苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

摘要:

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株，以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针，进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因，均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体，建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7，获得了相应的工程菌BMB8901-171，BMB8902-171，BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了，营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性；其中对小菜蛾的毒力最高，LC₅₀值分别为28.6，31.6，45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。 

Abstract: