摘要:埃博霉素是由粘细菌纤维堆囊菌产生的一类具有促微管聚合活性的大环内酯类化合物。埃博霉素生物合成的多酶复合体是一个由多个功能模块组成，同时含有多聚酮合酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）的大操纵子。根据同位素标记试验结果和合成酶全基因簇功能的推测，埃博霉素的生物合成包括聚酮链的引发、链合成的起始和噻唑环的形成、链的延伸和转移、链合成的终止释放和环化、及产物的后修饰5个阶段。埃博霉素的PKS/NRPS杂合基因簇是开展组合生物合成研究的良好材料。

摘要:人类免疫缺陷病毒(HIV)的壳体蛋白(CA)在HIV病毒的组装和成熟过程中起着至关重要的作用。近年来，壳体蛋白的体外表达及其疫苗的研制成了HIV各项研究的焦点。由于壳体蛋白具有较好的的保守性，用其制得的疫苗也会提供比包膜蛋白更为广泛的免疫保护力。另外若将CA在体外表达成一个颗粒状结构，会增强其免疫原性，可以使疫苗发挥出更大的效力。

摘要:克隆了大肠杆菌和霍乱弧菌胸腺嘧啶合成酶基因thyA，并以pcDNA3质粒为基础，分别用两种来源的thyA基因替代其氨苄抗性基因Amp，构建了不含抗性基因，且可在thyA营养缺陷型大肠杆菌中基于染色体-质粒平衡致死系统稳定传代的真核表达载体。该载体可有效表达红色荧光蛋白报告基因。为核酸疫苗的制备提供一个无抗性的表达载体系统。

摘要:利用基因工程方法将鼠源性抗CD3抗体HIT3a的可变区和人源抗体(IgG)的完整的恒定区连接起来，构建全抗型抗CD3嵌合抗体，该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植，减少受体产生免疫排斥，提高移植器官的存活率。利用PCR方法从抗CD3 ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E上扩增抗CD₃抗体的轻链和重链可变区，将轻链和重链可变区组装到含有人抗体（IgG）恒定区的表达载体中，构建抗CD3嵌合抗体IgG的轻链和重链表达载体PKN100和PG1D105，并用脂质体法共转染CHO细胞。结果证明，抗CD₃嵌合抗体的V_L和V_H与HIT3a抗体的V_L和V_H完全相符，ELISA和Western blot检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗CD₃嵌合抗体IgG的表达，表达产物能与Jurkat细胞结合，并能竞争性抑制HIT3a抗体和Jurkat细胞结合活性，³H-TdR掺入实验表明, 抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a一样,具有促进外周血单核细胞增殖的作用。我室构建的全抗型抗CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达，表达产物有较好生物活性，具有潜在的临床应用价值。

摘要:编码完整大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的基因被引入pET11c形成pET11-LT，该质粒在E.coli BL21(DE3)中得到较高效率的表达，约46mg/L。用D(+)Immobilized galactose柱可以在很宽的pH范围(pH7.3～10.4)内用多种方法对LT进行纯化且保持其结构完整。溶于TEAN(pH7.3)或碳酸盐缓冲液(pH10.4)的LT，冻干后保存于4℃，可长久保持其完整结构，此为保存LT的较好策略。与GM1结合实验、CHO细胞及Patentmouse毒性检测实验证明纯化的LT具有生物学活性。

摘要:Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bt菌株和41个Bt标准菌株中筛选到39株即约25%的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析，发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89 kD大小的蛋白，其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株，即S101和611，并分别进行vip3A基因的克隆和测序，再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较，结果表明，vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个vip3A基因即vip3AS101和vip3A611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-611，转化到大肠杆菌M15，经1 mmol/L IPTG诱导后均表达89 kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明，Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48%和35%的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-611蛋白和已报道的Vip3A-S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodoptera litura) 幼虫进行生物测定，结果表明，3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异，这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。

摘要:构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制，Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导，将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中，转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因，约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达，不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。

摘要:根据绿色荧光蛋白基因和枯草芽孢杆菌木糖诱导型启动子PxylR 序列，分别设计两对特异引物primers PxyF/R和primers gfpF/R，扩增获得了完整的启动子PxylR和-gfp基因序列。进一步以上述产物混合物为模板，以primer PxyF/primer gfpR做引物进行重迭PCR，获得了PxylR-gfp重组翻译融合表达盒。经SphⅠ和KpnⅠ完全酶切后，将PxylR-gfp表达盒分别插入大肠杆菌_苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315和大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭载体pRP22。相应的重组表达质粒pGFP315和 pGFP22转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。前者在标准菌株168中得到良好发光表型，后者则在标准菌株168和野生目标菌株B916中均得到良好的发光表型。室内平板抑菌实验结果显示B916生防效果与出发菌株没有明显差异，遗传稳定性研究表明连续稀释培养约175代后，工程菌株稳定性为94%，质粒丢失频率低于3.5×10^-4/代。

