摘要:运用分子生物学技术对微生物来源的酶进行分子改性和人工进化在过去几年中取得了令人瞩目的进展。本文综述了用于酶分子改性和人工进化的主要分子生物学方法，如易错PCR技术、DNA体外随机拼接技术等及其在酶的分子进化和改性中应用成就。

摘要:木糖醇在食品、医药及化工行业中有着广泛的用途而深受关注。但是，传统的化学法生产木糖醇需要一系列复杂的分离纯化步骤，过高的生产成本限制了木糖醇的使用范围。发酵工艺生产木糖醇无需木糖的纯化步骤，是取代化学合成法的一条可行工艺路线。本文着重介绍产木糖醇的微生物，酵母对木糖的同化途径，半纤维素水解物的脱毒方法，影响木糖醇发酵的工艺条件等。

摘要:通过分析Pichia pastoris的28个蛋白编码基因的同义密码子使用情况并计算该酵母的密码子用法，首次确定出P.pastoris的19个高表达优越密码子。这些结果经与已知的Saccharomyces cerevisiae及Kluyveromyces lactis的密码子用法基本相似，但在氨基酸谷氨酸的密码子选择上截然相反，提示这可能属于P.pastoris所偏爱的密码子用法。

摘要:抽提中华眼镜蛇毒腺总RNA，通过反转录PCR扩增Cobrotoxin cDNA,克隆并测序。该cDNA编码83个氨基酸，包括21个氨基酸的信号肽和62个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白的氨基酸序列和通过蛋白测序从台湾眼镜蛇鉴定的Cobrotoxin完全一致。PCR扩增编码Cobrotoxin的DNA，并亚克隆到表达载体pMAL-P₂。此外，通过合成寡核苷酸片段，拼接成完整的CM11基因，并将其克隆至pMAL-P₂。经IPTG诱导，两种神经毒素基因在大肠杆菌中都得到高效的可溶性融合表达。表达产物通过SDS-PAGE和蛋白印迹杂交加以鉴定。表达的融合蛋白经过Sepharose 6Bamylose亲和色谱和DEAESepharose FF离子交换色谱得到有效纯化。经Xa因子酶切后得到的两种重组神经毒素都具有小白鼠体内毒性。

摘要:利用PCR扩增得到粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段，将其分别克隆至pGEM-T，构建成GMCSF/IL-3融合蛋白基因，DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆至T7RNA聚合酶表达载体pT7zz，得到表达质粒pFu，经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴定扫描分析，目的基因产物表达量占菌体总蛋白量的30%以上，目的基因表达产物以包涵体的形式表达。Westernblot鉴定表明，该表达产物可以与GM-CSF抗体及IL-3抗体特异性结合。目的基因表达产物经过包涵体变性、透析复性及柱层析纯化，用GM-CSF、IL-3依赖细胞株TF-1检测，具有明显的生物学活性。

摘要:以人HEL细胞总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增了人促血小板生成素受体c-Mpl编码区全长1.9kb cDNA，测序结果表明与已报道的序列一致。然后构建了c-mpl的pcDNA3表达载体pcMPL，转染不表达cmpl的K562细胞后，经G418抗性筛选，Northern blot和Southern blot检测证实获得稳定表达cmpl的细胞株。为进一步研究cMpl的生物学功能提供有用的实验材料。

摘要:应用水稻稻瘟病抗性基因Pid(t)紧密连锁的微卫星标记RM262对含有该抗病基因的品种地谷与感病品种江南香糯和8987的杂交F2群体进行遗传分析和抗性鉴定，结果表明，RM262的PCR扩增物在抗、感品种之间的多态性较好；在2个F2群体中，RM262和抗病基因间的重组率分别为5.74%和8.17%，应用该标记的抗性纯合和杂合带型选择抗性植株，其准确率可达98%以上。此外，还就分子标记辅助育种进行了讨论。

摘要:以人胎肝为材料，通过RT-PCR的方法扩增出人促红细胞生成素受体(hEpoR)的胞外区基因。将获得的成熟受体胞外区基因起始密码子改构后克隆到原核表达载体pBV220中，进行原核温控诱导表达。表达产物经蛋白N端测序及Western-blot实验证实表达产物是hEpoR胞外区蛋白。利用上罐发酵培养获得的包涵体蛋白经复性纯化后，体外生物学活性检测表明表达产物可特异地抑制TF-1细胞在Epo刺激下的生长，证实了复性表达产物具有人促红细胞生成素受体胞外区结合Epo的生物活性。

