黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达

摘要:

将黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOD)基因重组进大肠杆菌酵母穿梭质粒Ppic9，转化甲基营养酵母Pichia pastoris GS115，构建出GOD的高产酵母工程菌株。在酵母αFactor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下，黑曲霉GOD在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外，经甲醇诱导3～4d，发酵液中的GOD活力可达30～40u/mL。SDS-PAGE证实GOD在培养物上清中的含量显著高于其它杂蛋白，约占胞外蛋白总量的60%～70%，经Q SepharoseTMFast Flow离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母GOD比活达426.63u/mg蛋白，是商品黑曲霉GOD的1.6倍。动力学性质分析表明，重组酵母GOD的K_m和K_cat分别为38.25mmol/L和3492.66s-1，与商品黑曲霉GOD相比，具有更高的催化效率。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。

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