摘要:代谢工程,也称途径工程,是基因工程一个重要分支,一般是多基因的基因工程,与细胞的基因调控、代谢调控和生化工程密切相关。讨论了代谢工程的应用,包括通过改变代谢流和代谢途径提高产量,改善生产过程,构建新的代谢途径和产生新的代谢产物等。

摘要:经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。

摘要:以小米(Setaria italica)为材料,克隆了含有叶绿体psbA基因的2.2kb EcoRⅠ片段,测定了该基因5＇末端非编码区的核苷酸序列。序列分析显示psbA基因5＇末端非编码区存在着与原核类似的启动子结构,其“-10”区的序列为TATACT,与原核生物“-10”共有基序(Consensus motif)仅相差一个核苷酸;其“-35”区的序列为TTGACA,与原核生物“-35”共有基序完全相同。另外,在“-10”区和“-35”区之间还存在着一个类似真核启动子结构的“TATATA”保守序列。这些结果表明小米psbA基因的启动子既具有原核的特征又具有真核的特征。小米psbA基因的mRNA前导序列长87bp,与高粱完全一致,而比水稻多出了“CTATTTT”7个核苷酸,比小麦、大麦和黑麦多出了“TTTT”4个核苷酸。因此推测在禾本科的C_3和C_4植物之间,psbA基因mRNA前导序列区的差异可能具有普遍性。计算机分析结果显示,以上6种植物的psbA基因mRNA前导序列区内均能形成小的茎环结构,而且这段“CTATTTT”额外序列恰好位于茎环结构中,造成了6种植物间茎环大小的差异。这一小的二级结构可能对psb…

摘要:通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。

摘要:利用聚合酶链式反应和寡核苷酸介导的定向诱变技术构建了白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素IL2-PE40、IL2-PE40KDEL、IL2-PE66~(4Glu)和IL2-PE66^4GluKDEL融合基因的原核表达重组质粒,并实现了高效表达,表达产物占菌体总可溶蛋白的20％～30％。此外,由于这一表达质粒在IL-2cDNA与PE基因连接处引入了唯一的SmaⅠ位点,其5＇、3＇端分别含有唯一的EcoRⅠ、PstⅠ位点,因此可方便地用其它基因替换IL-2或PE基因而获得相应融合蛋白的表达质粒。

摘要:通过体内外基因重组,将大肠杆菌粘附因子cs3基因定位整合到痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32菌染色体的asd基因内,使asd基因灭活;将来内O抗原基因克隆至无抗药性表达载体pXL378,获得重组质粒pXL390,将其转化asd^-的T32受体菌,构建成福氏2a和宋内双价苗苗株FS01。实验表明:重组质粒pXL390在不带任何抗菌素基因的情况下,在asd-的T32受体菌内是稳定的。FS01株遗传稳定,能表达两种痢疾菌的PLS-O抗原,无明显毒性作用。动物试验表明,以FS01株皮下免疫的小鼠对福氏2a和宋内有毒株的腹腔攻击有100％的保护。

摘要:F质粒的第五个EcoRⅠ片段mini-F具有质粒的分配功能。其EcoRⅠ-BamHⅠ片段含有oriS、ccd、repD和sop基因(sopA,B和C)。该片段与pBR322重组,得到质粒pDMC32。pDMC32经SmaⅠ酶切,T4连接酶连接,得到衍生质粒pDMC311,消除了oriS、ccd和repD片段。MI32(pDMC32)和MI311(pDMC311),在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率分别为93％和100％。而对照MIR322(pBR322)培养55代时,质粒保持率仅为10％。带有色氨酸启动子质粒pDR720与pBR322重组,得到质粒pDMC40。pDMC40再与mini-F的sop基因重组,得到带有sop基因的稳定表达质粒pDMC48。MI48(pDMC48)在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率为100％。

摘要:研究了一种用醇类有机溶剂处理法从酵母菌中选择性地释放超氧化物歧化酶(SOD)的方法。当采用异丙醇浓度为90％,浸泡120min,抽提缓冲液为50mmol/L磷酸盐缓冲液(Ph7.0)时,抽提20h,SOD释放的活力为300u/ml,杂蛋白释放量最少,SOD比活达300u/mg。SOD释放率可达90％,和传统的超声波法和机械法相比,而比活提高了25倍。这种方法不需要任何复要设备,操作简单,成本低廉,在释放SOD同时,可达到初步纯化SOD的效果。

摘要:动物细胞培养用生物反应器设计和放大的关键问题是细胞破损与供氧和混合的矛盾,在分析细胞破损机理基础上,提出了动物细胞培养生物反应器的设计原理——设计模型和有关设计条件,从而清楚地确立了细胞死亡速度与培养基组成、反应器设计和操作参数间的定量关系,以及反应器设计应遵循的保证细胞生长和满足传质要求的条件。还对强化传质和抑制细胞破损这一矛盾作了简要分析和讨论。