摘要:利用RT-PCR从人胎盘组织中获取BMP-6成熟肽的cDNA 片段，并克隆到表达载体pET-15b中， 构建hBMP_6成熟肽的非融合蛋白表达质粒pET-BMP6，转化E.coli BL21（DE3）。IPTG 诱导4h后，工程菌高表达rhBMP-6成熟肽，在SDS-PAGE上出现预期的新蛋白带(≈15kD)， 约占菌体总蛋白的10%，表达产物以包涵体形式存在。分离和纯化的包涵体溶解于8 mol/L尿素，在变性溶解状态下经阳离子交换层析,得到目的蛋白纯度达95%以上。再经稀释复性后，约80%的rhBMP-6形成同源二聚体。体外活性分析结果显示：rhBMP-6可以提高C3H10T1/2 细胞碱性磷酸酶活性及促进I型胶原、Osterix（Osx）和骨钙素（Osteocalcin）等成骨细胞表型转化标记基因mRNA的表达，证明制备的rhBMP_6具有诱导非骨源性细胞分化成为成骨细胞的作用。

摘要:尿嘧啶糖基化酶是碱基切除修复过程的起始酶，对于维护基因稳定具有重要意义。在不同组织及不同细胞周期中，该酶的表达水平存在差异。通过反转录PCR克隆了人尿嘧啶糖基化酶的cDNA编码序列，进一步以克隆所得的已知UNG基因拷贝数的重组质粒作为定量标准，通过实时荧光定量RT-PCR测定了食管癌病人手术切除组织中尿嘧啶糖基化酶的mRNA水平，探讨了尿嘧啶糖基化酶表达水平与食管癌之间的联系。

摘要:苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C半端缺少了一段含4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定，报道苏云金杆菌辅助蛋白P20帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT3101构建3个表达质粒，即pT1B、pP1B和pDP1B，3个质粒都含有cry1Ab基因，不同在于pT1B没有p20基因，pP1B含有p20全基因，而pDP1B不仅含有p20全基因，且在p20基因前插入cry1A?启动子。分别将这3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中，获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Western blot表明cry1Ab基因在这3株菌中均表达了130 kD的蛋白，部分降解为大约60 kD的蛋白。蛋白定量分析显示，3株菌130 kD蛋白量的比为1∶1.4∶1.5，降解后的60 kD蛋白量的 比为1∶1.1∶1.6，Cry1Ab蛋白总量的比为1∶1∶2∶1.6。镜检发现，Cry1Ab在3株菌中都形成典型的菱形晶体，其晶体大小为T1B Helicoverpa armigera）均具有明显的杀虫活性，三者的LC₅₀差异不显著。研究表明，P20对cry1Ab基因的表达和晶体形成均有帮助，P20表达量的多少可能是导致Cry1Ab蛋白最终产量有所不同的因素。

摘要:Arresten来自人Ⅳ型胶原α-1链非胶原末端，可抑制新血管生成。从人肝脏提取总RNA，RT-PCR扩增arres-ten的cDNA，T载体进一步扩增后与表达载体pPIC9连接，测序，确认后转入毕赤酵母，获得表达可溶性arresten的酵母细胞。表达产物经初步纯化后，用SDS-PAGE测定分子量为26kD，与理论计算值接近；表达产物对matrigel辅助的内皮细胞管化有明显抑制作用。上述结果表明用毕赤酵母表达了有活性的arresten。

摘要:在Bind-Silane^R处理的玻片上交联聚丙烯酰胺凝胶层(15mm×15mm×20μm)，戊二醛活化。与末端氨基修饰的寡核苷酸片段共价结合制成芯片。这种芯片能够区分液相中序列不同的Cy3标记的目标核酸。与平面基片相比，凝胶基片具有背景低、固定探针量高、杂交时间短的优点。将细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、ANG、I-309和VEGF的单克隆抗体加样于凝胶基片上制成蛋白质芯片，对乳腺癌患者和正常人的血清进行检测，发现乳腺癌患者细胞因子IL-4、IL-5、I-309和VEGF的表达量高于正常人的表达量，对临床诊断具有重要的参考意义。

