摘要:为了在中药细胞中表达人源有用基因，以增强其特异药理活性，将克隆自人外周血淋巴细胞（PBL）mRNA的RANTES基因经Ti质粒衍生的中间表达载体pROKII导入携带pAL4404质粒的根癌农杆菌LBA4404菌株中，并采用叶盘共培养法转化离体培养夏枯草细胞，经Southern杂交确认RANTES基因在转化细胞基因组中的整合，用RT-PCR扩增、Western印迹杂交和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析转化细胞中RANTES基因的表达，以PBL的过氧化物酶活性作为重组RANTES对细胞趋化性诱导的检测指标。结果表明，RANTES基因已在转基因夏枯草细胞中整合，并已形成稳定表达RANTES基因的细胞克隆，为进一步培育具有特异药理活性的转基因夏枯草植株打下了基础。

摘要:通过PCR从质粒pUC18-169中扩增得到N-氨甲酰氨基酸水解酶基因（hyuC），置于原核表达载体pQE60的T5启动子下游构成表达质粒pQE60-hyuC，并在大肠杆菌M15中实现了该基因的高表达。SDS-PAGE检测表达产物，在相对分子量44kD处有一表达带，经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40%，主要以可溶性形式存在。酶活性分析结果表明，工程菌M15/pQE60-hyuC的N氨甲酰氨基酸水解酶的比活分别比原始菌株Arthrobacter BT801和亚克隆DH5α/pUC18-169提高了52倍和72倍。在节杆菌BT801和大肠杆菌DH5α/pUC18-169的反应体系中加入等量菌体的工程菌M15/pQE60-hyuC，可使乙内酰脲酶总比活分别提高8.1倍和3.0倍。

摘要:γ-亚麻酸(GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸，在大多数油料作物种子中不含有GLA，而只含有其前体物亚油酸，只有少数油料植物种子中含有GLA，如夜来香（Oenothera spp），琉璃苣（Borago officinalis）等。Δ⁶脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ亚麻酸，为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA，我们将从深黄被孢霉中克隆的Δ⁶脂肪酸脱氢酶基因，与植物表达载体pGA643连接，构建了重组质粒pGAMICL6，将其通过农杆菌介导法，导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中，Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析，结果显示，GLA和十八碳四烯酸(OTA)分别占总脂肪酸含量的19.7%和3.5%。

摘要:以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ201为模板，采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第8位Thr突变为Ser（T8S）、将第2位Dhb突变为Dha和第31位His突变为Lys（T2S/H31K）以及将第27位Asn突变为Lys和第31位His突变为Lys（N27K/H31K），以pMG36e为载体，电击转化乳酸乳球菌（L.lactis）NZ9800进行表达。对表达产物性质的研究结果表明，3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化，其抑菌活性略有下降，但它们的稳定性表现各不相同：N27K/H31K的稳定性与NisinZ几乎一致，而T8S和T2S/H31K的稳定性有明显提高，在pH9条件下100℃加热5min仍不丧失抑菌活性。

摘要:CIKS（Connection to IKK and SAPK/JNK）是最近发现的细胞蛋白，能激活IKK和SAPK/JNK。应用酵母双杂交系统，将CIKS（151574）插入载体pAS21作为诱铒，筛选人HeLa 细胞MATCHMAKER cDNA文库，以期为阐明NFκB及JNK活性调控的分子机理提供新的线索。筛选得到6个阳性AD/文库质粒，并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与CIKS的相互作用。将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析，发现它们分别是RIKEN cDNA 473340F03，PLAC8, CD27BP (Siva-1), CDC5L, SnRNP smB，DVL2。CIKS能与这些功能各异的蛋白质相互作用，表明CIKS在细胞的多种生理活动中发挥作用。

摘要:利用Clostridium acetobutylicum的丁酸激酶基因 (buk) 和磷酸转丁酰基酶基因(ptb)，以及Thiocapsa pfennigii的PHA合成酶基因，设计了一条能够合成多种聚羟基烷酸的代谢途径，用构建的质粒转化大肠杆菌，获得了重组大肠杆菌菌株。前期的研究表明，在合适的前体物条件下，该重组大肠杆菌能够合成包括聚羟基丁酸、聚（羟基丁酸戊酸）等多种生物聚酯［Liu and Steinbüchel, Appl. Environ. Microbiol. 66:739743］。利用该重组大肠杆菌，通过生物催化作用合成了3巯基丙酸的同型共聚酯，同时利用该重组大肠杆菌还获得了含3-巯基丙酸单体的多种异型共聚物。实验首先研究了3巯基丙酸对大肠杆菌生长的影响，在此基础上优化了培养过程中添加3-巯基丙酸的时机和浓度，结果表明，在实验的条件下，细胞合成聚（3-巯基丙酸）可达6.7%(占细胞干重)，合成聚（3-羟基丁酸—3-巯基丙酸）（分子中3-巯基丙酸:3-羟基丁酸=3:1）可达24.3%。实验进一步研究了同时或分别表达以上3个基因的重组大肠杆菌合成聚合物的能力，结果表明只有当3个基因同时表达时才能合成聚合物，说明3个基因对合成过程是必须的，从而表明了合成途径是按照设计的路线进行的。还通过GC/MS、GPC、IR等手段对合成的化合物进行了定性的研究。聚（3-巯基丙酸）或聚（3-羟基丁酸-3-巯基丙酸）等聚酯属于一类新型生物聚合物，它在分子骨架中含有硫酯键，不同于聚羟基烷酸酯的氧酯键，从而具有显著不同的物理、化学、光学等性质和具有重要的潜在应用价值。

