MlCA的融合蛋白表达系统，并利用大肠杆菌(Escherichia coli)合成启动子库进行一次性高效筛选。通过检测琼脂平板上菌落的荧光强度筛选出143个单克隆，形成不同表达水平的文库。筛选出荧光强度最高的前4个重组子。使用启动子342042/+的MlCA表现出最高酶活性，比活性达到34.6 Wilbur-Anderson units (WAU)/mg。优化实验表明，MlCA在pH 7.0、40℃条件下培养4 d表现最佳，其CO2水合反应的米氏常数(Km·hdy)和最大反应速率(Vmax·hdy)分别为62.46 mmol/L和0.164 mmol/(s·L)，酯酶水解Km和Vmax分别为639.8 mmol/L和0.035 mmol/(s·L)。MlCA可在9 min内、较低pH值及室温条件下，促进CO2矿化为CaCO3。扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)分析和X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)分析证实沉淀物为方解石。本研究为CCS提供了一种低成本、环保的替代方案。
本研究通过高通量启动子筛选，优化了百脉根生根瘤菌碳酸酐酶(Mesorhizobium loti carbonic anhydrase,MlCA)的异源表达，以降低碳捕获与储存(carbon capture and storage,CCS)成本。为简化传统载体的复杂性，构建了超级折叠绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein,sfGFP)与MlCA的融合蛋白表达系统，并利用大肠杆菌(Escherichia coli)合成启动子库进行一次性高效筛选。通过检测琼脂平板上菌落的荧光强度筛选出143个单克隆，形成不同表达水平的文库。筛选出荧光强度最高的前4个重组子。使用启动子342042/+的MlCA表现出最高酶活性，比活性达到34.6 Wilbur-Anderson units (WAU)/mg。优化实验表明，MlCA在pH 7.0、40℃条件下培养4 d表现最佳，其CO2水合反应的米氏常数(Km·hdy)和最大反应速率(Vmax·hdy)分别为62.46 mmol/L和0.164 mmol/(s·L)，酯酶水解Km和Vmax分别为639.8 mmol/L和0.035 mmol/(s·L)。MlCA可在9 min内、较低pH值及室温条件下，促进CO2矿化为CaCO3。扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)分析和X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)分析证实沉淀物为方解石。本研究为CCS提供了一种低成本、环保的替代方案。
2025,41(4):1605-1620, DOI: 10.13345/j.cjb.240717
, CSTR: 32114.14j.cjb.240717
摘要：
氨基甲酸酯类农药是针对有机氯和有机磷农药的缺点而开发的一种新型广谱杀虫、杀螨、除草剂，其广泛使用及缓慢降解导致环境污染，对生态系统和人类健康造成损害，残留农药的处理是目前环境保护中亟待解决的问题。本研究通过原核表达矢野鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)SGNH/GDSL水解酶家族蛋白SyEst870，研究重组蛋白对氨基甲酸酯类农药的降解能力。构建原核表达载体pET-32a-SyEst870，转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21进行异源表达并纯化；以对硝基苯酚乙酸酯为底物结合对硝基苯酚标准曲线测定酶活性以及温度、pH、金属离子的影响；通过液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)检测SyEst870对甲萘威、速灭威、异丙威的降解能力，并使用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测SyEst870对3种农药的降解产物。结果显示，通过大肠杆菌异源表达得到SyEst870可溶性蛋白，经过亲和层析得到酶活为677.5 U的SyEst870，SyEst870在30℃、pH 7.0条件下，24 h内对起始浓度为100 mg/L的甲萘威、速灭威和异丙威降解率分别为82.34%、84.43%、92.87%；甲萘威的降解产物主要为α-萘酚和异氰酸甲酯；速灭威的降解产物主要为间甲酚和异氰酸甲酯；异丙威的主要降解产物为2-异丙基苯酚和异氰酸甲酯。相较于氨基甲酸酯类农药在自然环境中数天到数周的半衰期，重组蛋白SyEst870可快速消除氨基甲酸酯类农药的残留。本研究为解决环境和果蔬中的农药残留问题奠定了基础。
