摘要:Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P₁，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。

摘要:将DNA错配修复基因mutS（2.56kb）克隆于分泌型原核表达载体pET32a（+）上，以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliAD494(DE3) 中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带，其表达量占全菌蛋白质的35％左右，且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni²⁺）配体亲和层析柱纯化目的蛋白，其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。

摘要:利用基因工程表达的方法，在大肠杆菌中通过与GST蛋白融合的方式高效表达了胸腺素α1前体基因，随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式，得到了胸腺素前体肽段31肽和N端未经乙酰化修饰的28肽。融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的35%～40%，样品肽的产量也达到了约200mg/L（肽/发酵液）的产量。经质谱测定，分子量分别为3366和3066。BalB/C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明，所构建的GSTTα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用，其中N端未经乙酰化的28肽产物与31肽产物活性相近，均对淋巴细胞具有明显的刺激增殖作用。

摘要:通过分步整合的方式，将人源性抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤（Pichia pastoris）酵母GS115菌株的染色体上，经甲醇诱导，成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段，表达量达50～80mg/L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析，纯化出了纯度较高的Fab产品。

摘要:PCR方法扩增乙肝病毒MHBs^t、HBx基因片段，构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBs^t和pcDNA3.1-HBx。PCR方法从肝细胞基因组中扩增出Galβ1,3GalNAc α2,3-唾液酸转移酶(ST3GalI)的启动子Psial，用Psial取代pEGFP-N1的启动子pCMV构建pEGFP-N1-Psial。利用磷酸钙DNA共沉淀的方法，将pcDNA3.1-MHBs^t、pcDNA3.1-HBx分别与pEGFP-N1-Psial瞬时共转染至正常肝细胞QGY-7701。流式细胞仪分析细胞平均荧光密度值发现，MHBs^t、HBx分别将ST3GalI启动子的活性上调了35.2%和43.8%。研究了乙肝病毒MHBs^t、HBx对ST3GalI的转录调控作用，对于揭示乙肝病毒感染与唾液酸转移酶之间的关系做了非常有益的探索。

摘要:TNF-α是一种在机体抗感染、抗肿瘤过程中发挥重要作用的细胞因子，其对机体具有保护和损伤两方面的作用，为了探讨新的抑制TNF-α所致炎症损伤等反应的手段，构建了细菌鞭毛递呈的随机肽库，利用构建得到的肽库，进行TNF-α特异性结合肽的筛选工作。经过5轮筛选及DNA测序，共得到6条小肽编码序列。其中2条序列中含有一V-N-WG的相同序列框架。进行6条序列与TNF-α结合力的确证后，选择了其中的4条肽序列进行人工化学合成、纯化及鉴定。利用L929细胞及MTT法对4条小肽进行活性测定，检测其对TNF-α的抑制活性。结果表明，在TNF-α对L929细胞毒性为30％左右时，含同源序列框架的2条肽可抑制90％左右的TNF-α活性。

摘要:以木霉为指示菌，小黑麦中饲237种子中的蛋白提取物经过分离纯化后，得到了3种主要的抗真菌蛋白组分，经酶活检测鉴定，分别是分子量为30.5 kD的ClassⅡ型几丁质酶，两种分子量为51kD和23 kD的β-1,3-葡聚糖酶。其中几丁质酶的最适反应pH为6.0，最适反应温度为37℃，测定的N末端氨基酸序列与大麦几丁质酶的有很高的同源性。在一定条件下，这3种蛋白组分都有较强的抗木霉活性，并且有明显的协同作用，同时它们对离体易感小麦叶片上白粉菌有很好的生长抑制作用。

摘要:从一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspergillus candidus)中克隆到了乳糖酶基因组DNA及cDNA序列(EMBL ACCESSION No. AJ431643)，序列分析表明，乳糖酶基因组DNA序列长3458bp，其中含有8个内含子，cDNA编码区长3015bp，共编码1005个氨基酸，前19个氨基酸为信号肽序列，氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将此基因与不同来源的乳糖酶基因序列进行比较发现，该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低。虽与米曲霉ATCC 20423的乳糖酶序列同源性较高，但其在酶学性质上更优于后者，亮白曲霉的乳糖酶基因可能是一个具有更广阔的生产应用前景的新基因。 