摘要:基于质量守恒定律和代谢反应中间代谢物的拟稳态假设，定量研究了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）代谢流分布随时间变化的特征。研究结果表明，在鸟苷发酵过程40h左右，存在着从己糖单磷酸途径到酵解途径的代谢流迁移，所迁移的碳源主要生成了氨基酸和有机酸。定量研究的结果，为发酵过程的工艺优化提供了重要依据。

摘要:从11株微生物中筛选出4株具有不对称还原2′-氯-苯乙酮能力的酵母，其中酿酒酵母B5的还原产率与对映体选择性最佳。确定了酿酒酵母B5对2′-氯-苯乙酮还原的最佳反应时间为24h；最佳pH 8.0；最佳反应温度为25℃；最佳共底物为5%（体积比）乙醇。同时研究了底物浓度、微生物的量、微生物的培养条件等对反应产率和立体选择性的影响。细胞浓度为10.75mg/mL（细胞干重/反应体积）的酿酒酵母B5可将647mmol/L的2′-氯-苯乙酮100%地转化为R-2′-氯-1-苯乙醇,其对映体选择性为100%。酿酒酵母B5可重复利用的特点可提高产物的产量。

摘要:利用放射型根瘤菌WSH2601（Rhizobium radiobacter WSH2601）重点考察了葡萄糖、蔗糖、玉米浆和蛋白胨、添加物以及流加发酵对细胞生长和产辅酶Q₁₀的影响，结果表明， 葡萄糖和蔗糖适合于生产辅酶Q₁₀的最佳浓度分别为30 g/L和40 g/L；辅酶Q₁₀发酵时玉米浆和蛋白胨的最适浓度分别为11g/L和16g/L；添加蕃茄汁、玉米浆能提高发酵液的生物量，玉米浆、异戊醇、L-甲硫氨基酸等能促进辅酶Q₁₀的积累；与分批发酵相比，在7L罐上流加蔗糖其细胞生物量（DCW）和辅酶Q₁₀积累量增加，若在流加蔗糖的同时流加适当浓度的玉米浆能显著提高辅酶Q₁₀的产量，最大产量达到52.4 mg/L；最大生物量（DCW）和胞内辅酶Q₁₀含量（C/B值）分别达到26.4 g/L和2.38 mg/g-DCW，比不流加的分批发酵分别提高53%和33%，比只流加蔗糖分别提高24%和26%。

摘要:应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA基因，与真核表达载体pcDNA3重组，形成重组质粒pcDNA3K5，与穿梭质粒pShuttle 重组得pShuttleK5，经与腺病毒DNA重组，PCR鉴定正确，即为pAdK5。脂质体法将其转染293细胞后，制备细胞裂解液；噬斑分析法测定病毒滴度为5×10⁸ pfu/mL。将病毒以不同的感染系数(MOI)感染人脐静脉内皮细胞株ECV304和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，MTT法检测两者的增殖情况：ECV304细胞增殖受抑制，而MDA-MB-231细胞增殖未受明显影响。将感染病毒的ECV304细胞接种于ECMatrix^TM胶，显示内皮细胞分化和毛细血管管腔形成受抑制。表明所构建的含人纤溶酶原K5基因的重组复制缺陷型腺病毒具有抑制ECV304细胞增殖、分化和管腔形成的作用而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。

摘要:在获得可分泌表达α-半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上，尝试了基因工程α-半乳糖苷酶在5 L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。在4 L无机盐培养基中接种0.4 L pPIC9K-Gal/GS115培养物，最终得到3.5 L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为2.1 g/L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点，设计了如下的纯化流程：离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带，总回收率41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后，完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明，从发酵液中纯化的α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α-半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。

