科微学术
生物工程学报
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ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q
主管单位： 中国科学院 创刊时间：1985年
主办单位： 中国科学院微生物研究所 出版刊期：月刊
中国微生物学会 邮发代号：82-13
主 编： 邓子新 院士 出版日期：每月25日
执行主编： 李寅
收录类型：北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、Medline/PubMed、Scopus、AJ、JST、CSA(NS)、IC、EMBASE
主要栏目：综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学
- 2024年第40卷第6期
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2024,40(6):I-IV, DOI: 10.13345/j.cjb.240454
摘要：
2024,40(6):1601-1619, DOI: 10.13345/j.cjb.230664
摘要：
维生素D3是对人体健康十分重要的维生素，可以促进肠道对钙的吸收、防止佝偻病等。骨化二醇[25(OH) VD3]和骨化三醇[1α,25(OH)2VD3]是维生素D3的两种活性衍生物，在防治骨质疏松及调节人的生理功能方面发挥着重要作用。目前，骨化二醇及骨化三醇的生产以化学合成居多，但化学合成具有产物产量低、副产物多以及对环境不友好等缺点。因此开发一种绿色、安全、对环境友好的生物催化合成途径显得尤为重要。本文综述了骨化二醇及骨化三醇的生物催化合成途径，并介绍了该途径中的关键酶P450酶，包括P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases, CYPs)和P450过加氧酶(unspecific peroxygenases, UPOs)。其中研究较为广泛的是P450单加氧酶，通过解析其催化作用机制，分析不同氧化还原伴侣适配以及关键氨基酸残基对酶催化活性的重要影响。此外，对利用H2O2驱动的UPOs的催化机理、高效异源表达策略以及H2O2的原位再生等方面也进行了总结，UPOs优势在于既不需要昂贵的辅因子也不需要氧化还原伴侣的参与，是十分有前景的生物催化剂。本文为进一步开发或改造相关P450酶来高效生产VD3活性衍生物提供了重要的参考。
维生素D3是对人体健康十分重要的维生素，可以促进肠道对钙的吸收、防止佝偻病等。骨化二醇[25(OH) VD3]和骨化三醇[1α,25(OH)2VD3]是维生素D3的两种活性衍生物，在防治骨质疏松及调节人的生理功能方面发挥着重要作用。目前，骨化二醇及骨化三醇的生产以化学合成居多，但化学合成具有产物产量低、副产物多以及对环境不友好等缺点。因此开发一种绿色、安全、对环境友好的生物催化合成途径显得尤为重要。本文综述了骨化二醇及骨化三醇的生物催化合成途径，并介绍了该途径中的关键酶P450酶，包括P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases, CYPs)和P450过加氧酶(unspecific peroxygenases, UPOs)。其中研究较为广泛的是P450单加氧酶，通过解析其催化作用机制，分析不同氧化还原伴侣适配以及关键氨基酸残基对酶催化活性的重要影响。此外，对利用H2O2驱动的UPOs的催化机理、高效异源表达策略以及H2O2的原位再生等方面也进行了总结，UPOs优势在于既不需要昂贵的辅因子也不需要氧化还原伴侣的参与，是十分有前景的生物催化剂。本文为进一步开发或改造相关P450酶来高效生产VD3活性衍生物提供了重要的参考。
2024,40(6):1620-1643, DOI: 10.13345/j.cjb.230640
摘要：
相容性溶质是微生物分泌的一类高水溶性有机渗透物，以适应高盐度和高渗透压等极端环境。四氢嘧啶(ectoine)作为一种重要的相容性溶质，对核酸、蛋白、生物膜以及细胞具有修复和保护作用，广泛应用于化妆品、生物制剂、酶工业和医疗等领域，每公斤市场售价约为1 000美元，全球每年需求量高达1.5万t。嗜盐菌是四氢嘧啶天然合成的微生物来源，但其需在高盐培养基中生长，工业化生产存在设备腐蚀以及成本高昂等问题。随着功能基因组学、系统生物学和合成生物学的快速发展，利用代谢工程等手段构建四氢嘧啶高产细胞工厂成为当前重要的研究方向，工程化大肠杆菌的四氢嘧啶最高产量已达131.8 g/L，产率为1.37 g/(L‧h)。本文主要围绕四氢嘧啶的合成途径、关键酶的生化特性以及四氢嘧啶生物合成等方面进行综述，以期阐明其研究现状并为四氢嘧啶的工业生产提供思路和方向。
相容性溶质是微生物分泌的一类高水溶性有机渗透物，以适应高盐度和高渗透压等极端环境。四氢嘧啶(ectoine)作为一种重要的相容性溶质，对核酸、蛋白、生物膜以及细胞具有修复和保护作用，广泛应用于化妆品、生物制剂、酶工业和医疗等领域，每公斤市场售价约为1 000美元，全球每年需求量高达1.5万t。嗜盐菌是四氢嘧啶天然合成的微生物来源，但其需在高盐培养基中生长，工业化生产存在设备腐蚀以及成本高昂等问题。随着功能基因组学、系统生物学和合成生物学的快速发展，利用代谢工程等手段构建四氢嘧啶高产细胞工厂成为当前重要的研究方向，工程化大肠杆菌的四氢嘧啶最高产量已达131.8 g/L，产率为1.37 g/(L‧h)。本文主要围绕四氢嘧啶的合成途径、关键酶的生化特性以及四氢嘧啶生物合成等方面进行综述，以期阐明其研究现状并为四氢嘧啶的工业生产提供思路和方向。
2024,40(6):1644-1660, DOI: 10.13345/j.cjb.230715
摘要：
胞磷胆碱(cytidine-5'-diphosphate choline, CDP-choline)是磷脂酰胆碱和乙酰胆碱的前体，参与形成细胞膜磷脂双分子层并能够稳定神经递质系统，对脑损伤引起的功能和意识障碍、帕金森病、抑郁症以及青光眼等均有疗效，在临床医学和保健品领域已有应用。胞磷胆碱的化学合成工艺需要采用昂贵且有毒的试剂且会产生各种副产物，工业化生产成本高，正逐步被生物合成法替代。生物合成法分为微生物发酵法和生物催化法两种：微生物发酵法原料相对低廉，但转化率低、分离纯化工艺繁杂；生物催化法分为细胞高密度培养和体外催化合成2个阶段，合成工艺繁杂，但转化率高、提取成本相对较低，是目前工业化生产的主要方式。本文综述了胞磷胆碱的化学合成和生物合成进展，重点介绍胞磷胆碱的代谢途径及生物催化合成工艺，以期为胞磷胆碱的工业化生产提供思路。
