人DNA 拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

摘要:

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ（hTopo Ⅰ）为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选，用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达，表达产物可分泌到发酵上清，易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母（SMD-hTopoI）分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母（X33-hTopoI和KMhTopoI）更高。通过发酵条件的优化，使用BMMY（pH 7.25），于20℃，每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液，SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力（43000u/mL），发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L，约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白，无糖基化修饰。

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