摘要:西瓜AGPase 的大亚基基因wml1的 5′端上游1573bp序列，是一个果实特异性启动子(命名为WSP)。根据WSP内部酶切位点，获得了3个不同5′端缺失的启动子片段（长分别为 1201bp、898bp、795bp），并构建成植物瞬间表达载体，与含WSP的瞬间表达载体一起用基因枪的方法转入西瓜叶、茎、花及不同发育期果实中。瞬时表达结果表明，1573bp 、1201bp 、898bp的片段均能指导GUS基因在西瓜果实和花中特异性表达，但是表达强度和表达时期有所不同，795bp的片段不能指导GUS基因表达。推测在180bp-551bp之间可能存在促进外源基因在果实发育后期表达的顺式作用元件，而果实特异调控区域可能位于854bp-957bp之间。

摘要:将编码扩展青霉碱性脂肪酶（PEL）的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K，电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，通过橄榄油MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析、橄榄油检验板鉴定，表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中，分子量约28kD，与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致，占分泌蛋白的95%。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油，通过优化该表达菌的发酵条件，以橄榄油为底物进行酶活测定，其发酵液酶活可达260 u/mL。

摘要:黑曲霉（Aspergillus niger LORRE 012）的孢子中富含纤维二糖酶，将这些孢子用海藻酸钙凝胶包埋后，可以方便有效地固定纤维二糖酶。固定化后的纤维二糖酶性能稳定，半衰期为38 d，耐热性和适宜的pH范围均比固定化前有所增加，其K_m和V_max值分别为6.01 mmol/L和7.06 mmol/(min·L)。利用固定化纤维二糖酶重复分批酶解10 g/L的纤维二糖，连续10批的酶解得率均可保持在97%以上；采用连续酶解工艺，当稀释率为0.4 h^-1，酶解得率可达98.5%。玉米芯经稀酸预处理后，其纤维残渣用里氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶降解，酶解得率为69.5%；通过固定化纤维二糖酶的进一步作用，上述水解液中因纤维二糖积累所造成的反馈抑制作用得以消除，酶解得率提高到84.2%，还原糖中葡萄糖的比例由53.6%升至89.5%，该研究结果在纤维原料酶水解工艺中具有良好的应用前景。

摘要:米曲霉来源的S1核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下， 该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构，对质粒Puc19的实验证明, S₁核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在25μL总反应体积中，按100ng DNA加入5u至17u的S1核酸酶，能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小，单酶切位点的出现率较低，很难用常规方式进行克隆，以S₁核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒（537bp），经S₁核酸酶线形化后，成功地克隆到pMD18-T载体上。

摘要:真核细胞中蛋白质磷酸化是一个重要事件。真核细胞利用可逆的蛋白磷酸化来控制许多细胞过程包括信号转换、基因表达、细胞周期等。磷蛋白组的研究涉及磷蛋白的分离和鉴定，磷酸化残基定位和定量分析。由于蛋白质磷酸化是一个动态过程，在细胞中磷蛋白含量低，磷酸化位点可变，且磷酸肽的质谱信号常常会受到抑制，所以磷蛋白的分析存在更多的困难。本文介绍了国内外在磷酸蛋白的分离鉴定及定量分析方面的研究技术以及进展情况。目前，质谱仍然是核心的鉴定技术，寻找更好富集方法是最大的挑战。定量蛋白组学是对蛋白质的差异表达进行精确的定量分析。目前还不存在一种独立的方法可以完成磷蛋白的分离、鉴定，以及磷酸位点的定位和定量分析。随着样品分离技术和相关仪器的发展，磷酸蛋白快速、准确、全面分析鉴定将能够实现。

摘要:白质剪切是一种翻译后修饰事件，它将插入前体蛋白的中间的蛋白质肽段（Intein, internal protein fragment）剪切出来，并用正常肽键将两侧蛋白质多肽链（Extein, flanking protein fragments）连接起来。在此过程中不需要辅酶或辅助因子的作用，仅需四步分子内反应。Intein及其侧翼序列可以通过突变产生高度特异性的自我切割用于蛋白质纯化、蛋白质连接和蛋白质环化反应，在蛋白质工程方面有广泛的应用前景。

摘要:泛素-蛋白水解酶复合体通路(Ubiquitinproteasome pathway, UPP)是细胞内依赖于ATP、非溶酶体途径的蛋白质降解通路，广泛参与包括细胞周期调控、细胞凋亡、信号转导、转录调控、免疫应答及抗原呈递等多种机体代谢活动。UPP在病毒侵染中作用的研究仍处于起步阶段。已发现，昆虫病毒和非洲猪瘟病毒分别是迄今发现唯一编码泛素和泛素连接酶的病毒。最近，大量的研究表明，病毒利用宿主细胞的UPP逃避免疫系统监控、促进病毒复制以及进行病毒粒子的组装和释放。