胞磷胆碱(cytidine-5'-diphosphate choline, CDP-choline)是磷脂酰胆碱和乙酰胆碱的前体，参与形成细胞膜磷脂双分子层并能够稳定神经递质系统，对脑损伤引起的功能和意识障碍、帕金森病、抑郁症以及青光眼等均有疗效，在临床医学和保健品领域已有应用。胞磷胆碱的化学合成工艺需要采用昂贵且有毒的试剂且会产生各种副产物，工业化生产成本高，正逐步被生物合成法替代。生物合成法分为微生物发酵法和生物催化法两种：微生物发酵法原料相对低廉，但转化率低、分离纯化工艺繁杂；生物催化法分为细胞高密度培养和体外催化合成2个阶段，合成工艺繁杂，但转化率高、提取成本相对较低，是目前工业化生产的主要方式。本文综述了胞磷胆碱的化学合成和生物合成进展，重点介绍胞磷胆碱的代谢途径及生物催化合成工艺，以期为胞磷胆碱的工业化生产提供思路。
2024,40(6):1661-1693, DOI: 10.13345/j.cjb.230682
摘要：
萜类化合物是含量最丰富的一类天然化合物，因其种类繁多、生物活性多样，被广泛应用于食品、医药、化工以及新型燃料等领域。萜类化合物的开发利用价值极高，但依靠植物提取和化学合成等传统生产方式很难满足目前的市场需求。随着合成生物学和代谢工程的发展，构建高效的微生物细胞工厂，特别是以酵母为宿主的细胞工厂，为萜类化合物的大规模生产提供了可能。近年来，研究人员已成功构建出多种萜类化合物的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株，并通过合成生物学和代谢调控等方法有效提高了目标产物的产量。本文总结了近几年利用 S. cerevisiae底盘细胞生物合成萜类化合物的具体实例，阐述了对S. cerevisiae生产萜类化合物的调控策略：包括代谢途径构建与优化、关键酶的挖掘与改造、辅因子再生工程、细胞区室化工程、细胞外排工程，以及细胞耐受性改造等，为进一步利用S. cerevisiae细胞工厂合成更多更高产量的萜类化合物提供参考。
萜类化合物是含量最丰富的一类天然化合物，因其种类繁多、生物活性多样，被广泛应用于食品、医药、化工以及新型燃料等领域。萜类化合物的开发利用价值极高，但依靠植物提取和化学合成等传统生产方式很难满足目前的市场需求。随着合成生物学和代谢工程的发展，构建高效的微生物细胞工厂，特别是以酵母为宿主的细胞工厂，为萜类化合物的大规模生产提供了可能。近年来，研究人员已成功构建出多种萜类化合物的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株，并通过合成生物学和代谢调控等方法有效提高了目标产物的产量。本文总结了近几年利用 S. cerevisiae底盘细胞生物合成萜类化合物的具体实例，阐述了对S. cerevisiae生产萜类化合物的调控策略：包括代谢途径构建与优化、关键酶的挖掘与改造、辅因子再生工程、细胞区室化工程、细胞外排工程，以及细胞耐受性改造等，为进一步利用S. cerevisiae细胞工厂合成更多更高产量的萜类化合物提供参考。
2024,40(6):1694-1710, DOI: 10.13345/j.cjb.230762
摘要：
2-苯乙醇(2-phenylethanol, 2-PE)是一种具有玫瑰花香的芳香族醇，是全球用量第二大的香料物质，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业。本文介绍了2-苯乙醇的化学合成方法及其在植物和微生物中的合成路径，总结了提高微生物合成2-苯乙醇的策略，综述了微生物从头合成2-苯乙醇的研究进展，并对2-苯乙醇合成研究前景进行展望，以期为工业化生产2-苯乙醇提供一定理论基础。
2-苯乙醇(2-phenylethanol, 2-PE)是一种具有玫瑰花香的芳香族醇，是全球用量第二大的香料物质，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业。本文介绍了2-苯乙醇的化学合成方法及其在植物和微生物中的合成路径，总结了提高微生物合成2-苯乙醇的策略，综述了微生物从头合成2-苯乙醇的研究进展，并对2-苯乙醇合成研究前景进行展望，以期为工业化生产2-苯乙醇提供一定理论基础。
2024,40(6):1711-1727, DOI: 10.13345/j.cjb.230825
摘要：
氨基酸是构成蛋白质的基本单元，被广泛应用于食品、医药、饲料和化工等多个领域。利用微生物细胞工厂生产氨基酸，具备原料可再生、生产过程条件温和、产品纯度高、环境污染小等优点，能够助力实现碳中和。借助代谢工程和合成生物学技术，对大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行定向设计、改造与优化，创制了高产氨基酸的微生物细胞工厂，实现了支链氨基酸、天冬氨酸族氨基酸、谷氨酸族氨基酸和芳香族氨基酸的生物炼制。本文对高产氨基酸的大肠杆菌细胞工厂和谷氨酸棒杆菌细胞工厂创制过程进行分析，以期对高性能微生物细胞工厂的创制提供参考。
氨基酸是构成蛋白质的基本单元，被广泛应用于食品、医药、饲料和化工等多个领域。利用微生物细胞工厂生产氨基酸，具备原料可再生、生产过程条件温和、产品纯度高、环境污染小等优点，能够助力实现碳中和。借助代谢工程和合成生物学技术，对大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行定向设计、改造与优化，创制了高产氨基酸的微生物细胞工厂，实现了支链氨基酸、天冬氨酸族氨基酸、谷氨酸族氨基酸和芳香族氨基酸的生物炼制。本文对高产氨基酸的大肠杆菌细胞工厂和谷氨酸棒杆菌细胞工厂创制过程进行分析，以期对高性能微生物细胞工厂的创制提供参考。
2024,40(6):1728-1741, DOI: 10.13345/j.cjb.230748
摘要：
