16S rDNA用作荧光定量PCR靶基因快速检测铜绿假单胞菌

摘要:

对20余种细菌16S rDNAs进行多序列比对与进化树分析，设计铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQPCR）特异性引物。提取PA基因组DNA，以特异性引物扩增16S rDNA靶片段，并构建重组质粒pMDTPfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板，用于建立定量标准曲线。以SYBR Green I荧光染料建立20μL反应体系，对不同浓度的PA DNA样品进行FQ-PCR检测。同时，以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照，验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示，设计的FQ-PCR引物的靶向序列，仅对PA 16S rDNA有高度同源性；FQ-PCR方法检测PA，其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或（2.1×10³ ± 3.1×10²）拷贝/μL的16S rDNA基因，并且具有很强的特异性；从细菌DNA提取到FQ-PCR检测，可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言，以16S rDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA，具有很好的研究价值与应用前景。

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