摘要:探讨了人类肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)生物活性部分在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达。由于TRAIL活性部位区第149150氨基酸含有一个Kex2位点，根据Pichia pastoris分泌表达的特点，对149位氨基酸进行了改造，使其编码的氨基酸由Arg突变为Lys。这样使TRAIL在分泌的过程中不被Kex2切割，保证了片段的完整。序列分析正确后，将编码TRAIL的可溶区的基因片段插入到酵母表达载体Ppic9k中，使之位于α因子信号肽下游，且与之同框，构建分泌型表达载体Ppic9kTRAIL。采用原生质体法将重组质粒转化Pichia pastoris菌株GS115，获基因工程菌株Pichia pastoris(Ppic9k-TRAIL)。将工程菌用甲醇诱导培养3～4d，对摇瓶发酵的培养上清进行SDS-PAGE、Western blot分析和体外生物活性检测，结果发现发酵液中分子量约为19kD和38kD的蛋白质能被TRAIL多克隆抗体特异性识别，且具有在体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。通过薄层扫描分析显示目的蛋白最高可占可溶性总蛋白的36%。上述实验结果表明，在Pichia pastoris中表达的TRAIL能以寡聚体的形式存在并且具有生物学活性。