天然酶在活性、对映体选择性或热稳定性等方面经常难以满足应用与研究的需求，探索高效的酶分子改造技术改善该类酶的某些特性是酶工程的重要任务。酶分子改造技术主要包括理性设计、定向进化和人工智能辅助设计等。定向进化和理性设计是由实验驱动的酶分子改造策略，已经成功地应用于酶工程，但由于蛋白质序列空间的尺寸巨大以及实验数据少，现行的酶分子改造方法仍然面临着重大挑战。随着新一代测序、高通量筛选方法、蛋白质数据库和人工智能技术的发展，数据驱动的酶工程有望应对这些挑战。其中，采用人工智能辅助的统计学习方法，通过数据驱动方式构建序列/结构-酶性能的预测模型，依据预测模型挑选优良突变酶，大大提高了酶分子改造效率。基于酶分子改造的应用需求，本文综述了人工智能辅助酶分子改造的数据采集方法以及人工智能辅助酶分子改造的应用实例等，重点叙述了采用卷积神经网络预测蛋白质热稳定性的方法，以期为该领域的研究人员提供参考。
天然酶在活性、对映体选择性或热稳定性等方面经常难以满足应用与研究的需求，探索高效的酶分子改造技术改善该类酶的某些特性是酶工程的重要任务。酶分子改造技术主要包括理性设计、定向进化和人工智能辅助设计等。定向进化和理性设计是由实验驱动的酶分子改造策略，已经成功地应用于酶工程，但由于蛋白质序列空间的尺寸巨大以及实验数据少，现行的酶分子改造方法仍然面临着重大挑战。随着新一代测序、高通量筛选方法、蛋白质数据库和人工智能技术的发展，数据驱动的酶工程有望应对这些挑战。其中，采用人工智能辅助的统计学习方法，通过数据驱动方式构建序列/结构-酶性能的预测模型，依据预测模型挑选优良突变酶，大大提高了酶分子改造效率。基于酶分子改造的应用需求，本文综述了人工智能辅助酶分子改造的数据采集方法以及人工智能辅助酶分子改造的应用实例等，重点叙述了采用卷积神经网络预测蛋白质热稳定性的方法，以期为该领域的研究人员提供参考。
2024,40(6):1742-1751, DOI: 10.13345/j.cjb.230747
摘要：
刺激响应型脂质体作为一种新型纳米载体，已广泛应用于医学、食品及化妆品领域。本文围绕刺激响应型脂质体的制备方式、构建策略及其生物学应用展开了详细的介绍。其中，重点综述了pH敏感型、氧化还原敏感型、酶敏感型、热敏型、光敏型和磁场响应型脂质体的功能原理，并根据给药方式的不同对其应用进行了总结归纳。最后，本文对当前刺激响应型脂质体面临的问题与发展前景作出了概括展望。
刺激响应型脂质体作为一种新型纳米载体，已广泛应用于医学、食品及化妆品领域。本文围绕刺激响应型脂质体的制备方式、构建策略及其生物学应用展开了详细的介绍。其中，重点综述了pH敏感型、氧化还原敏感型、酶敏感型、热敏型、光敏型和磁场响应型脂质体的功能原理，并根据给药方式的不同对其应用进行了总结归纳。最后，本文对当前刺激响应型脂质体面临的问题与发展前景作出了概括展望。
2024,40(6):1752-1775, DOI: 10.13345/j.cjb.230645
摘要：
嗜热蓝细菌是一类具有独特耐热特征的蓝细菌，可以作为研究光合生物高温适应机制的模式生物。系统解析嗜热蓝细菌的高温适应机制，有助于深入理解光合生物及其他微生物响应和适应高温环境的分子机理，同时还具有指导耐热作物培育和构建微生物耐热细胞工厂的潜在应用前景。本文全面综述了嗜热蓝细菌的相关研究进展，包括其生态分布、形态特征、组学研究和耐热机制挖掘等多个方面；此外，还对嗜热蓝细菌在生物技术领域的应用前景与未来研究方向进行了展望。本文为深入了解蓝细菌光合生理与代谢特点，特别是嗜热蓝细菌在高温适应机制方面的研究提供了参考。
嗜热蓝细菌是一类具有独特耐热特征的蓝细菌，可以作为研究光合生物高温适应机制的模式生物。系统解析嗜热蓝细菌的高温适应机制，有助于深入理解光合生物及其他微生物响应和适应高温环境的分子机理，同时还具有指导耐热作物培育和构建微生物耐热细胞工厂的潜在应用前景。本文全面综述了嗜热蓝细菌的相关研究进展，包括其生态分布、形态特征、组学研究和耐热机制挖掘等多个方面；此外，还对嗜热蓝细菌在生物技术领域的应用前景与未来研究方向进行了展望。本文为深入了解蓝细菌光合生理与代谢特点，特别是嗜热蓝细菌在高温适应机制方面的研究提供了参考。
2024,40(6):1776-1791, DOI: 10.13345/j.cjb.230717
摘要：
丝状真菌是一类广泛存在于自然界中的真核微生物，一些丝状真菌因具有强大的蛋白分泌能力或者可以有效合成许多活性物质被开发为“细胞工厂”，常被用于酶制剂、重组蛋白、有机酸以及次级代谢产物的生产。丝状真菌菌体的生长形态对工业发酵具有关键意义，对发酵产品的品质及发酵过程的控制均有显著影响。本课题组前期研究发现丝状真菌的菌丝形态直接影响着菌体的蛋白分泌，菌丝分枝的增多会使液体发酵时蛋白质的分泌量增加。随着丝状真菌形态研究的深入，对改变真菌菌丝体形态以提高发酵过程中目标代谢物产量的研究日益增多。尽管在真菌发酵形态与生产力的关系方向已有少量综述，但该领域的研究发展非常迅速，亟待更新。本文在对国内外相关研究报告进行大量调研的基础上，结合作者科研团队自己的研究发现，系统综述了丝状真菌的形态特征、真菌形态对工业发酵的影响及菌丝形态调控的方法和策略，以期增强国内相关学者对丝状真菌菌丝形态发育的认识，为合理开发适用于工业发酵的工程菌株提供思路。
丝状真菌是一类广泛存在于自然界中的真核微生物，一些丝状真菌因具有强大的蛋白分泌能力或者可以有效合成许多活性物质被开发为“细胞工厂”，常被用于酶制剂、重组蛋白、有机酸以及次级代谢产物的生产。丝状真菌菌体的生长形态对工业发酵具有关键意义，对发酵产品的品质及发酵过程的控制均有显著影响。本课题组前期研究发现丝状真菌的菌丝形态直接影响着菌体的蛋白分泌，菌丝分枝的增多会使液体发酵时蛋白质的分泌量增加。随着丝状真菌形态研究的深入，对改变真菌菌丝体形态以提高发酵过程中目标代谢物产量的研究日益增多。尽管在真菌发酵形态与生产力的关系方向已有少量综述，但该领域的研究发展非常迅速，亟待更新。本文在对国内外相关研究报告进行大量调研的基础上，结合作者科研团队自己的研究发现，系统综述了丝状真菌的形态特征、真菌形态对工业发酵的影响及菌丝形态调控的方法和策略，以期增强国内相关学者对丝状真菌菌丝形态发育的认识，为合理开发适用于工业发酵的工程菌株提供思路。
2024,40(6):1792-1805, DOI: 10.13345/j.cjb.230668
摘要：