摘要:利用毕赤酵母表达系统表达芥菜几丁质酶基因BjCHI1及其两个衍生基因BjCHI2和BjCHI3，获得相应的蛋白质。经FPLC纯化后，测定了3种蛋白质的几丁质酶活性，发现它们均能降解CM-chitin-RBV和胶状几丁质。以CM-chitin-RBV为底物时的Km值分别为0.799mg/mL、0.544mg/mL和0.793mg/mL，差别甚微。而以胶状几丁质为底物时的Km值分别为0.281mg/mL、0.388mg/mL和1.643mg/mL，表现一定的差别，说明几丁质结合域影响了酶对不溶性底物的亲和力。3种蛋白中，只有BjCHI1在33μg/mL以上浓度具有凝集素活性，而BjCHI2和BjCHI3的浓度即使高达800μg/mL也无凝集素活性，表明2个几丁质结合域是BjCHI1具有凝集素活性的必需条件，这是植物中发现的第一个兼有几丁质酶和凝集素活性的蛋白质。 

摘要:选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株，以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针，进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因，均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体，建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7，获得了相应的工程菌BMB8901-171，BMB8902-171，BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了，营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性；其中对小菜蛾的毒力最高，LC₅₀值分别为28.6，31.6，45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。 

摘要:1,6-缩水-β-D-吡喃葡萄糖是纤维素类物质热解的主要产物，黑曲霉突变株CBX209能较好地利用该糖作为唯一的碳源和能源生长并产生有用的代谢产物柠檬酸，其效率与利用葡萄糖大致相当。利用葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶复合系统测定证明该菌株不存在1,6-缩水-β-D-吡喃葡萄糖水解酶。采用快原子轰击质谱技术结合6磷酸葡萄糖脱氢酶系统进行测定，结果表明经(NH₄)₂SO₄沉淀或阴离子交换层析处理后的无细胞提取液在加入ATP和Mg²⁺的条件下能直接催化1,6-缩水-β-D-吡喃葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，证明黑曲霉突变株中存在一个新酶，即1,6-缩水-β-D-吡喃葡萄糖激酶。该酶为诱导酶。

摘要:将苹果锈果类病毒的1个14nt的靶序列连接在锤头型核酶的3′末端，构成自切割核酶。经人工合成和PCR扩增，克隆在转录载体pGEM7zf（＋）的XhoⅠ-Hind Ⅲ位点。利用限制酶Xho I与SalI的连接，消失其识别位点序列，将自切割核酶片段插入到重组质粒中，经连续5次亚克隆，分别获得2、4、6、8、10和12拷贝的多体自切割核酶。在T7RNA聚合酶作用下，线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子，提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和12体自切割核酶分别对32P标记的靶ASSVd进行反式切割，核酶与靶RNA摩尔浓度比为1：1。放射自显影结果表明：多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶。我们推测多体自切割核酶在体内系统中可能具有更好的应用价值。

摘要:纤溶酶原K13功能区是近年发现的血管生成抑制因子，具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K13功能区的基因，DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9K上获得重组质粒pPIC9K13，转化毕节酵母GS115，用PCR和G418法筛选高拷贝转化子，进行摇瓶发酵。SDSPAGE和Western blot分析结果证实K13基因已在GS115分泌表达，并具有免疫活性。选用30L和80L罐进行高密度发酵，甲醇诱导48h细胞密度达到OD250～300，比摇瓶提高5～6倍，表达量150200mg/L。发酵上清液经Streamline SP离子交换及PhenylSephorose疏水层析纯化，在SDSPAGE上显示一条带，纯度96%，动物实验证明纯化产物具有抗血管生成和抗肿瘤的活性。 

摘要:利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约700bp的DNA片段，将之克隆到pGEM7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌 DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因，它含有717bp（不包括N端81bp的信号肽编码区），其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体7ZTS上，转化到大肠杆菌JM109（DE3）内。表达的SEB占总蛋白33.5%。 

摘要:探索一种简便、有效的乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫方法。将编码绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFPN1转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，灌胃饲服BALB/c小鼠，流式细胞术检测出小鼠脾细胞内表达的绿色荧光蛋白；构建编码HBV包膜大蛋白的DNA疫苗pCIS1S2S，分别以SL7207为载体的口服途径或直接肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠，检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应，结果表明两种免疫途径均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答，但口服途径诱导免疫应答的强度明显强于肌肉注射途径。口服携带HBV DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌可能代表一种简便、有效的治疗乙型肝炎的新方法。 