摘要:基于分子水平上对植物吸收、解毒、忍耐以及超富集重金属的几个关键步骤的认识，以及一些功能基因相继在细菌、酵母、植物和动物中被分离、鉴定，近年来，人们利用转基因技术提高植物重金属抗性和富集能力方面已获得进展, 一些功能基因（如gsh1, MerA和ArsC)及其工程植物已显示出植物修复产业化潜力。特别对转基因技术所采取的分子生物学途径、达到的效果以及存在的问题进行了详述，对今后研究的重点和策略进行了探讨。

摘要:通过RTPCR方法扩增MAGE-3 cDNA，以pcDNA3.1+为载体，构建重组表达质粒pcDNA3-1/MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT-PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。以100μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠，间隔10天，共3次，以空载体和PBS为对照。结果，重组质粒免疫的小鼠，其脾淋巴细胞对MAGE-3阳性靶细胞的杀伤活性为51.08±7.41%，与空载体组（8.44±1.89%）及PBS组（5.76±1.75%）相比，差异有显著性（P<0.01），而对MAGE-3阴性靶细胞的杀伤活性分别为8.21±1.65%，7.68±1.56%和5.13±1.42%，其差异无显著性；MAGE-3 DNA疫苗组免疫血清1∶15稀释时能检测到抗MAGE-3抗体，脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2水平明显升高，外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高，小鼠肿瘤的生长速度明显减慢，与对照组相比，差异显著（P<0.01）。说明MAGE-3重组质粒免疫小鼠可以诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。

摘要:用PCR技术从Bacillus Calmetteguérin(BCG)基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽(SP)DNA序列，从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG2100的人结核杆菌HSP70启动子下游，构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCGSPHSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCGSPHSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterial smegmatis, MS)中，用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS-PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中65kD蛋白占总蛋白的20%，而在重组耻垢分枝杆菌表达的65kD蛋白占菌体总蛋白的34.46%，占裂解物上清总蛋白的68.56%,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达，表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合，说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。

摘要:为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段（HAb18GEF），将HAb18GEF基因的cDNA插入原核表达载体pET21a+。通过计算机辅助设计，对重组的HAb18GEF/pET21a+的mRNA翻译起始区（TIR）的二级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和优化密码子偏性二种策略分别来降低HAb18GEF/pET21a+的mRNA翻译起始区（TIR）的稳定性。在不改变氨基酸序列的前提下，利用密码子的简并性，通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和测序验证后，转化感受态JM109DE3宿主菌后，随机挑菌37℃下用IPTG诱导表达。SDSPAGE、间接ELISA、Western blot 和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。RNA dot blot对比分析优化前后目的基因mRNA的量。结果证明，成功地构建了HAb18GEF/pET21a+及其二种优化突变体。仅优化TIR区二级结构或仅优化TIR区密码子偏性均能实现HAb18GEF蛋白的非融合表达，而未优化的重组子不表达任何HAb18GEF。非融合表达产物在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在，高达293%。由于过表达和细胞渗漏，培养基和周质腔中也可检测到少许的HAb18GEF。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的HAb18GEF的非融合表达量基本相同。优化前后HAb18GEF转录的mRNA量没有差别。这些结果表明，降低mRNA翻译起始区的稳定性可实现肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段在大肠杆菌中的非融合表达。

摘要:为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ（hTopo Ⅰ）为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选，用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达，表达产物可分泌到发酵上清，易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母（SMD-hTopoI）分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母（X33-hTopoI和KMhTopoI）更高。通过发酵条件的优化，使用BMMY（pH 7.25），于20℃，每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液，SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力（43000u/mL），发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L，约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白，无糖基化修饰。

摘要:采用RT-PCR技术从分泌抗人血管内皮生长因子受体Ⅱ（kinase insert domaincontaining receptor,KDR）基因Ⅲ区单克隆抗体Ycom1D3的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因，通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L基因之间引入柔性短肽（Gly₄Ser）₃，体外构建Ycom1D3单链抗体基因Ycom1D3-ScFv），将其克隆至pAYZ表达载体，在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明，Ycom1D3-ScFv在E.coli 16C9中获得表达，重组蛋白的相对分子量为30kD,与预期结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体，TALON 金属亲合层析基质（TALON metal affinity resin）纯化和体外复性过程，获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实该单链抗体可与人脐静脉内皮细胞结合，保留了鼠源单抗与KDR抗原的特异性结合活性。抗KDRⅢ单链抗体基因Ycom1D3-ScFv的成功构建和功能性表达为靶向诊断治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。