摘要:对以霍乱毒素B亚基为载体蛋白的重组疟疾多价抗原在小鼠及恒河猴中的免疫原性及对相应疟原虫感染的免疫保护作用进行了研究。结果表明：该抗原免疫小鼠后，对约氏疟子孢子攻击的保护率在50%左右；恒河猴免疫后用1×10⁸食蟹疟裂殖子攻击，对照组2只动物在攻击后4d感染，感染持续30d以上；免疫组2只动物中，两只动物在感染6～7d后完全恢复，且1只推迟3d感染，说明该抗原具有免疫保护作用。

摘要:利用带有氯霉素乙酰转移酶报道基因的检测载体，从痘苗病毒基因组DNA中筛选到一个增强子样片段VV16。序列分析表明，该片段长112bp，是痘苗病毒DNA依赖性RNA聚合酶、polyA聚合酶亚单位和DNA聚合酶基因RPO30的一部分，含有4个AT丰富区。采用带有β-半乳糖苷酶报道基因的载体检测发现，该片段正向可以增强报道基因表达9.0倍，反向可以增强报道基因表达4.1倍。RNA Dot blotting实验证实，它对基因的增强活性表现在转录水平上。DNA删切实验证实，5′端10bp及3′端12bp对其活性有重要调节作用，而该片段nt76～82的序列对增强子的活性至关重要。

摘要:用定点突变的方法研究S221C/P225A，N118S/S221C/P225A，D60N/S221C/P225A和Q103R/S221C/P225A突变对蛋白酶活性，酯酶活性与蛋白酶活性之比的影响。结果表明：S221C/P225A突变使蛋白酶活性比枯草蛋白酶E低73000多倍，酯酶活性与蛋白酶活性之比是Subtiligase的3倍；N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性和酯酶活性分别比S221C/P225A突变下降3.6倍和15倍，酯酶与蛋白酶活性之比下降4倍，同时增加变体酶的热稳定性；D60N/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体下降15倍，但对酯酶活性几乎没有影响，酯酶与蛋白酶活性之比增加14倍，分别是S221C/P225A突变体和Subtiligase的3.3倍和10.3倍；但是，Q103R/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体增加5倍，酯酶活性下降55倍，酯酶与蛋白酶活性之比下降1000倍。

摘要:报道重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(简称apPEP)的基因工程下游工艺研究。工程菌株E.coli BL21/pKKH\|PEP表达产物apPEP为可溶性蛋白，在NBS BioFlo 3000型5L自控发酵罐中经14h培养每升发酵液可达到22.5g干重菌体，含apPEP 3.0g左右。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后，依次经Sephadex G-25、High performance Q sepharose FF(HP\|Q)、Phenyl separose 6 FF柱层析分离纯化，每升发酵产物最终可得0.86g纯度达96%的重组apPEP，比活力达到65.5u/mg，整个纯化工艺的蛋白回收率为8.2%，活力回收率为24.4%。纯化的apPEP经电喷雾质谱测定分子量为76464±30D，N端氨基酸序列与基因序列推导的一致。等电点为pI6.0左右。与Aeromonas hydrophila来源的PEP(pI=5.5)相近。

摘要:以重组尿激酶原(pro-UK)为研究对象，构建了细胞表达载体，对不同细胞表达载体进行了较为系统的比较性研究。确定了所构建pro-UK三种载体的表达特性，成功建立了pro-UK哺乳动物细胞表达系统。重组Namalwa、Vero和Sp2/0细胞表达proUK的水平分别是200、12.5和50IU/(10.6 cell.24h)。亲和层析纯化pro-UK纯度在90%以上。免疫吸附溶酰胺测定表明CHO细胞表达pro-UK单链比例最低，而Vero和Namalwa细胞表达pro-UK单链比例最高。该研究对生产pro-UK时，选择更好的哺乳动物细胞表达系统具有重要的指导意义。