摘要:由近红外光谱证实,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/正己醇-正辛烷反胶束溶液是牛血清白蛋白(BSA)增溶于非极性有机溶剂的较理想中介。研究了反萃液酸度、离子强度和种类等参数对BSA反萃率的影响,过低的溶液酸度导致BSA变性。适宜的反萃液为:1.0～2.0mol/L KBr,pH4.3～4.9。蛋白质的紫外光谱表明,BSA分子在料液,反胶束溶液和反萃液中的构象大致相同。此外,探讨了反胶束溶液循环使用的效率问题。最后,通过采用适当的相比,成功地实现了蛋白质的回收和浓缩。

摘要:微载体是动物细胞高密度培养的有效手段。首先在硅化的方瓶中对Cytodex 1、Cy-todex 3、Biosilon、Bellco Glass Microcarrier、CT-1、CT-3、MC-1、CT-28种国产和进口微载体进行了比较和筛选。确定以Biosilon作为Vero细胞高密度培养的首选微载体。用500mlWheaton搅拌瓶探索影响Vero细胞高密度培养的条件,表明50～60mg/ml的微载体浓度、1～2×10⁶/ml的细胞接种密度、适当的通气(95％O_2+5％CO₂)对该细胞的高密度培养具有重要意义。在200ml培养体积的Wheaton搅拌瓶中,微载体浓度为50～60mg/ml,细胞接种密度为9.24×10⁵/ml,搅拌速度为65～85r/min,经25d培养,Vero细胞密度可达2.34×10⁷/ml,表明50～60mg/ml的微载体浓度对培养细胞没有毒性。接着在1.5L CelliGen生物反应器中进行培养,细胞接种密度为4.98×10⁵/ml,培养体积为1.2L,日灌流量从0.20L逐渐加大到3.65L,经22d连接灌流培养,最终细胞密度可达2.05×10⁷/ml。

摘要:利用PCR技术,以黑曲霉糖化酶高产株T21的基因组DNA为模板合成了糖化酶基因5＇端上游850bp的非编码区,并作了序列测定。将该合成片段与细菌潮霉素磷酸转移酶结构基因融合建成表达质粒,转化黑曲霉,获得了高潮霉素抗性转化子,证实该合成片段具有丝状真菌启动子功能。抗性转化子的Southern分析表明,潮霉素磷酸转移酶基因已整合到受体黑曲霉的基因组DNA中。

摘要:利用已克隆的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),构建了一批复制类型和抗生标记不同的vgb表达载体,并就vgb基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明vgb基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至20％饱和度时迅速合成。Vgb基因的表达产物(Vitreoscilla Hemoglogin,VHb)可促进青霉素酰化酶和TNF、IL-2等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于vgb基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发酵过程中溶氧控制裕度。这些实验结果预示着vgb基因在耗氧生物过程中,如抗生素工业和基因工程菌高密度发酵,有着良好的应用前景。

摘要:利用PCR突变方法,改造了人白细胞介素-3(hIL-3)cDNA,在成熟蛋白编码顺序5＇端前突变入了XbaⅠ酶切位点和酵母类胰蛋白酶加工位点Lys-Arg的密码子。改造后的hIL-3cDNA插入大肠杆菌-酵母穿梭质粒pVT102u/α,使其准确融合于α-交配因子前导序列之后,并置于启动子ADH1调控之下。转化入酿酒酵母宿主菌S-78筛选后,30℃培养48h,上清能明显促进hIL-3依赖细胞TF-1生长。上清中分泌表达的hIL-3经ELISA鉴定并定量,其表达量大于1.0mg/L。³H-TdR掺入法测定上清中hIL-3活性为1.8×10³u/ml。

摘要:由固定化脲酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶的复合酶膜组成的双电极系统,可以同时测定尿素氮和葡萄糖的含量,每次进样量为25μl,20s即可测定出尿素氮和葡萄糖的含量。在0～60mg/dl尿素氮、0～500mg/dl葡萄糖范围内具有良好的线性关系。连续测定20次的变异系数分别为1.02％和1.05％。酶膜使用寿命为两星期以上。此仪器可广泛应用于临床检验和体育训练中。

摘要:以颗粒活性炭(GAC)为吸附剂,采用多柱串联流化床进行味精中和液脱色,对柱过程进行了模拟研究。测定了平衡数据、传质动力学及流体流动参数,建立了具有广泛适应性的,包括颗粒分级、粒度分布、内外扩散及两相返混的宽粒度液固流化床吸附过程模型。对所研究体系的模拟计算与实验结果符合较好。

摘要:通过对固定化Gluconobacter oxydans和Bacillus cereus的活细胞系统的研究,提出了固定化细胞不均匀分布模型,将此类分布与均匀分布(最劣分布模型)进行比较,分析了它们对固定化细胞内部的基质浓度分布、有效速率因子和选择率的影响,指出不均匀分布和均匀分布对于该固定化活细胞系统的动力学行为无显著影响,这一模型分析结果在实验中得以验证。通过无因次化分析,建立了适用于固定化生物催化剂动力学研究的模型方法。