摘要:肿瘤的快速生长依赖于新生血管的形成。血管内皮生长因子（VEGF）是血管发生和形成过程中的主要介质，其特异性受体在正常组织和肿瘤组织的表达率存在数个数量级的差异，因此可以将毒素分子转运至增生的肿瘤上皮组织中抑制肿瘤血管增生，从而抑制肿瘤的生长。将白喉毒素的前389个氨基酸基因片段与VEGF165通过一短肽相连构建为融合蛋白基因，在大肠杆菌中表达，获得纯化蛋白。实验证实该融合蛋白对血管内皮细胞有特异性杀伤作用，并研究了其对鸡胚尿囊膜新生血管的抑制作用。

摘要:白细胞介素-4（IL-4）作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用。IL-4通过结合细胞表面的白介素-4受体(IL-4R)发挥其生物学效应。sIL-4R缺少跨膜和胞内结构域，结合IL-4后不能产生信号传递来介导IL4的生物学活性，但sIL-4R与IL-4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL-4拮抗剂应用于哮喘等疾病的治疗。采用RT-PCR方法以人的单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL-4R的基因片段，经测序证实后插入到甲醇酵母分泌表达质粒pPIC9K中，得到重组质粒pPIC9K/sIL-4R，利用限制性内切酶BglⅡ将其线性化后用电穿孔法导入Pichia pastoris GS115。分别用SDSPAGE、Western blot 和Ligand binding blot对重组菌发酵上清中的sIL-4R进行鉴定。结果表明，在分子量约为30kD处有sIL4R特异条带出现，并具有结合其配基IL-4的生物学活性。

摘要:蜱是动物常见的外寄生虫，并且传播多种人和动物的疾病，严重危害畜牧业发展和人类健康。为了寻找基因工程疫苗候选抗原基因，根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子偏好设计引物，PCR扩增、测序并分析得到2个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片段cysA和cysB，再通过RACE的方法得到全长基因序列。cysA全长168bp，编码332个氨基酸；cysB全长1153bp，编码335个氨基酸。经过分析, CysA和CysB均与其他蜱种或物种的组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性，两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列, 因此cysA, cysB均为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。RT-PCR分析表明，CysA和CysB在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一。

摘要:从土壤中分离到一株降解2,4-二氯酚能力较强的细菌菌株GT241-1，经鉴定该菌株属于假单胞菌属。菌株GT241-1在最适条件下能在48h内将90mg/L的2,4-DCP降解91%，能利用2,4-二氯酚、2,4-二氯苯氧乙酸、苯甲酸和儿茶酚为唯一碳源生长。采用Southern杂交对2,4-二氯酚羟化酶基因（dcpA）定位后构建基因组文库，再用斑点杂交筛选目的转化子，克隆了该菌株的dcpA。序列测定得知含dcpA的亚克隆片段全长2389bp，其中dcpA基因编码区1797bp。核苷酸和氨基酸序列分析表明，dcpA与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异。dcpA基因能够在大肠杆菌转化子中成功地表达有生物活性的酶。

摘要:利用发根农杆菌A₄菌株在人参根外植体上直接诱导产生发根。在1/2MS固体培养基上建立起发根离体培养系，经连续多代的培养，发根仍保持旺盛生长状态。PCR扩增结果表明，发根农杆菌R_I质粒的rolC基因已在人参发根基因组中整合并得到表达。液体培养基中发根生长速度约为固体培养的2倍。经对发根中人参皂苷含量及比生长速率的测定，筛选出高产发根系R9923。利用HPLC法测定了R9923发根系中单体皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2和Rd的含量，人参总皂苷含量达15.2mg/g。确定1/2MS培养液（30g/L蔗糖）、摇床转速110r/min、每２周更换一次培养液、继代培养时间4周，为人参发根生长适宜条件。探讨了培养容积、发根初始接种量以及分级放大培养工艺对发根大规模生产过程中生物产量和皂苷含量的影响。

摘要:建立了草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall．)甲硫氨酸抗性系原生质体再生植株的实验体系。以茎切段诱导的松软愈伤组织为材料，通过酶法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养持续分裂形成了愈伤组织，并高频率地分化出再生苗。比较了不同培养基、培养方法和培养密度对原生质体分裂和再生的影响。结果表明，原生质体以3×10⁵/mL的植板密度，采用琼脂糖岛法培养在附加1．0mg／L 2,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0．5mg／L 6-苄氨基嘌呤(6BA)、500mg／L水解酪蛋白、3％蔗糖、0．3mol／L甘露醇的KM_8p培养基中，可获得最佳效果，其细胞分裂频率达38％左右。原生质体培养后仍然保持对甲硫氨酸的抗性，同时对乙硫氨酸表现交叉抗性。