细胞培养技术是各种以细胞测定为基础进行生物学和临床前研究的基础性手段。细胞培养的相关测定，即培养期间细胞数量、活力和代谢活动的研究，可以反映各种培养条件下的细胞情况。传统细胞培养及检测手段存在试剂和样本消耗量大、无法实时监控细胞状态且难以对细胞微环境进行时空调节等问题。细胞阻抗传感器通过交流电流测量细胞的电阻抗变化，可实现实时监测细胞贴附、生长、增殖、迁移等细胞活动引起的阻抗特性变化。微流控芯片具有将复杂的生物过程缩小、集成多种分析模式以及实现检测的高度自动化等优点。利用微流控芯片与细胞阻抗传感的集成，可以大大提高细胞相关分析能力和效率。文中概括了基于微流体的阻抗传感器在2D和3D细胞体系中的应用，总结了其在细胞生长、增殖、活力、代谢活动以及药物筛选应用方面的研究进展，最后展望了未来发展趋势以及可能的挑战，为电阻抗传感集成微流控芯片在药物筛选领域的发展提供一些思路。
细胞培养技术是各种以细胞测定为基础进行生物学和临床前研究的基础性手段。细胞培养的相关测定，即培养期间细胞数量、活力和代谢活动的研究，可以反映各种培养条件下的细胞情况。传统细胞培养及检测手段存在试剂和样本消耗量大、无法实时监控细胞状态且难以对细胞微环境进行时空调节等问题。细胞阻抗传感器通过交流电流测量细胞的电阻抗变化，可实现实时监测细胞贴附、生长、增殖、迁移等细胞活动引起的阻抗特性变化。微流控芯片具有将复杂的生物过程缩小、集成多种分析模式以及实现检测的高度自动化等优点。利用微流控芯片与细胞阻抗传感的集成，可以大大提高细胞相关分析能力和效率。文中概括了基于微流体的阻抗传感器在2D和3D细胞体系中的应用，总结了其在细胞生长、增殖、活力、代谢活动以及药物筛选应用方面的研究进展，最后展望了未来发展趋势以及可能的挑战，为电阻抗传感集成微流控芯片在药物筛选领域的发展提供一些思路。
2024,40(6):1806-1832, DOI: 10.13345/j.cjb.230714
摘要：
氮素的过量累积是引起水体富营养化的重要因素，开发廉价高效的污水脱氮工艺是水质净化研究的重要内容。微生物脱氮处理成本低、效率较高、环境适应性强，已广泛应用于水质脱氮的净化处理。近年来，基于合成生物技术的人工多细胞体系由于其独特的可定义性及可控性，分解代谢路径和环境响应机制较天然菌群更为明确，能够实现低细胞代谢负荷下高效脱氮，在垃圾渗滤液、工业废水、海水养殖废水和生活污水的生物净化处理中具有广泛的应用潜力。本文聚焦污水脱氮人工多细胞体系的设计、构建与应用，总结了脱氮微生物及其脱氮机制，概括了人工多细胞体系的设计思路与构建方法，并列举了人工多细胞体系在污水净化的应用案例，对污水脱氮未来研究和应用实践进行了展望，以期为优化微生物污水脱氮处理提供新的思路和有效策略。
氮素的过量累积是引起水体富营养化的重要因素，开发廉价高效的污水脱氮工艺是水质净化研究的重要内容。微生物脱氮处理成本低、效率较高、环境适应性强，已广泛应用于水质脱氮的净化处理。近年来，基于合成生物技术的人工多细胞体系由于其独特的可定义性及可控性，分解代谢路径和环境响应机制较天然菌群更为明确，能够实现低细胞代谢负荷下高效脱氮，在垃圾渗滤液、工业废水、海水养殖废水和生活污水的生物净化处理中具有广泛的应用潜力。本文聚焦污水脱氮人工多细胞体系的设计、构建与应用，总结了脱氮微生物及其脱氮机制，概括了人工多细胞体系的设计思路与构建方法，并列举了人工多细胞体系在污水净化的应用案例，对污水脱氮未来研究和应用实践进行了展望，以期为优化微生物污水脱氮处理提供新的思路和有效策略。
2024,40(6):1833-1844, DOI: 10.13345/j.cjb.230737
摘要：
内质网(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白质折叠和质量控制的主要场所，其内部驻留的分子伴侣能够帮助新生多肽链形成正确的三级结构。部分分子伴侣通过特异性识别葡萄糖基化的N-寡糖结构与糖肽结合，进而促进相应蛋白的折叠。作为ER腔内葡萄糖基化反应的糖基供体，体外获取多萜醇磷酸葡萄糖(dolichol phosphate glucose, Dol-P-Glc)或其类似物对解析N-寡糖生物合成途径及糖蛋白质量控制体系具有重要意义，一直受到科学家们的关注。本研究以化学合成的一系列多萜醇(dolichol)类似物作为底物，对大肠杆菌表达的阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)来源的多萜醇磷酸β-葡萄糖基转移酶E (dolichyl-phosphateb-glucosyltransferase E, Alg5E)进行了研究。结果表明该重组蛋白在体外具有较强的催化活性，可以识别不同链长的脂肪醇，底物中脂肪醇碳链越长其酶促反应进程越快，且对脂肪醇中异戊二烯的支链甲基表现出偏好性。研究还确认了重要的天冬氨酸-任意氨基酸-天冬氨酸(aspartate-any residue-aspartate, DXD)基序与二价金属离子的结合是该酶发挥催化功能的关键。上述工作为多萜醇寡糖(dolichol-linked oligosaccharide, DLO)合成途径中葡萄糖基转移酶Alg6、Alg8和Alg10的研究打下了基础。
内质网(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白质折叠和质量控制的主要场所，其内部驻留的分子伴侣能够帮助新生多肽链形成正确的三级结构。部分分子伴侣通过特异性识别葡萄糖基化的N-寡糖结构与糖肽结合，进而促进相应蛋白的折叠。作为ER腔内葡萄糖基化反应的糖基供体，体外获取多萜醇磷酸葡萄糖(dolichol phosphate glucose, Dol-P-Glc)或其类似物对解析N-寡糖生物合成途径及糖蛋白质量控制体系具有重要意义，一直受到科学家们的关注。本研究以化学合成的一系列多萜醇(dolichol)类似物作为底物，对大肠杆菌表达的阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)来源的多萜醇磷酸β-葡萄糖基转移酶E (dolichyl-phosphate
2024,40(6):1845-1855, DOI: 10.13345/j.cjb.230693
摘要：