氨基甲酸酯类农药是针对有机氯和有机磷农药的缺点而开发的一种新型广谱杀虫、杀螨、除草剂，其广泛使用及缓慢降解导致环境污染，对生态系统和人类健康造成损害，残留农药的处理是目前环境保护中亟待解决的问题。本研究通过原核表达矢野鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)SGNH/GDSL水解酶家族蛋白SyEst870，研究重组蛋白对氨基甲酸酯类农药的降解能力。构建原核表达载体pET-32a-SyEst870，转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21进行异源表达并纯化；以对硝基苯酚乙酸酯为底物结合对硝基苯酚标准曲线测定酶活性以及温度、pH、金属离子的影响；通过液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)检测SyEst870对甲萘威、速灭威、异丙威的降解能力，并使用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测SyEst870对3种农药的降解产物。结果显示，通过大肠杆菌异源表达得到SyEst870可溶性蛋白，经过亲和层析得到酶活为677.5 U的SyEst870，SyEst870在30℃、pH 7.0条件下，24 h内对起始浓度为100 mg/L的甲萘威、速灭威和异丙威降解率分别为82.34%、84.43%、92.87%；甲萘威的降解产物主要为α-萘酚和异氰酸甲酯；速灭威的降解产物主要为间甲酚和异氰酸甲酯；异丙威的主要降解产物为2-异丙基苯酚和异氰酸甲酯。相较于氨基甲酸酯类农药在自然环境中数天到数周的半衰期，重组蛋白SyEst870可快速消除氨基甲酸酯类农药的残留。本研究为解决环境和果蔬中的农药残留问题奠定了基础。
2025,41(4):1621-1630, DOI: 10.13345/j.cjb.240568
, CSTR: 32114.14j.cjb.240568
摘要：
SoxR是细菌应答氧化胁迫的转录调控因子之一，在细菌逆境非生物胁迫防御中发挥着至关重要的作用。目前对细菌应答氧化胁迫的认知主要来自包括大肠杆菌在内的少数模式菌，为了研究非模式细菌应答氧化胁迫的方式，本研究以肠杆菌科中常见的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)为模型，基于全基因组背景分析SoxR进化关系，构建soxR基因缺失菌株(ΔsoxR)，并以氧化还原循环化合物甲萘醌为诱导剂，通过细胞存活能力测定，探究转录因子SoxR在应答好氧/厌氧-甲萘醌胁迫中的作用。好氧条件下，低浓度甲萘醌(0.1 mmol/L)胁迫24 h后，野生型细胞数量比0 h增加了4.2倍，ΔsoxR仅增加了1.3倍；高浓度甲萘醌(0.3 mmol/L)胁迫的野生型和ΔsoxR细胞数量分别为0 h时的29%和0.2%。厌氧条件下，甲萘醌不影响野生型和ΔsoxR细胞的生长，与对照组(0 mmol/L)相比无显著差异(P>0.05)。结果表明，C. braakii JPG1的SoxR仅在好氧条件下响应氧化还原循环化合物甲萘醌的胁迫并增强了菌株的抗氧化能力，对厌氧-甲萘醌无响应。本研究为探究细菌在不同氧条件下转录调控因子SoxR对甲萘醌胁迫响应的调控作用提供了理论基础。
SoxR是细菌应答氧化胁迫的转录调控因子之一，在细菌逆境非生物胁迫防御中发挥着至关重要的作用。目前对细菌应答氧化胁迫的认知主要来自包括大肠杆菌在内的少数模式菌，为了研究非模式细菌应答氧化胁迫的方式，本研究以肠杆菌科中常见的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)为模型，基于全基因组背景分析SoxR进化关系，构建soxR基因缺失菌株(ΔsoxR)，并以氧化还原循环化合物甲萘醌为诱导剂，通过细胞存活能力测定，探究转录因子SoxR在应答好氧/厌氧-甲萘醌胁迫中的作用。好氧条件下，低浓度甲萘醌(0.1 mmol/L)胁迫24 h后，野生型细胞数量比0 h增加了4.2倍，ΔsoxR仅增加了1.3倍；高浓度甲萘醌(0.3 mmol/L)胁迫的野生型和ΔsoxR细胞数量分别为0 h时的29%和0.2%。厌氧条件下，甲萘醌不影响野生型和ΔsoxR细胞的生长，与对照组(0 mmol/L)相比无显著差异(P>0.05)。结果表明，C. braakii JPG1的SoxR仅在好氧条件下响应氧化还原循环化合物甲萘醌的胁迫并增强了菌株的抗氧化能力，对厌氧-甲萘醌无响应。本研究为探究细菌在不同氧条件下转录调控因子SoxR对甲萘醌胁迫响应的调控作用提供了理论基础。
2025,41(4):1631-1648, DOI: 10.13345/j.cjb.240537
, CSTR: 32114.14j.cjb.240537
摘要：
在稀土元素的诱导下微生物的次级代谢产物合成可发生调节效应(hormesis effect)，但其分子机制仍不明确。为了解析胶红酵母在氯化镧存在下调节效应的分子机理，本研究在胶红酵母发酵培养基中添加不同浓度的氯化镧并测定类胡萝卜素含量，发现出现调节效应时La3+促进和抑制效应浓度分别为0–100 mg/L、100–400 mg/L；在促进效应浓度下，有33个基因表达量及55个代谢物合成量上调，85个基因的表达量及123个代谢物合成量下调，其中类胡萝卜素合成相关基因除AL1外均表达上调，β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素含量分别提高了10.74%、5.02%、3.22%；在抑制效应浓度下，有5个基因表达量及91个代谢物合成量上调，35个基因的表达量及138个代谢物合成量下调，β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素含量分别下降了21.73%、34.81%、35.51%。表明适宜浓度的稀土离子可以通过调节代谢途径的多种酶的酶活来调控次级代谢产物的合成进而产生调节效应。本研究不仅增进了对稀土元素在生物体内作用机制的理解，而且为稀土元素在农业、制药、医疗保健等领域的应用奠定了理论基础。