摘要:用扩张柱床吸附层析技术，一步回收纯化连续灌流培养的单克隆抗体。用Streamline SP阳离子交换介质在固定床柱XK16/20上进行条件摸索,扩张床柱Streamline25和50分别用于小规模条件优化和中试规模放大。培养液中的低浓度单抗经此步处理，浓缩10倍以上，纯度提高5～7倍，回收率＞90%,制备周期比固定柱床层析缩短一半以上。 根据培养液中单抗浓度的不同，一次处理量为18～50L,纯化规模由实验室水平（400mg）扩大至中试水平（2g）,生产成本和工艺复杂性大为降低。应用扩张柱床吸附层析技术，建立单克隆抗体回收纯化工艺，具有经济、简便、高效实用和良好的可放大性。

摘要:从深海样品ES0109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3, 16ＳrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)的Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性为99%。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因cel-X全长1479bp，编码一个492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Pseudoalteromonas haloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有95%的相似性，包括一个糖基水解酶家族5的催化结构域，一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现，CelX的最适温度为40 ℃，酶的最适pH在6～7之间。

摘要:采用聚合酶链式反应（PCR）从集胞藻PCC6803总DNA中扩增出细菌光敏色素全片段cph1及cph1（C-435），克隆于pBluescript SK(+),然后插入表达载体pET30a进行高效表达。获得的脱辅基蛋白Cph1、Cph1(C-435)在合适的缓冲体系下分别与藻蓝胆素(PCB)进行体外重组。光化学研究表明，两种脱辅基蛋白都能与PCB进行正确的重组，重组产物表现出650～700nm可逆光致变色效应。锌电泳证实得到的细菌光敏色素辅基色素为PCB，酸性尿素变性实验证明可逆光致变色效应来源于PCB在不同波长光照下的顺反异构化。

摘要:以单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物（PELA）为膜材用复乳溶剂扩散法制备了包含牛血红蛋白（BHb）的微胶囊，微胶囊中BHb的P₅₀和Hill系数分别为3 466 Pa和2.4左右，接近于天然BHb的生物活性。研究发现膜材种类对BHb微胶囊包埋率和粒径的影响最大，使用MPEG2000为亲水性嵌段的PELA共聚物时，包埋率最高，达到90％以上,粒径为3～5 μm左右；随着膜材浓度的增大，微胶囊包埋率和粒径均增加；随着外水相NaCl浓度的增大，微胶囊包埋率升高、粒径减小；随着外水相稳定剂PVA浓度的增大，微胶囊粒径减小，包埋率先升高后降低，在较低浓度下（10 g/L、20 g/L）包埋率较高；初乳化搅拌速率的增大，有利于包埋率的提高，但对粒径影响不大；复乳化搅拌速率的影响较复杂，当复乳液体积较大时，复乳化搅拌速率对微胶囊制备的影响规律性不明显。当固定膜材和初乳化搅拌速率时，包埋率和粒径之间存在着类似抛物线的关系，包埋率随着粒径的减小而降低。

摘要:系统研究了作用浓度、时间和温度以及输卵管上皮细胞和卵丘细胞对肝素处理山羊精子体外获能后的精子活力、质膜完整性、顶体完整率、获能比例及受精和卵裂的影响，为改善山羊精子体外获能效果和研究获能机理提供了必要的数据。主要实验结果如下：1、在获能液中添加5、10、25、50和100μg/mL肝素处理45min时，添加50和100μg/mL肝素精子获能比率最高（分别为55%和56%），但添加100μg/mL肝素处理后顶体完整率明显（P<0.05）低于对照组。说明山羊精子获能的最佳肝素浓度为50μg/mL。2、肝素作用时间（0, 10, 20, 30, 45, 60 和120 min）的延长，获能精子比例逐渐提高。其中，肝素处理45～120 min各组的获能精子比例差异不显著（P>0.05），处理120 min组的精子活力和质膜完整率显著低于其它各组。说明50μg/mL肝素处理精子获能的最佳时间是45～60 min。3、在42℃和38.5℃下处理时，获能精子比例显著高于15℃和37℃，但42℃处理后精子活力和顶体完整率显著低于其它温度。因此，385℃为山羊精子获能的最佳温度。4、与输卵管上皮细胞共培养获能精子比例显著高于对照组和卵丘细胞组，但精子活力、质膜完整率和顶体完整率差异不显著。输卵管上皮组的受精率（91.3％）和卵裂率（72.2％）显著高于对照组（81.2％，65.0％）。说明与输卵管上皮细胞共培养能显著提高肝素处理山羊精子体外获能的效果。