α-熊果苷在化妆品和医药领域具有重要应用价值，但从植物组织中提取产率低，极大地限制了其应用。本研究利用戈特沙尔克厌氧分支杆菌(Anaerobranca gottschalkii)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase, CGTase)，以麦芽糊精为供体，对苯二酚为受体，催化合成α-熊果苷。通过定点饱和突变和定点突变筛选到突变体AgCGTase-F235G-N166H，活力是野生型的3.48倍。通过优化反应pH、温度、对苯二酚添加量，转化率在最优反应条件下达到63%。综上所述，本研究成功构建了一株能高效合成α-熊果苷并具有较高苯二酚转化率的菌株，对于降低α-熊果苷工业化的生产成本，提高产物的转化率方面具有重要的应用潜力。
α-熊果苷在化妆品和医药领域具有重要应用价值，但从植物组织中提取产率低，极大地限制了其应用。本研究利用戈特沙尔克厌氧分支杆菌(Anaerobranca gottschalkii)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase, CGTase)，以麦芽糊精为供体，对苯二酚为受体，催化合成α-熊果苷。通过定点饱和突变和定点突变筛选到突变体AgCGTase-F235G-N166H，活力是野生型的3.48倍。通过优化反应pH、温度、对苯二酚添加量，转化率在最优反应条件下达到63%。综上所述，本研究成功构建了一株能高效合成α-熊果苷并具有较高苯二酚转化率的菌株，对于降低α-熊果苷工业化的生产成本，提高产物的转化率方面具有重要的应用潜力。
2024,40(6):1856-1867, DOI: 10.13345/j.cjb.230684
摘要：
细菌纤维素(bacterial cellulose, BC)是由细菌合成的高分子生物聚合物，具有持水性高、结晶度高、纯度高等优良特性，广泛应用于食品、医疗、化妆品和功能膜等领域。木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)是BC合成研究的模式菌株。在细菌中，运动相关基因与BC合成有关，而在木葡糖酸醋杆菌CGMCC 2955中，尚不清楚运动相关基因的功能及其对BC合成的影响。本研究利用λ-Red重组系统敲除细菌运动相关基因motA、motB、mot2A，以此构建了敲除菌株K. x-ΔmotA、K. x-ΔmotB、K. x-Δmot2A及双敲菌株K. x-ΔmotAB。结果表明：敲除菌K. x-ΔmotAB的BC产量最高，达到(5.05±0.26) g/L，与野生型菌株相比，提高24%左右；同时，该菌株合成的BC的孔隙率最低，达到了54.35%，并具有更优越的力学性能，杨氏模量可达5.21 GPa。在木葡糖酸醋杆菌CGMCC 2955中敲除运动相关基因之后，并未降低BC的产量，反而促进了BC的合成，进一步加深了醋酸菌中运动性与BC关系的认知；并且敲除motA和motB基因后，降低了BC的孔隙率并提升了BC的力学性能，为BC合成及膜结构调节改造提供了参考。
细菌纤维素(bacterial cellulose, BC)是由细菌合成的高分子生物聚合物，具有持水性高、结晶度高、纯度高等优良特性，广泛应用于食品、医疗、化妆品和功能膜等领域。木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)是BC合成研究的模式菌株。在细菌中，运动相关基因与BC合成有关，而在木葡糖酸醋杆菌CGMCC 2955中，尚不清楚运动相关基因的功能及其对BC合成的影响。本研究利用λ-Red重组系统敲除细菌运动相关基因motA、motB、mot2A，以此构建了敲除菌株K. x-ΔmotA、K. x-ΔmotB、K. x-Δmot2A及双敲菌株K. x-ΔmotAB。结果表明：敲除菌K. x-ΔmotAB的BC产量最高，达到(5.05±0.26) g/L，与野生型菌株相比，提高24%左右；同时，该菌株合成的BC的孔隙率最低，达到了54.35%，并具有更优越的力学性能，杨氏模量可达5.21 GPa。在木葡糖酸醋杆菌CGMCC 2955中敲除运动相关基因之后，并未降低BC的产量，反而促进了BC的合成，进一步加深了醋酸菌中运动性与BC关系的认知；并且敲除motA和motB基因后，降低了BC的孔隙率并提升了BC的力学性能，为BC合成及膜结构调节改造提供了参考。
2024,40(6):1868-1881, DOI: 10.13345/j.cjb.230683
摘要：
阿维拉霉素(avilamycin, AVI)是一种寡糖类抗生素，因其具有较强的革兰氏阳性细菌抑制能力，被广泛应用于畜禽养殖。但传统的育种技术与不成熟的发酵工艺已成为限制其国产化的关键因素。基于已获得的利用核糖体工程技术改造的高产阿维拉霉素突变菌株，本研究采用比较代谢组学技术探究其与出发菌株的胞内代谢差异。利用GC-MS技术对发酵至第4、6、8天的菌丝体进行分析，共检测出112种化合物，经NIST谱库对比后精确匹配到29种胞内代谢物。二维主成分分析(principal component analysis, PCA)表明突变菌株与出发菌株的不同时间点代谢物有明显差异，通过正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)得到11种胞内差异代谢物。KEGG代谢通路富集显示阿维拉霉素的合成主要与碳水化合物代谢和氨基酸代谢密切相关，且进一步筛选出6种关键差异代谢物：l-缬氨酸、l-丝氨酸、l-丙氨酸、d-半乳糖、d-纤维二糖和d-葡萄糖。突变菌株中这些代谢物的上调增强了其代谢流，使其在罐上发酵8 d时，阿维拉霉素产量较出发菌株提高76.86%。本研究的开展为后续阿维拉霉素发酵工艺理性优化提供了参考。
阿维拉霉素(avilamycin, AVI)是一种寡糖类抗生素，因其具有较强的革兰氏阳性细菌抑制能力，被广泛应用于畜禽养殖。但传统的育种技术与不成熟的发酵工艺已成为限制其国产化的关键因素。基于已获得的利用核糖体工程技术改造的高产阿维拉霉素突变菌株，本研究采用比较代谢组学技术探究其与出发菌株的胞内代谢差异。利用GC-MS技术对发酵至第4、6、8天的菌丝体进行分析，共检测出112种化合物，经NIST谱库对比后精确匹配到29种胞内代谢物。二维主成分分析(principal component analysis, PCA)表明突变菌株与出发菌株的不同时间点代谢物有明显差异，通过正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)得到11种胞内差异代谢物。KEGG代谢通路富集显示阿维拉霉素的合成主要与碳水化合物代谢和氨基酸代谢密切相关，且进一步筛选出6种关键差异代谢物：l-缬氨酸、l-丝氨酸、l-丙氨酸、d-半乳糖、d-纤维二糖和d-葡萄糖。突变菌株中这些代谢物的上调增强了其代谢流，使其在罐上发酵8 d时，阿维拉霉素产量较出发菌株提高76.86%。本研究的开展为后续阿维拉霉素发酵工艺理性优化提供了参考。