摘要:利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction ,nPCR）技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株，GXYL）与中国猪瘟兔化弱毒（C-株）兔脾组织毒E₂基因的主要抗原区，将其克隆到表达载体pP_ROEX-HTb中，获得重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。 SDS-PAGE检测表明，经重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C转化、诱导的受体菌能表达E₂基因主要抗原区蛋白，Western-blot检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 

摘要:研究了一种新的脱磷脂血红蛋白制备方法。在2%、5%PEG4000或2%、5%PEG10000作共溶剂的情况下，利用疏水相互作用色谱基本上完全除去了新鲜牛血红细胞裂解液中的磷脂类成分，其中以5%PEG4000为共溶剂时，血红蛋白的回收率最高，达85.0%，在血红蛋白存在下所用的苯基琼脂糖-6B型疏水介质的吸附容量为86.6 mg磷脂/mL介质。经过疏水作用色谱后，血红蛋白的P50是33864Pa，Hill系数是2.54，较好地保存了血红蛋白的生物活性。对疏水作用色谱的脱磷脂机理以及PEG的保护机制进行了讨论。  血红蛋白，疏水作用色谱，PEG，磷脂，共溶剂

摘要:研究结果表明，V. natriegens可以利用葡萄糖、果糖、以及糖蜜为碳源合成聚羟基丁酸［Poly(3HB)］；当以糖蜜为碳源时，积累的Poly(3HB)达到细胞干重的28.4%。实验结果还表明，Poly(3HB)的积累滞后于细胞生长，在培养前加入过量的碳源，不仅没有Poly（3HB）积累，还抑制细胞的生长。测定了与Poly(3HB)合成相关的PHA聚合酶、β酮硫解酶和乙酰乙酰CoA还原酶的活性。结果表明，伴随Poly(3HB)合成，PHA聚合酶活性从无到有，β酮硫解酶活性提高了10倍以上。进一步通过利用脂肪酸合成代谢抑制物——浅蓝菌素（cerulenin），研究了脂肪酸从头合成途径与Poly(3HB)合成途径的关系，发现浅蓝菌素能够明显降低细胞Poly(3HB)的累积。根据以上结果，推测在V. natriegens中可能存在有两条代谢途径参与Poly(3HB)的合成。 

摘要:细胞在模式化表面的定位培养对于组织工程、生物传感器技术和细胞生物学基础研究具有重要意义。研究基于软光刻技术的生物素-亲和素微模式表面快速制备方法，并用所制备的模式进行牛主动脉血管内皮细胞的定位培养。表明该技术可在细胞尺度上有效地控制细胞生长的空间位置。 

摘要:以典型的代谢控制发酵产品鸟苷为例说明了一种基于过程参数的相关分析来研究发酵过程中代谢流迁移的方法。通过对发酵过程多参数的相关性分析，结合生物合成代谢途径、氨基酸和有机酸积累的分析，确认了发酵过程代谢流向EMP途径的迁移，认为造成这种代谢流迁移的原因可能是过程铵离子积累。在此基础上，通过对过程参数实时检测分析和及时调整EMP和HMP代谢通量使产率提高了35％。 

摘要:用无血清培养基培养角质细胞，研究了Ca²⁺对鼠角质细胞生长和分化的影响。实验结果表明，培养基中钙离子最佳浓度为0.2mmol/L。在此浓度下，细胞克隆形成率达到10.8%，细胞的贴壁率达到28.7%，细胞的分化比例和老化比例分别为5.4%和26.3%；当Ca²⁺浓度达到0.6mmol/L以上时，则会引起角质细胞显著的分化和老化。

摘要:考察了抗氧化剂对鼠角质细胞体外培养寿命的影响。实验发现在角质细胞的体外培养过程中添加抗氧化剂有利于延长细胞的寿命，其中效果最好的是巯基乙醇，其次为过氧化氢酶和SOD，但在体外培养过程中，角质细胞生长速率仍然逐渐下降。实验还发现，添加抗氧化剂可在一定程度上提高角质细胞的克隆形成率，减缓细胞衰老速率。同时，通过考察鼠表皮角质细胞衰老动力学，获得了对应于不同抗氧化剂的细胞衰老动力学常数。 

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