摘要:为克服血源免疫球蛋白制品的不足，开发了抗甲肝病毒基因工程单克隆抗体anti-HAV IgG。用无血清培养基培养rCHO工程细胞株，上清液经过rProtein A SFF亲和层析→脱盐→离子交换层析→超滤换液纯化后，所得anti-HAV IgG纯度达99%以上，比活性约100IU/mg，anti-HAV IgG活性回收率40%。所纯化的anti-HAV IgG分子量150kD，等电点8.4～9.3。免疫印迹实验证实anti-HAV IgG为人源全抗体分子。亲和层析介质rProtein A SFF确实存在亲和配基脱落问题，但通过后续纯化步骤可有效除去。在亲和层析过程中加入高盐清洗步骤，可有效降低宿主DNA残留量水平。对样品中自由巯基含量进行了测定，认为非还原电泳图谱中低分子量条带是由于抗体分子内存在自由巯基引起。用该工艺制备的anti-HAV IgG各项纯度检测指标均达到我国对基因工程产品的质量要求。

摘要:过去的研究发现大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒（HEV）衣壳蛋白ORF2的aa394-606片段NE2可以形成同源多聚体，并具有良好的免疫保护性，但纯化后的免疫原性较弱。这里表达了3个NE2蛋白的N端延伸突变体，发现对应于ORF2 aa368_606的重组蛋白HEV239在体外可以形成颗粒性抗原。HEV 239抗原颗粒与戊肝患者血清反应性良好，对中和性单克隆抗体8C11的反应性与NE2抗原相当，而对另一中和性单克隆抗体8H3的反应性较NE2抗原有显著提高，表明HEV 239抗原颗粒具有比NE2更好的抗原性。纯化后的HEV 239抗原颗粒直径约为15～30nm。铝佐剂吸附的HEV 239免疫Balb/c小鼠的半数有效剂量（ED50）在0.08～0.25μg之间，而同样以铝佐剂吸附的NE2抗原60μg剂量免疫的抗体阳转率仅25%，表明HEV 239抗原颗粒具有更好的免疫原性。

摘要:以阿维菌B组分菌株Streptomyces avermitilis Bjbm0006为出发菌株，用PCR的方法构建bkdAB基因簇(Ｂranched_chain α-keto acid dehydrogenase gene AB) 的基因置换质粒pHJ5821 (pHZ1358∷bkdAB&erm)，并对其进行基因中断，得到重组菌株Bjbm5821。Bjbm5821的发酵产物经HPLC检测发现，除了产生B1a和B2a外，还产生一种原菌株没有的新组分，3个组分的总含量只有出发菌株Bjbm0006的25%。结果表明bkdAB的中断不仅部分阻断了阿维菌素的合成，还阻断了阿维菌素b组分的合成，可以推测bkdAB的产物在阿维菌素合成途径中主要承担了α-酮基异戊酸脱氢酶 (α-ketoisovaleric acid dehydrogenase) 角色。

摘要:嗜铬粒蛋白(CGA)是存在于分泌细胞的由439个氨基酸组成的可溶性蛋白。近年的研究发现CGA的N端具有抗血管收缩、抗细菌和抗真菌的功能。为了寻找高效低毒的抗真菌片段，利用PCR技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白N端1-76位氨基酸（CGA1-76）的DNA片段，并将之克隆进本实验构建的枯草杆菌诱导型表达载体pSBPTQ，获得含CGA1-76基因的重组质粒pSVTQ，转化蛋白酶三缺陷的枯草杆菌DB403。经蔗糖诱导后，CGA1-76片段在枯草杆菌DB403（pSVTQ）中获得表达，产物分泌到细胞外，分泌量约为5mg/L，占总分泌蛋白的133% 。测试了表达产物对几种丝状真菌和酵母的抑制作用，发现在4μmol/L的浓度下，枯草杆菌表达的重组CGA1-76对镰刀菌、链格孢霉及白假丝酵母有明显的抑制作用。

摘要:应用荧光探针5(6)-双醋酸羧基荧光素 (Carboxyfluorescein diacetate) 测定了产长链二元酸热带假丝酵母 (Candida tropicalis) 细胞内pH (pHi) 值，确定了该探针载入C. tropicalis细胞的适宜条件。用摇瓶培养C. tropicalis细胞，考察了细胞外pH和生长碳源对pH_I的影响，实验结果表明：细胞外pH对pH_I略有影响，而生长碳源对pH_I的影响略为明显。利用5L发酵罐进一步研究了细胞生长代谢活性与pHi的关系，结果表明：细胞比生长速率、CO₂比生产速率和葡萄糖比消耗速率与pHi变化密切相关，pH_I的增加伴随着细胞生长活力的增加，反之亦然。在pH6.0条件下用葡萄糖和醋酸钠共作碳源培养C. tropicalis细胞时，测得的pH_I值维持在5.72～6.15范围内。