2024,40(6):1882-1894, DOI: 10.13345/j.cjb.230606
摘要：
1,4-环己烷二甲胺(1,4-cyclohexanedimethylamine, 1,4-BAC)作为重要的生物基材料单体，被广泛应用于有机合成、医药、化工和材料等多个领域。目前主要采用化学法合成，存在金属催化剂价格昂贵、反应条件苛刻和安全隐患等问题，亟须寻找更环保的合成替代方法。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)来源的转氨酶(transaminase, EcTA)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, ScGlu-DH)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)来源的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, CbFDH)成功构建了双菌三酶级联转化1,4-环己烷二甲醛生成1,4-环己烷二甲胺的路径。基于结构指导下的蛋白质工程改造，获得了有益突变体EcTAF91Y，其比酶活和kcat/Km较野生型分别提升了2.2倍和1.9倍。通过重组菌株的构建和反应条件的优化，在最优条件下40 g/L底物可生成(27.4±0.9) g/L产物，摩尔转化率为67.5%±2.1%。
1,4-环己烷二甲胺(1,4-cyclohexanedimethylamine, 1,4-BAC)作为重要的生物基材料单体，被广泛应用于有机合成、医药、化工和材料等多个领域。目前主要采用化学法合成，存在金属催化剂价格昂贵、反应条件苛刻和安全隐患等问题，亟须寻找更环保的合成替代方法。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)来源的转氨酶(transaminase, EcTA)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, ScGlu-DH)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)来源的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, CbFDH)成功构建了双菌三酶级联转化1,4-环己烷二甲醛生成1,4-环己烷二甲胺的路径。基于结构指导下的蛋白质工程改造，获得了有益突变体EcTAF91Y，其比酶活和kcat/Km较野生型分别提升了2.2倍和1.9倍。通过重组菌株的构建和反应条件的优化，在最优条件下40 g/L底物可生成(27.4±0.9) g/L产物，摩尔转化率为67.5%±2.1%。
2024,40(6):1895-1908, DOI: 10.13345/j.cjb.230785
摘要：
人源乳铁蛋白(human lactoferrin, HLF)是母乳中重要的营养成分，具有抗菌、消炎、提高机体免疫力等功能。本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) G601为宿主，对比了3种组成型(P21、P43和Pveg)和3种诱导型启动子(Pgrac100、PxylA和Ptet*)对HLF表达的影响，摇瓶发酵结果显示，启动子Ptet*驱动的HLF的表达量最高，为651.57μg/L；进一步对核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)和信号肽进行组合筛选，获得的RBS-信号肽组合RBS6-SPyycP促使HLF的总表达量提升至 1 099.87 μg/L，其中分泌至胞外的蛋白量为498.68 μg/L；为了提高蛋白的胞外分泌量，敲除细胞壁表面离子相关基因dltD，菌株HLF分泌产量达到637.28μg/L。本研究通过表达元件筛选与优化等策略成功实现了HLF在B. subtilis的分泌表达，为构建B. subtilis细胞工厂高效合成乳蛋白奠定了基础。
人源乳铁蛋白(human lactoferrin, HLF)是母乳中重要的营养成分，具有抗菌、消炎、提高机体免疫力等功能。本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) G601为宿主，对比了3种组成型(P21、P43和Pveg)和3种诱导型启动子(Pgrac100、PxylA和Ptet*)对HLF表达的影响，摇瓶发酵结果显示，启动子Ptet*驱动的HLF的表达量最高，为651.57μg/L；进一步对核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)和信号肽进行组合筛选，获得的RBS-信号肽组合RBS6-SPyycP促使HLF的总表达量提升至 1 099.87 μg/L，其中分泌至胞外的蛋白量为498.68 μg/L；为了提高蛋白的胞外分泌量，敲除细胞壁表面离子相关基因dltD，菌株HLF分泌产量达到637.28μg/L。本研究通过表达元件筛选与优化等策略成功实现了HLF在B. subtilis的分泌表达，为构建B. subtilis细胞工厂高效合成乳蛋白奠定了基础。
2024,40(6):1909-1923, DOI: 10.13345/j.cjb.230744
摘要：