摘要:现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞，这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因，利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达，但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用，以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度，发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时，利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示，将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后，37℃下孵育靶细胞12h(moi=50)，可达到较高的基因转移及表达效率，同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较，结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为，经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。

摘要:为解决造血细胞的静态培养中由浓度梯度引起的培养不稳定、环境不均一、难放大等问题，首先采用转瓶对脐血单个核细胞进行了悬浮培养研究，结果表明，悬浮培养中总细胞、集落和CD34^＋细胞的扩增都高于静态的方瓶培养。在测试了所用材料生物相容性的基础上，开发了可以控制溶氧和pH的生物反应器，并将其应用到造血细胞的批培养中，结果表明反应器的培养环境均一，可实现较高密度的培养，而且总细胞、集落和CD34^＋细胞的扩增都优于静态培养。大规模的反应器培养有利于解决临床应用中细胞数量不足的问题。

摘要:在批式及灌流培养条件下研究了杂交瘤细胞在无血清培养基中的生长、代谢情况与氧消耗的关系。应用动力学方法在线进行OUR的检测，同时离线取样检测其他参数。结果发现OUR与谷氨酰胺的消耗、抗体的生成及活细胞密度间有明显的相关关系，进一步的分析还发现在对数生长期，OUR与活细胞密度间具有良好的线性关系，qOUR(0.103±0.028)×10^-12mol/cell/h，可以通过它来进行细胞密度的在线检测。并通过以ΔOUR=0时刻作为灌流调整点进行连续灌流培养的初步实验验证了OUR作为培养过程反馈控制参数的可能性。

摘要:为研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin）的功能并探索其在水产加工和病害防治中的应用潜力，将PCR改造后的编码成熟肽中华鲟（Acipenser sinensis）cystatin 基因亚克隆到毕赤酵母整合型表达载体pPICZαA，氯化锂法转化毕赤酵母菌株GS115，构建表达cystatin的酵母基因工程菌。经甲醇诱导、SDSPAGE检测培养基上清液，表明中华鲟cystatin在毕赤酵母中实现了高效表达，重组cystatin表达量约为215mg·L^-1。纯化后重组蛋白纯度达94.2%。生物活性检测结果表明，1μg重组中华鲟cystatin约能抑制15μg木瓜蛋白酶的水解活性。

摘要:黄曲霉毒素是农作物常见的受污染的霉菌毒素，毒性大，稳定性高，是潜在的肝癌致癌物，对人的危害较大。该毒素的解毒与去毒一直是受到关注的问题。黄曲霉毒素解毒酶对黄曲霉毒素有特殊的去毒和降解作用，但是该酶的稳定性离解决实际问题尚有一段距离。报道了对黄曲霉毒素解毒酶的固定化，并对固定化处理后酶的稳定性、性质、催化活性、解毒活性进行了测定。结果表明，通过固定化操作酶的解毒活性被保留下来，酶的酸碱稳定性、热稳定性、放置稳定性等均得到显著的提高。

摘要:转录因子是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子，通常由DNA结合域与效应域两部分组成，而锌指结构是DNA结合域的常见组成单元。人工转录因子就是基于转录因子的这种结构特点，人为地选择针对特定序列的DNA结合域与具有特定作用的效应域组合而成。利用噬菌体展示技术，筛选到与SV40启动子上9bp序列特异结合的锌指结构，再连接KOX1的KRAB域构建了一种人工转录因子。转染实验表明它对SV40下游的报告基因的表达有很显著的抑制作用。

摘要:以增生性玻璃体视网膜病变患者视网膜下液为研究对象，结合单向明胶酶谱法和双向电泳分离技术创建了基质金属蛋白酶双向电泳分离酶谱鉴定技术，该技术具有很高的分辨率和灵敏度，重复性好，能够提供蛋白质的相关修饰信息。通过该技术初步发现在增生性玻璃体视网膜病变患者的视网膜下液中存在有4种基质金属蛋白酶，其中2种是由3或4种分子量相同但等电点不同的同分异构体蛋白质组成。

摘要:本文对毕赤酵母进行了恒化培养研究。以甲醇为唯一碳源时，在稀释率较低时(D<0.048 h^-1)，连续培养系统操作很稳定。但在稀释率高时(D>0.048h^-1)，连续培养系统的定态点不止一个，实验不能维持，故采用比生长速率恒定的分批流加培养进行研究。结果表明，毕赤酵母的生长符合Andrew普遍化底物抑制模型。综合考虑水蛭素的生成、底物的消耗，在生产中维持甲醇浓度为限制性浓度(0.5 g/L)，且维持比生长速率为0.02 h^-1时，水蛭素Hir65的比生成速率达到最大值0.2 mg/(g·h)且甲醇的比消耗速率为0.04 g/(g·h)。