在稀土元素的诱导下微生物的次级代谢产物合成可发生调节效应(hormesis effect)，但其分子机制仍不明确。为了解析胶红酵母在氯化镧存在下调节效应的分子机理，本研究在胶红酵母发酵培养基中添加不同浓度的氯化镧并测定类胡萝卜素含量，发现出现调节效应时La3+促进和抑制效应浓度分别为0–100 mg/L、100–400 mg/L；在促进效应浓度下，有33个基因表达量及55个代谢物合成量上调，85个基因的表达量及123个代谢物合成量下调，其中类胡萝卜素合成相关基因除AL1外均表达上调，β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素含量分别提高了10.74%、5.02%、3.22%；在抑制效应浓度下，有5个基因表达量及91个代谢物合成量上调，35个基因的表达量及138个代谢物合成量下调，β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素含量分别下降了21.73%、34.81%、35.51%。表明适宜浓度的稀土离子可以通过调节代谢途径的多种酶的酶活来调控次级代谢产物的合成进而产生调节效应。本研究不仅增进了对稀土元素在生物体内作用机制的理解，而且为稀土元素在农业、制药、医疗保健等领域的应用奠定了理论基础。
2025,41(4):1649-1657, DOI: 10.13345/j.cjb.240505
, CSTR: 32114.14j.cjb.240505
摘要：
筛选标记作为基因编辑中的重要工具，其应用范围常因宿主遗传背景及代谢兼容性差异而呈现种属特异性限制。为了解决这一问题，本研究利用CRISPR/Cas9系统开发了一种通用性更强的反选择工具，设计引入sgRNA表达盒作为反选择标记，引导Cas9蛋白靶向切割基因组DNA，对sgRNA表达盒替换的菌株进行筛选。该系统经过优化将sgRNA靶向多拷贝位点，增强了细胞致死率，从而将反选择效率提高到85.00%以上。这一反选择工具不受菌种的限制，应用范围更广，适用于多拷贝的质粒组装以及质粒编辑等各种场景。
筛选标记作为基因编辑中的重要工具，其应用范围常因宿主遗传背景及代谢兼容性差异而呈现种属特异性限制。为了解决这一问题，本研究利用CRISPR/Cas9系统开发了一种通用性更强的反选择工具，设计引入sgRNA表达盒作为反选择标记，引导Cas9蛋白靶向切割基因组DNA，对sgRNA表达盒替换的菌株进行筛选。该系统经过优化将sgRNA靶向多拷贝位点，增强了细胞致死率，从而将反选择效率提高到85.00%以上。这一反选择工具不受菌种的限制，应用范围更广，适用于多拷贝的质粒组装以及质粒编辑等各种场景。
2025,41(4):1658-1670, DOI: 10.13345/j.cjb.240803
, CSTR: 32114.14j.cjb.240803
摘要：
本研究旨在利用CRISPR/Cas9构建Smad3基因敲除的MPC5小鼠足细胞系细胞模型，并探讨TGF-β1刺激对Smad3基因敲除后MPC5细胞去分化的影响，为Smad3在小鼠足细胞中的功能研究提供工具细胞。根据CRISPR/Cas9设计原理设计针对靶向小鼠Smad3基因单向导sgRNA序列，将连接后的pX458-Smad3载体转化至感受态细胞中，提取质粒并转染MPC5细胞。将转染后的细胞采用流式细胞分选仪分选出转染成功的细胞，经单克隆细胞扩增后采用PCR扩增Smad3基因敲除靶点附近序列并测序，分析筛选出潜在敲除细胞并在蛋白水平上验证Smad3蛋白缺失情况来确定敲除效果。在RNA水平和蛋白水平上采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reacting,RT-PCR)和Western blotting、细胞免疫荧光检测分析Smad3敲除对TGF-β1诱导的MPC5的去分化的影响。根据CRISPR/Cas9设计原理，sgRNA最终设计在Smad3第5个外显子。成功构建pX458-Smad3质粒，并将质粒转染MPC5细胞24 h后，根据EGFP荧光蛋白的表达情况确定质粒转染是否成功，将转染成功的细胞经流式细胞分析转染效率，成功率约为0.1%。采用流式细胞分选仪筛选出带有绿色荧光标签转染成功的细胞，经单克隆扩增培养，最终可以得到21个细胞克隆。对Smad3基因位点上sgRNA靶点附近序列PCR扩增测序分析，发现了2个双等位基因移码突变细胞克隆，在蛋白水平上验证其Smad3蛋白表达缺失，表明成功获得2株Smad3基因敲除MPC5细胞株。在正常MPC5细胞中，TGF-β1刺激促进纤维化基因fibronectin和Col1a1(collagen I) mRNA和蛋白的表达，同时抑制足细胞分子标记蛋白synaptopodin和podocin的表达，提示足细胞的上皮-间质转分化。然而，在2株Smad3敲除MPC5细胞中，TGF-β1诱导上皮-间质转分化基因表达特征被显著抑制。本研究成功构建了2株Smad3基因敲除MPC5小鼠足细胞系，为进一步研究Smad3蛋白的功能建立了细胞模型，为研究Smad3在MPC5细胞去分化中的作用提供了思路。