半乳糖醇是一种稀少糖醇，广泛应用于食品工业与医药领域。工业上一般通过化学氢化法生产半乳糖醇，但反应条件苛刻、生产成本高、对环境不友好，亟须开发更有效的“绿色”生物合成技术。本研究挖掘了来源于黑曲霉(Aspergillus niger) CBS 513.88的木糖还原酶(Aspergillus niger xylose reductase, AnXR)，该酶属于NADPH依赖的醛酮还原酶家族。对AnXR的酶学性质进行研究，发现其最适温度和pH分别为25 ℃和8.0。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘细胞，利用基因重组技术敲除半乳糖激酶(galactokinase, GAL1)基因，使得宿主细胞对半乳糖的分解代谢利用大幅降低，并在此底盘菌株中引入AnXR基因构建了催化d-半乳糖生成半乳糖醇的工程菌株。对工程菌株全细胞转化的条件进行优化，半乳糖醇的最高产量达到12.10 g/L。同时，该菌株对其他单糖的还原能力也进行了测试，可生成木糖醇、阿拉伯糖醇等功能性糖醇。利用本研究构建的工程菌株可以实现半乳糖醇等多种功能糖醇的高效生物转化，对稀少糖醇的绿色制造具有借鉴意义。
半乳糖醇是一种稀少糖醇，广泛应用于食品工业与医药领域。工业上一般通过化学氢化法生产半乳糖醇，但反应条件苛刻、生产成本高、对环境不友好，亟须开发更有效的“绿色”生物合成技术。本研究挖掘了来源于黑曲霉(Aspergillus niger) CBS 513.88的木糖还原酶(Aspergillus niger xylose reductase, AnXR)，该酶属于NADPH依赖的醛酮还原酶家族。对AnXR的酶学性质进行研究，发现其最适温度和pH分别为25 ℃和8.0。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘细胞，利用基因重组技术敲除半乳糖激酶(galactokinase, GAL1)基因，使得宿主细胞对半乳糖的分解代谢利用大幅降低，并在此底盘菌株中引入AnXR基因构建了催化d-半乳糖生成半乳糖醇的工程菌株。对工程菌株全细胞转化的条件进行优化，半乳糖醇的最高产量达到12.10 g/L。同时，该菌株对其他单糖的还原能力也进行了测试，可生成木糖醇、阿拉伯糖醇等功能性糖醇。利用本研究构建的工程菌株可以实现半乳糖醇等多种功能糖醇的高效生物转化，对稀少糖醇的绿色制造具有借鉴意义。
2024,40(6):1924-1934, DOI: 10.13345/j.cjb.230792
摘要：
橘烯(valencene)是一种带有柑橘香气的高值倍半萜类化合物，被广泛应用于食品、化妆品等行业，以及工业合成圆柚酮。本研究在酿酒酵母基因组中鉴定到了16个位于基因间区(intergenic region, IGR)的基因组位点，利用CRISPR-Cas9技术，将Ypet表达盒整合到不同的基因组位点，整合成功率高达87.50%，不同插入位点之间的表达差异达1.91倍。研究显示，位置效应在基因表达中相对稳定，基本不受启动子和报告基因变更的影响。之后筛选高效表达的元件组合PTDH3-TPRC1，在优选的整合位点迭代整合来自阿拉斯加黄扁柏(Callitropsis nootkatensis)橘烯合成酶(VSm)，橘烯产量提升至254.67 mg/L。过表达多个拷贝的关键基因tHMG1-ERG20，橘烯的产量提高了93.49%。所得工程菌株L-13在3 L发酵罐中进行2阶段补料分批发酵能够生产橘烯9 530.18 mg/L，相较出发菌株提高了近100倍，展现了筛选出的基因组位点在橘烯生产优化过程中的潜力。
橘烯(valencene)是一种带有柑橘香气的高值倍半萜类化合物，被广泛应用于食品、化妆品等行业，以及工业合成圆柚酮。本研究在酿酒酵母基因组中鉴定到了16个位于基因间区(intergenic region, IGR)的基因组位点，利用CRISPR-Cas9技术，将Ypet表达盒整合到不同的基因组位点，整合成功率高达87.50%，不同插入位点之间的表达差异达1.91倍。研究显示，位置效应在基因表达中相对稳定，基本不受启动子和报告基因变更的影响。之后筛选高效表达的元件组合PTDH3-TPRC1，在优选的整合位点迭代整合来自阿拉斯加黄扁柏(Callitropsis nootkatensis)橘烯合成酶(VSm)，橘烯产量提升至254.67 mg/L。过表达多个拷贝的关键基因tHMG1-ERG20，橘烯的产量提高了93.49%。所得工程菌株L-13在3 L发酵罐中进行2阶段补料分批发酵能够生产橘烯9 530.18 mg/L，相较出发菌株提高了近100倍，展现了筛选出的基因组位点在橘烯生产优化过程中的潜力。
2024,40(6):1935-1949, DOI: 10.13345/j.cjb.230735
摘要：
植物合成生物学在植物天然产物的发掘制造方面具有明显的理论优势，但因缺乏高效的底盘系统及相关使能技术，其对生物合成领域的贡献有限。最常用的植物底盘——烟草由于操作周期长、改造难度大、代谢及纯化背景复杂、烟碱毒性和农业生产难精准控制等问题，而烟草悬浮细胞底盘体系可有效解决上述问题。本研究旨在开发出生长快速、生物量高、分散度好、转化效率高、烟碱含量极低并具备较高科研价值及工业化潜力的烟草悬浮细胞底盘。选取分子技术高适用性的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，诱导获得的悬浮细胞NBS-1生长迅速、分散性好，最高生物量可达到476.39 g/L (鲜重)，各项参数均远超常用的烟草BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow 2)细胞系。常用的pEAQ-HT高效瞬时表达系统在NBS-1中的转化表达效率可达81%，远高于BY-2。利用转录组数据对BY-2和NBS-1的代谢特征及偏好性进行分析，发现NBS-1的黄酮类等化合物合成通路基因的表达显著高于BY-2，且NBS-1的生物碱合成通路基因的表达显著低于BY-2，并通过代谢物含量测定实验验证了该分析结果，表明NBS-1极低烟碱含量的同时，为该底盘对应产品的选择提供参考。综上，本研究开发出的生长转化优异、黄酮类含量较高且烟碱含量极低的本氏烟草悬浮细胞底盘NBS-1，对于开发烟草悬浮细胞底盘有重要指导意义。