摘要:多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原，这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质粒：1 pIRES/HA（表达全长的HA基因）；2 pIRES/tHA（只表达HA基因的主要抗原表位区）；3 pIRES/tHANpep（融合表达HA基因的抗原表位区和NP基因的3个CTL表位）；4 pIRES/tHANpep-IFN-γ（用鸡的IFN-γ基因取代质粒pIRES/tHANpep中的neo基因）。分别用这4个重组质粒和空载体质粒pIRES1neo肌注免疫30日龄SPF鸡。免疫3次，间隔为2周，每次每只鸡的剂量为200μg。第3次免疫后两周以高致病性禽流感病毒H5N1强毒攻击，免疫及攻毒前后均采血检测HI抗体效价和外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞的变化。结果发现，攻毒前各质粒免疫组均检测不到HI抗体，攻毒后1周存活鸡HI抗体效价迅速升高到64～256。流式细胞仪检测显示外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞在疫苗免疫后都有不同程度的升高。空载体质粒对照组鸡（10只）在攻毒后3～8 d内全部死亡，其他各重组质粒免疫组鸡都获得了部分保护，保护率分别是：pIRES/HA组为545%（6/11），pIRES/tHA组为30%（3/10），pIRES/tHANPep组为36.3%（4/11）， pIRES/tHANPepIFNγ组为50%（5/10）。这些结果表明我们构建的多表位DNA疫苗能够诱导机体产生特异性免疫应答，并在同型禽流感强毒攻击时对鸡只提供了一定的保护。

摘要:采用RTPCR扩增的方法,从新疆不同地区的野生植物胡杨中分别克隆获得1kb和2.3kb的cDNA片段，测序和序列分析表明这两个基因片段均包含NHX基因的部分读码框架，分别命名为PtNHX和PwNHX。PtNHX序列同源性分析结果显示胡杨NHX基因与滨藜NHX基因同源性高达98%，与碱蓬同源性达到86%，与拟南芥同源性为84%，与水稻同源性为80%，表明它是植物中高度保守的一种基因，同时说明野生植物胡杨中也存在与拟南芥相似的植物耐盐相关基因。PwNHX序列分析表明，该基因内部含有一种转座酶的读码框，大小约1350bp，与已发表的Shigella flexneri.转座子Tn10基因序列(AF162223)同源性为99%。NHX基因的蛋白产物在植物的耐盐性方面起着重要的作用。推测PwNHX由于插入转座酶读码框可能会导致该基因的功能丧失。胡杨生存于盐碱地，其体内可能存在另一些机制使胡杨具有抗盐碱的能力。对于这些机制的研究可能有助于进一步了解植物的抗盐机制。利用PwNHX基因内的转座子作基因标签，可进一步研究胡杨的其它基因，从而有可能揭示胡杨叶子发育的变态过程、耐盐碱等性状。

摘要:硝酸盐在植物体内的积累过多已成为影响蔬菜品质并影响人类健康的重要因素。硝酸还原酶（NR）是硝酸盐代谢中的关键酶，提高其活性有利于硝酸盐的降解。为了解植物不同组织中NR的活性，用活体测定法检测了经50mmol/L的KNO₃诱导不同时间后的油菜、豌豆和番茄幼苗根茎叶中NR活性，同时为了明确外源诱导剂浓度与植物体内NR活性的关系，检测了经不同浓度KNO₃诱导2h后的矮脚黄、抗热605、小白菜和番茄叶片中的NRA。结果表明，不同植物组织NR活性有很大差异，叶中NR活性较高，根其次，茎最低；不同植物的NR活性随诱导时间呈不同的变化趋势，相同植物不同组织的NR活性变化趋势相似；不同植物叶片NRA为最高时KNO₃浓度不同。用30mmol/L的KNO3诱导番茄苗2h后，从番茄根和叶中提取总RNA，用RT-PCR方法获得NR cDNA，全长2736bp，编码911个氨基酸。为进一步利用该基因提高植物对硝酸盐的降解能力打下基础。

摘要:途径工程(Pathway engineering)，被称为第三代基因工程，改变代谢流向,开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。利用途径工程理念，对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）代谢途径进行理性设计，以拓展这一传统酒精生产菌的底物范围，使其充分利用可再生纤维质水解物中的各种糖分，是酿酒酵母酒精途径工程的研究热点之一。这里介绍了近年来酿酒酵母以木糖为底物的酒精途径工程的研究进展。