本研究旨在利用CRISPR/Cas9构建Smad3基因敲除的MPC5小鼠足细胞系细胞模型，并探讨TGF-β1刺激对Smad3基因敲除后MPC5细胞去分化的影响，为Smad3在小鼠足细胞中的功能研究提供工具细胞。根据CRISPR/Cas9设计原理设计针对靶向小鼠Smad3基因单向导sgRNA序列，将连接后的pX458-Smad3载体转化至感受态细胞中，提取质粒并转染MPC5细胞。将转染后的细胞采用流式细胞分选仪分选出转染成功的细胞，经单克隆细胞扩增后采用PCR扩增Smad3基因敲除靶点附近序列并测序，分析筛选出潜在敲除细胞并在蛋白水平上验证Smad3蛋白缺失情况来确定敲除效果。在RNA水平和蛋白水平上采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reacting,RT-PCR)和Western blotting、细胞免疫荧光检测分析Smad3敲除对TGF-β1诱导的MPC5的去分化的影响。根据CRISPR/Cas9设计原理，sgRNA最终设计在Smad3第5个外显子。成功构建pX458-Smad3质粒，并将质粒转染MPC5细胞24 h后，根据EGFP荧光蛋白的表达情况确定质粒转染是否成功，将转染成功的细胞经流式细胞分析转染效率，成功率约为0.1%。采用流式细胞分选仪筛选出带有绿色荧光标签转染成功的细胞，经单克隆扩增培养，最终可以得到21个细胞克隆。对Smad3基因位点上sgRNA靶点附近序列PCR扩增测序分析，发现了2个双等位基因移码突变细胞克隆，在蛋白水平上验证其Smad3蛋白表达缺失，表明成功获得2株Smad3基因敲除MPC5细胞株。在正常MPC5细胞中，TGF-β1刺激促进纤维化基因fibronectin和Col1a1(collagen I) mRNA和蛋白的表达，同时抑制足细胞分子标记蛋白synaptopodin和podocin的表达，提示足细胞的上皮-间质转分化。然而，在2株Smad3敲除MPC5细胞中，TGF-β1诱导上皮-间质转分化基因表达特征被显著抑制。本研究成功构建了2株Smad3基因敲除MPC5小鼠足细胞系，为进一步研究Smad3蛋白的功能建立了细胞模型，为研究Smad3在MPC5细胞去分化中的作用提供了思路。
2025,41(4):1671-1689, DOI: 10.13345/j.cjb.240530
, CSTR: 32114.14j.cjb.240530
摘要：
目前悬浮驯化的Vero细胞存在细胞活率低和倍增时间长等问题。为了探究Vero悬浮细胞生长缓慢且活率低的主要原因，本研究对Vero悬浮细胞(命名为Vero-XF)和Vero贴壁细胞(命名为Vero-AD)进行转录组学分析，筛选悬浮培养时影响细胞生长的差异基因，并通过外源添加表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)改善Vero-XF生长。结果表明，与Vero-AD组相比，Vero-XF组有7 376个显著变化的差异基因。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析发现细胞自噬和线粒体自噬最为显著。选择11个差异表达基因，进行实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证，在Vero-XF中ATG9B、WIPI2、LAMP2、OPTN、Rab7a和DEPTOR显著上调，ATG4D显著下调，与转录组分析结果一致；另外ATG101、ATG2A和STX17显著上调，NBR1则差异不显著。Western blotting检测Vero-XF与Vero-AD中自噬标志蛋白LC3和P62的表达，其中Vero-XF的LC3Ⅱ/Ⅰ表达量显著上调，P62表达量显著下调，自噬水平较高。最后通过外源添加EGF改善Vero-XF自噬。结果表明，10、20、30 μg/L的EGF使得Vero-XF自噬水平分别降低了22.35%、48.15%、71.29%；比生长速率增加了15.48%、33.33%、57.14%；细胞凋亡率下降了2.84%、15.46%、16.23%。本研究结果初步揭示了Vero-XF自噬机制的激活是导致其生长缓慢的原因之一，为后续Vero细胞的悬浮培养提供了参考。
目前悬浮驯化的Vero细胞存在细胞活率低和倍增时间长等问题。为了探究Vero悬浮细胞生长缓慢且活率低的主要原因，本研究对Vero悬浮细胞(命名为Vero-XF)和Vero贴壁细胞(命名为Vero-AD)进行转录组学分析，筛选悬浮培养时影响细胞生长的差异基因，并通过外源添加表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)改善Vero-XF生长。结果表明，与Vero-AD组相比，Vero-XF组有7 376个显著变化的差异基因。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析发现细胞自噬和线粒体自噬最为显著。选择11个差异表达基因，进行实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证，在Vero-XF中ATG9B、WIPI2、LAMP2、OPTN、Rab7a和DEPTOR显著上调，ATG4D显著下调，与转录组分析结果一致；另外ATG101、ATG2A和STX17显著上调，NBR1则差异不显著。