HRCA技术在转基因植物检测中的应用

摘要:

超分支滚环扩增技术（Hyperbranched rolling cycle amplification, HRCA）在近几年中逐渐引起人们的注意，并越来越多的用于基础研究和实际检测中。在本文中我们对该技术在转基因植物检测中的应用情况作了较全面的探索；根据4种转基因植物中常用的外源基因或DNA片段设计了4条锁式探针（Padlock probe），利用质粒pKK2328中的一段序列作为锁式探针中的共同连接部分，并根据该共同的连接部分序列设计一对通用的HRCA引物；利用同位素标记的锁式探针对HRCA反应中的连接一步的特异性研究表明，只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中时，锁式探针才能被有效地进行连接，从线性分子变为环型分子，在没有相应靶DNA存在时锁式探针仅以线性形式存在；连接时间的研究表明，如果所检测的靶DNA是质粒或较短的DNA片段时，较短的连接时间（5～10min）就可以取得理想的最终检测效果,如果检测的靶DNA是复杂的植物基因组DNA时，连接时间需要较大程度的延长（30～60min）才能取得理想的最终检测结果；HRCA的反应时间研究表明,较长的反应时间可以明显增加最终产物的量；对Bst DNA聚合酶大片段酶用量的研究表明，在其它条件不变的情况下酶的用量可以在较大的范围内变化（0.5u～4u）而不影响最终检测结果；在上述研究的基础上，对转基因烟草进行实际检测，取得了与预期一致的理想结果。为了提高检测效率，仿效复合式PCR（Multiplex PCR，MPCR）的原理采用复合式HRCA（Multiplex HRCA, MHRCA）方法对转基因烟草进行检测，并利用反向点杂交进行结果分析，取得同预期完全一致的结果。我们的研究表明HRCA方法完全可以用于转基因植物的检测，而且其使用比MPCR技术更方便，效率更高。

关键词:HRCA， 锁式探针， 转基因植物

Abstract:

Key words:HRCA， 锁式探针， 转基因植物