摘要:以聚氨酯为少根根霉固定化载体，对固定化后的细胞连续重复批次发酵进行了研究。优化了重复批次发酵培养基组成。在取代发酵液40mL，取代培养基组成为全脂豆粉3%，花生油0.5％条件下，固定化菌体摇瓶实验可连续使用140h,重复9批次。酶的时空产率提高6倍。5L发酵罐小试固定化菌体可连续发酵6批次。固定化细胞连续发酵，大大缩短了发酵的时间，酶的时空产率获得大幅提高。

摘要:采用正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，一步法制备了氨基化的二氧化硅颗粒，得到的颗粒粒径在0.3～0.5μm之间，平均大小为0.37μm, 氨基含量和颗粒大小可控，氨基含量高达56mmol/g。此颗粒经戊二醛处理后，采用共价法固定木瓜蛋白酶，固定化最适pH6.5，最佳给酶量为15mg/g载体，固定化酶的最适反应温度为70℃，最适反应pH为6.5，固定化酶热稳定性，pH耐受性，贮存稳定性都明显高于游离酶，表明此颗粒可作为一种优良的酶固定化载体。

摘要:poIFNα1基因中含有大量的大肠杆菌稀有密码子，为了获得高表达，使用了大肠杆菌的偏爱密码子，人工合成了poIFN|α1成熟蛋白编码基因。在保留编码蛋白序列的同时，使其5′端A+T的含量增加到最大限度，并将其终止密码子改为TAA。将合成的poIFNα1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中,转化大肠杆菌DH5α。实现了poIFNα1在大肠杆菌中的高效表达，表达产物以包涵体形式存在。纯化的包涵体经含DTT的6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSHGSSG的复性液复性处理，复性后的表达产物浓缩后经凝胶层析纯化，细胞病变抑制法测定表明,重组poIFNα1具有较高的抗病毒活性，约为6.4x10⁶u/mg。 

摘要:采用一株驯化过的假丝酵母(Candida sp.)直接发酵经过简单脱毒处理的玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇。确定了水解液的最适浓缩倍数在3.0～3.72的范围内。利用正交实验，确定了摇瓶分批发酵工艺条件的最适组合为：摇床转速180r/min，起始C/N为50，起始pH 5.5，接种量5% (体积比)。在此基础上，重点研究了在发酵罐中通气量对酵母发酵玉米芯水解液生产木糖醇的影响。结果表明采用先高后低的分段通气发酵在木糖醇得率方面明显优于恒定通气发酵；其中，在0～24h，3.75 L/min；24～108h，1.25 L/min的分段通气条件下(装液量为2.5L)，木糖醇得率(木糖醇/木糖，g/g) 达到0.75 g/g。该结果将有助于建立一种高效的、大规模的利用玉米芯半纤维素水解液发酵生产木糖醇的工艺。

摘要:为了研究Stat3入核的分子机制，将SV40大T 抗原的经典核定位序列NLS(nuclear localization sequence)分别融合在Stat3-GFP分子和缺失突变体Dstat3-GFP的分子之间，构建Stat3-NLS-GFP和Dstat3-NLS-GFP融合分子。转染293T细胞，以NLS-GFP为阳性对照，通过激光共聚焦显微镜的观察融合分子的亚细胞位置，未经白介素-6刺激的Stat3-NLS-GFP和经白介素-6刺激的Stat3-GFP呈胞核分布,未经白介素-6刺激的Stat3-GFP和Dstat3-NLS-GFP呈胞浆分布. 初步证明Stat3入核是由于获得了核定位序列。

摘要:担子菌PM2在限氮液体培养下，分泌木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶；藜芦醇、吐温 80的补充，提高了该菌锰过氧化物酶的产生，获得的最大锰过氧化物酶Mnp酶活为254.2u/L、190.2 u/L，分别是对照的3.4倍和2.5倍。选择三种偶氮染料，在染料体系下，进一步分析藜芦醇、吐温 80对担子菌PM2产过氧化物酶及染料脱色的影响。结果表明，担子菌PM2分泌的锰过氧化物酶Mnp与染料脱色有关，脱色程度受其分子结构特征影响；吐温80的补充，更有利于染料的脱色降解，48h后三种染料均可达到80%以上的脱色率。

摘要:白毛茛根粉末经室温萃取后用HPLC分析其中的生物碱成分，色谱柱为Zorbax Eclipse XDBC18快速分离，该方法可准确测定白毛茛中主要的生物碱，包括小檗碱（berberine）和白毛莨碱（hydrastine）。萃取和HPLC分析还可用于其他几种生物碱的测定，包括氢化小蘖碱（canadine）、白毛莨分碱（hydrastinine）和巴马亭（palmatine），也可以应用于其它含小檗碱的植物根。Eclipse XDBC18快速分离柱采用等梯度分离，所有组分在15min内获得了高的分离度。