Western blotting检测Vero-XF与Vero-AD中自噬标志蛋白LC3和P62的表达，其中Vero-XF的LC3Ⅱ/Ⅰ表达量显著上调，P62表达量显著下调，自噬水平较高。最后通过外源添加EGF改善Vero-XF自噬。结果表明，10、20、30 μg/L的EGF使得Vero-XF自噬水平分别降低了22.35%、48.15%、71.29%；比生长速率增加了15.48%、33.33%、57.14%；细胞凋亡率下降了2.84%、15.46%、16.23%。本研究结果初步揭示了Vero-XF自噬机制的激活是导致其生长缓慢的原因之一，为后续Vero细胞的悬浮培养提供了参考。
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2010,26(4):439-447
摘要：
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
2008,24(7):1248-1252
摘要：
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
2008,24(11):1851-1859
摘要：
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
2013,29(2):131-140
摘要：
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
2010,26(10):1393-1403
摘要：
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
2008,24(3):452-459
摘要：
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
2013,29(4):480-489
摘要：
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
2009,25(10):1497-1507
摘要：
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
2001,17(2)
摘要：
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
2021,37(9):3151-3161
,DOI: 10.13345/j.cjb.200734
,CSTR: 32114.14.j.cjb.200734
摘要：
单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌。单增李斯特菌的分布和存活与其形成生物膜的能力有关，生物膜对逆性环境有抵抗力，细菌会从生物膜中分离导致食品持续性的污染。生物膜的形成、成熟和结构取决于多种外部和内部因素，并且多种调控机制起着重要作用。文中旨在阐述单增李斯特菌生物膜形成过程中的调控机制 (包括胞内作用、胞间作用和种间作用)，以控制食品加工环境中致病性生物膜的形成，从而为食品安全提供新的干预策略。
单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌。单增李斯特菌的分布和存活与其形成生物膜的能力有关，生物膜对逆性环境有抵抗力，细菌会从生物膜中分离导致食品持续性的污染。生物膜的形成、成熟和结构取决于多种外部和内部因素，并且多种调控机制起着重要作用。文中旨在阐述单增李斯特菌生物膜形成过程中的调控机制 (包括胞内作用、胞间作用和种间作用)，以控制食品加工环境中致病性生物膜的形成，从而为食品安全提供新的干预策略。
2010,26(4):421-430
摘要：
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
2013,29(1):78-86
摘要：
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
2023,39(10):4275-4294
,DOI: 10.13345/j.cjb.230297
,CSTR: 32114.14.j.cjb.230297
摘要：
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
2004,20(1)
摘要：
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
2008,24(12):2106-2110
摘要：
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
2009,25(9):1296-1302
摘要：
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
2002,18(5)
摘要：
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
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