摘要:土壤的盐碱性是世界许多地区限制植物生长和作物产量的主要制约因素。长期的研究发现:在高盐或干旱环境下,大多数植物在细胞质中开始积累一些低分子量的代谢物,如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等。这些物质通过维持高的细胞质渗透压,有利于植物在高盐或干旱条件下的水分吸收。通过基因工程手段,影响或改变植物体内的生理代谢途径,使得植物细胞产生和积累不同的低分子量有机化合物,能够

摘要:植物病毒侵染宿主植物的一个重要过程是通过它在宿主体内的转移和传播,产生病害。植物病毒在宿主体内的转移主要有两种方式,一种是通过植物维管组织进行的系统转移,另一种是植物病毒在宿主细胞之间的转移,这种转移是通过植物细胞的胞间连丝实现的。实验表明,病毒自身编码的一种蛋白参与了这个转移过程,对烟草花叶病毒(TMV)而言,这种蛋白就是分子量为30kDa的运动蛋白。

摘要:速用压榨酵母(Compressed yeast,CY)和活性干酵母(Active dry yeast,ADY)是用于面点制作的主要两类酵母产品。发酵力则是其共同质量指标。目前,国产压榨酵母的发酵力波动很大,活性干酵母不仅发酵力低,而且保质期短。面包酵母的发酵力定义为由一定数量的酵母样品,面粉和水制成的面团在恒温下产生CO_2的能力。本文采用Burrows法测量面包酵母发酵力,面团由0.15克干酵母,20克面粉和15mol脱离子水混合而成，并以该面团在30℃、180min内产生的CO₂总量作为发酵力的表征，文献^[2]表明，面包酵母的发酵力与终细胞群体中的带芽细胞分率(Fraction of budding cells,FBC)有密切的关系，传统的概念是，为提高酵母产品质量，FBC越低愈好。经研究发现，压榨酵母的耐贮存力及活性干酵发酵力与FBC成反比，但对速用压榨酵母而言，其发酵力FBC的正相关关系甚为明显，这与传统有着根本的差异。

摘要:等电聚焦是利用蛋白质分子或其它两性电解质分子的等电点不同,在一个连续、稳定、线性的pH梯度中进行蛋白质分析分离的技术。薄层凝胶等电聚焦具有高分辨率,但上样量小,聚焦后样品分析处理不便,仅局限于分析。循环自由流液相等电聚焦以液体循环流动代替固相载体,上样量大,聚焦后样品分析处理方便,有较大的制造潜力。Bier等已开展这项技术的研究。该技术应用到遗传工程上可对干扰素等进行精制纯化^[3]。本实验应用循环自由流等电聚焦仪(Recycling free-flow isoelectric fo-cusing,RIEF)进行了pH梯度的建立、模型化合物的分离、相关参数的比较，并被步应用于生物活性蛋白的精制和活性回收，旨在为遗传工程产品下游工艺提供一种新型而行之有效的方法。

摘要:国外有许多利用微载体培养各种贴壁细胞的报道。鸡胚细胞(CEF cells)是最早用于体外培养的细胞之一,用它可生产多种鸡的疫苗,如法氏囊、新城疫、马立克疫苗等。我国生产上多采用滚瓶法,近年来才有微载体法培养的探索。要进行细胞的大规模培养,转瓶是有效的模拟,可以模拟生物反应器培养的一些条件，为放大作准备。本文模拟生物反应器的培养条件，用500ml转瓶（装液200ml）研究了鸡胚细胞在徽栽体上巾壁和生长的规律，为放大培养作了准备。

摘要:固定化细胞和固定化酶一样,作为固液两相的非均相催化反应系统,其反应速度无疑受到内外扩散的影响。世界各国的化学工程学者在固定化酶反应动力学方面研究得较多,固定化细胞反应动力学研究虽有些报道,但主要集中在以海藻酸钙为载体的固定化系统,且载体形状为球形颗粒。对于其他材料的不同形状颗粒载体的固定化细胞动力学研究报道较少。陶瓷作为固定化细胞载体是我们研究的一种固定化细胞的新型载体，在机械强度，孔径大小，细胞与之结合牢固度及其稳定活性，再生性能方面有其特有的优越性^[10]。为了给在生产实践中使用这种新型载体提供理论依据，本文采用球型陶瓷和拉西环陶瓷为载体固定化酵母，对它们的发酵动力学进行了比较研究。

摘要:目前应用酶或微生物细胞作为分子识别元件构建生物传感器测定谷氨酸含量的研究引起了广泛的兴趣,并陆续有实例报道。在这些报道中人们依据不同的酶催反应选择相应的离子选择性电极,如CO₂电极、NH₄⁺电极等,而测量对象有直接的测定谷氨酸,也有测定谷氨酸单钠的间接测定法。本文选用了可固定大量细胞的固定化细胞柱与流动注入法相结合的测量方法,并根据细胞柱的动力学模型分析动态响应曲线，计算测量结果，提高了测量精度，扩大了测量范围。