大肠杆菌中青霉素G酰化酶成熟的限制性因素

摘要:

为了研究大肠杆菌中青霉素G酰化酶 (PenicillinGacylase ,PAC)成熟的限制性步骤 ,分别构建了PAC表达质粒pKKpacSP ,pETpacSP ,并将它们在大肠杆菌宿主中表达。通过酶活性的测定及Westernblotting分析 ,分别在PAC自身表达系统 ,Tac ,T7及氧调控表达系统中 ,研究PAC前体蛋白加工成α亚基、β亚基的效率及亚基折叠组装形成活性酶的能力。结果表明 :PAC成熟过程中的限制性步骤因宿主 载体系统而异 ;PAC本身表达系统中 ,前体肽加工成α亚基、β亚基的效率为 57.2 % ,亚基组装能力为 0.72;Tac启动子表达调控系统中α亚基的折叠和稳定成为限制性步骤 ;T7及氧调控表达系统中 ,PAC前体肽加工成α亚基、β亚基的效率达 90 %左右 ,亚基组装成活性酶的能力分别为 1 82 ,2 ;低氧调控系统表达PAC时 ,成熟的效率最高 ,PAC表达的单位重量活性提高 10倍.

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