在变铅青链霉菌基因组中定域克隆外源DNA的置换性载体及通过反选择获得重组体的模式方法

摘要:

ΦHAU3^R是变铅青链霉菌66中对噬菌体ΦHAU3显示抗性的基因，已从基因组中获得分离。将基因组中邻近于该基因两侧的一个3.5kb和另一个3.8kb的DNA片段分别以其在染色体上的天然取向插入到一个由pIJ101衍生的质粒pIJ653上，构建成pHZ806。然后在pHZ806上对应于pIJ101复制子的区域中插入一个spc/str抗性基因，同时在3.5kb和3.8kb片段之间插入一个潮霉素抗性基因(hyg)，衍生出一个新质粒pHZ808。由于pHZ808中不具有完整的pIJ101复制功能区，所以它不能在链霉菌中复制。然而，在该质粒3.5kb和3.8kb片段之间插入的任何DNA片段，在导入到变铅青链霉菌中后都可借助于3.5kb和3.8kb两个片段与内源染色体的同源区域所发生的双交换而稳定地整入到内源染色体的特定区域(3.5kb和3.8kb片段之间)，同时置换出染色体上的ΦHAU3-R基因。发生了这种基因置换的重组子菌株会对噬菌体ΦHAU3变得敏感，这种反选择方法可用来浓缩和初选携带定域插入片段的重组子。已利用潮霉素抗性基因(hyg)作为一个模式基因片段阐明了这种载体和这种在染色体上定域克隆外源基因片段的方法学和适用性。同时，用pHZ808作载体克隆另外的基因片段时还有另一个优越性：hyg可作为报告基因一同参与外源基因片段的定域整合，携带插入片段的重组子除了对噬菌体ΦHAU3显示敏感性以外，还对潮霉素显示抗性。

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