植物合成生物学在植物天然产物的发掘制造方面具有明显的理论优势，但因缺乏高效的底盘系统及相关使能技术，其对生物合成领域的贡献有限。最常用的植物底盘——烟草由于操作周期长、改造难度大、代谢及纯化背景复杂、烟碱毒性和农业生产难精准控制等问题，而烟草悬浮细胞底盘体系可有效解决上述问题。本研究旨在开发出生长快速、生物量高、分散度好、转化效率高、烟碱含量极低并具备较高科研价值及工业化潜力的烟草悬浮细胞底盘。选取分子技术高适用性的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，诱导获得的悬浮细胞NBS-1生长迅速、分散性好，最高生物量可达到476.39 g/L (鲜重)，各项参数均远超常用的烟草BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow 2)细胞系。常用的pEAQ-HT高效瞬时表达系统在NBS-1中的转化表达效率可达81%，远高于BY-2。利用转录组数据对BY-2和NBS-1的代谢特征及偏好性进行分析，发现NBS-1的黄酮类等化合物合成通路基因的表达显著高于BY-2，且NBS-1的生物碱合成通路基因的表达显著低于BY-2，并通过代谢物含量测定实验验证了该分析结果，表明NBS-1极低烟碱含量的同时，为该底盘对应产品的选择提供参考。综上，本研究开发出的生长转化优异、黄酮类含量较高且烟碱含量极低的本氏烟草悬浮细胞底盘NBS-1，对于开发烟草悬浮细胞底盘有重要指导意义。
2024,40(6):1950-1962, DOI: 10.13345/j.cjb.230631
摘要：
针对生物工程类专业制造工艺学习传统模式中存在的问题，本文阐述了“重组人红细胞生成素制造工艺虚拟仿真实验”课程的建设与实践过程。以重组人红细胞生成素药物为载体，将现代生物制造技术与三维信息技术高度融合。阐述了课程的教学理念、教学目标、教学内容、实施方式及实验方法和实验交互性操作步骤及考核标准。以学生为中心，创新实验方案设计、教学方法和评价体系，培养学生分析问题、解决复杂生物医药工程实际问题的能力，拓宽学生的思路和视野。
针对生物工程类专业制造工艺学习传统模式中存在的问题，本文阐述了“重组人红细胞生成素制造工艺虚拟仿真实验”课程的建设与实践过程。以重组人红细胞生成素药物为载体，将现代生物制造技术与三维信息技术高度融合。阐述了课程的教学理念、教学目标、教学内容、实施方式及实验方法和实验交互性操作步骤及考核标准。以学生为中心，创新实验方案设计、教学方法和评价体系，培养学生分析问题、解决复杂生物医药工程实际问题的能力，拓宽学生的思路和视野。
2024,40(6):1963-1971, DOI: 10.13345/j.cjb.230576
摘要：
工业生物技术被认为是推动工业可持续发展最有希望的技术。合成生物学的发展为工业生物技术的进步带来了新的机遇同时创造了无限可能。发酵工程是所有生物技术产业化实现的抓手和落脚点。为进一步建立与发酵工程学科相匹配的合成生物学教学体系，教学团队优化了教学内容，创新了教学模式，突出了教学特色(发酵故事讲述培养工匠精神、生物经济教育强化工程化思维和生物伦理与安全教育培育担当精神)，并对本课程教学改革进行了总结和展望。通过教学改革，合成生物学的研究生教学工作有望取得新的进展，为相关领域的合成生物学教学提供参考，同时为工业生物技术的发展(加强生物制造创新能力，培育生物经济新动能)提供人才培养的保障。
工业生物技术被认为是推动工业可持续发展最有希望的技术。合成生物学的发展为工业生物技术的进步带来了新的机遇同时创造了无限可能。发酵工程是所有生物技术产业化实现的抓手和落脚点。为进一步建立与发酵工程学科相匹配的合成生物学教学体系，教学团队优化了教学内容，创新了教学模式，突出了教学特色(发酵故事讲述培养工匠精神、生物经济教育强化工程化思维和生物伦理与安全教育培育担当精神)，并对本课程教学改革进行了总结和展望。通过教学改革，合成生物学的研究生教学工作有望取得新的进展，为相关领域的合成生物学教学提供参考，同时为工业生物技术的发展(加强生物制造创新能力，培育生物经济新动能)提供人才培养的保障。
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摘要：
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
摘要：
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
摘要：
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
摘要：
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
摘要：
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
摘要：
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
摘要：
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
摘要：
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
摘要：
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
摘要：
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
2023,39(10):4275-4294, DOI: 10.13345/j.cjb.230297
摘要：
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
摘要：
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
摘要：
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
摘要：
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
摘要：
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
摘要：
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
摘要：
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
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