摘要:取人胎肺做原代培养细胞，PMA诱导后，利用RT-PCR技术，扩增出了去掉N端信号肽序列的IL-11cDNA；经序列分析表明，该序列与文献报道序列高度同源，仅3个核苷酸有变化，氨基酸序列完全一致。将此IL\|11cDNA克隆入硫氧还蛋白基因融合表达载体pTRXFUS的trxA基因3′末端，利用其3′端的蛋白肠激酶切点，构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量达20%以上。用IL-6依赖细胞株7TD1及MTT法测定生物学活性，达2.56×105 u/mL菌液，对融合蛋白进行了Western blot测定，并对表达条件作了初步研究。

摘要:基于Sf21昆虫细胞在悬浮培养过程中所表现出的生长代谢特征，提出以培养液中残糖浓度作为控制参数，并利用限制性基质(葡萄糖和蛋白水解物)的间歇补加技术调控细胞生长的方案。实际控制表明：与批培养相比，Sf21细胞在两种具代表性的昆虫细胞培养基(IPL-41和TC-100)中的生长期和稳定期都得到了有效的延长。TC-100培养液中最高细胞培养密度由3.0×10⁶ cells/mL提高到6.5×10⁶ cells/mL；IPL41培养液中最高细胞培养密度则由7.05×10⁶ cells/mL提高到9.0×10⁶cells/mL。由于限制性基质的间歇补加技术是利用较确定的营养成分来代替复杂昂贵的补料培养基，因此更适合于昆虫细胞的大规模高密度培养。

摘要:对催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯反应的脂肪酶(NOVO435、MML、LIPOLASE、PPL)和反应介质进行比较，得出最佳酶种为NOVO435，最佳介质为叔戊醇；同时对影响合成L抗坏血酸棕榈酸酯反应的初速度的因素(转速、温度、水分含量、酶浓度和底物浓度)进行了探讨，确定了最适反应条件：转速为200r/min，温度为55℃，水分含量为0，酶浓度为12.5%。

摘要:采用多孔聚酯泡沫固定里氏木霉，在鼓泡柱固定化反应器中同时产酶降解壳聚糖。结果表明通过控制降解时间可以得到不同平均聚合度的降解产物。在28℃，pH4.8，通气量3vvm条件下，利用固定化反应器，在30d内连续进行10批同时产酶降解试验，结果发现壳聚糖酶活力和壳聚糖降解率能保持稳定。每批产生的壳聚糖酶活力平均达到0.15u/mL以上，壳聚糖平均降解率为73%。

摘要:通过对WuT3杂交瘤细胞在静态和动态培养条件下的比较，发现细胞生长和代谢有很大不同。在静态培养条件下，细胞培养周期较长，细胞密度较高；但在动态培养条件下，细胞代谢更加旺盛，葡萄糖、氨基酸等营养物质的消耗加快，乳酸、氨、丙氨酸等代谢产物的比生成速率较大。

摘要:在碱性氧化铝作用下，云南红豆杉浸膏中7-表-紫杉醇被催化转化为紫杉醇。该异构化反应是由氧化铝表面L酸中心、碱中心的协同作用而催化，在室温条件下就可进行，氧化铝表面酸碱中心的种类和强度都将影响反应进行的程度，适量的甲醇对反应有促进作用。

摘要:当甘油发酵进入细胞指数生长期的中段时，对发酵体系在45℃下进行大约30 min的热冲击处理，这种处理可以显著提高发酵甘油的产率，但对细胞生长和残糖消耗的影响不大。

摘要:在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞，定期部分更换Cytopore多孔微载体，使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖，解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中，细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107/mL，活细胞比率维持在90%以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞，利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术，可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响，在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中，细胞最高密度为2.64×10⁷/mL，活细胞比率维持在95%以上。与稳压操作相比，利用周期变压刺激技术可提高产量10%～20%，且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率，利用4步纯化工艺，从含u-PA约135g的2100 L上清中获得约80guPA(单链比例约为90%)。

摘要:利用固定了产β-半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢杆菌，以乳糖为底物，在纤维床反应器中连续合成半乳糖寡糖(GOS)，最高得率为50.7%。在连续反应体系中，研究了底物浓度、pH、反应温度和停留时间对半乳糖寡糖合成的影响，确定最佳反应条件为底物浓度450 g/L、反应温度55℃、pH7.0、停留时间100 min。在连续反应24h后，流加1.5%的D-半乳糖能提高合成GOS的能力，固定化细胞反应体系中连续稳定操作120 h。

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