摘要:目前 ,细胞移植作为终末期肝病的辅助治疗方法 ,移植的细胞必须满足在受体肝脏中存活、增殖并可分化为成熟肝细胞两个重要条件 ,但目前应用的肝细胞来源有限 ,其功能随着培养时间的延长而逐渐下降等问题限制了这一治疗策略的广泛开展。作为具有发育全能性和无限增殖能力的细胞 ,胚胎干细胞向肝细胞的分化研究近年来引起了广泛的关注 ,并取得了较大的进展 ,寻找合适、高效的分化诱导方法是目前研究的热点之一。胚胎干细胞向肝细胞的分化研究既可以为临床细胞替代治疗提供合适的细胞来源 ,也可以在药物评估和肝脏发育分化基础研究方面起到重要的作用。通过概括肝脏和拟胚体分化发育的分子机制 ,对体外胚胎干细胞向肝细胞分化的几种诱导体系作了介绍 ,并对分化肝细胞的应用前景和存在的问题进行了讨论。

摘要:空气中CO₂ 浓度升高所导致的温室效应已成为重大的环境问题 ,受到人们普遍关注。概述了高效固定CO₂ 微藻藻种的筛选和培养方法 ,分析了微藻固定CO₂ 的无机碳利用形式和浓缩机制 ,讨论了高效光生物反应器设计和运行目标 ,简要介绍了微藻 (酶 ) 膜生物反应器集成新技术。并认为今后的研究方向主要是在进一步探索微藻固定CO₂ 有关机理的基础上 ,构建高效固定CO₂ 的转基因微藻 ,开发高效膜生物反应集成系统。

摘要:将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶 启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境 ,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系。

摘要:将PPARγ2基因启动子和报告基因荧光素酶相连接克隆于特定载体构建成表达质粒 ,电穿孔转染小鼠ES细胞 ,筛选阳性克隆。诱导ES细胞向脂肪细胞分化 ,通过定量检测荧光素酶活性跟踪PPARγ2基因的表达情况 ,以此研究脂肪细胞分化过程中该基因的表达模式。结果显示PPARγ2基因在未分化的ES细胞和EB形成的前两天中不表达 ,从EB形成的第 3天开始表达 ,直至脂肪细胞分化完成。该基因在已完成分化的脂肪细胞中的表达远强于在分化中的前脂肪细胞中的表达。首次报道了从小鼠ES细胞到脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式 ,支持了PPARγ2基因为脂肪组织特异性表达基因的已有报道 ,并为脂肪细胞分化机理研究提供了线索。

摘要:pBR32 2 - Red是一种新型重组工程系统 ,它携带了λ-噬菌体Red重组酶基因和一系列调控元件。对pBR32 2 Red最优重组条件进行探索后应用该质粒提供的体内同源重组功能 ,在菌株W3110体内 ,对染色体上的lac操纵子进行了基因修饰 ,包括 :①运用kan-sacB选择反选择方法和重叠引物方法敲除了阻遏基因lacI,②运用kan -sacB选择反选择方法和线性双链DNA介导的DNA重组方法将报告基因lacZ敲入lacA和lacY的位置 ,并且首次测定了报告基因lacZ在这三个结构基因位置的组成性表达情况。结果表明运用不同的重组策略 ,pBR32 2- Red系统都能方便有效地对大肠杆菌W3110染色体进行基因敲除和敲入修饰。

摘要:载脂蛋白AI(apolipoproteinAI,apoAI)是高密度脂蛋白HDL的主要组成成分 ,流行病学研究表明apoAI的含量决定血浆中HDL的高低 ,而HDL具有胆固醇逆向转运的功能 ,起到降低冠心病发生概率的作用。通过大肠杆菌表达系统来生产apoAI的蛋白原proapoAI,蛋白的表达形式为包涵体 ,通过疏水柱进行柱上复性。同时在proapoAI和apoAI之间设计一个酸水解位点 ,通过将蛋白原proapoAI进行酸水解来得到成熟蛋白apoAI。最终得到的成熟蛋白apoAI在结构分析和脂结合特性上都与天然的apoAI相似 ,从而为该蛋白的工业生产上提供了一个良好的基础。

摘要:构建了霍乱毒素B亚单位 (CholeratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素原 (Proinsulin)的融合基因CTB -PROIN ,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET 30a(+)中 ,获得重组质粒pETCPI,并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中 ;重组菌株经IPTG诱导后 ,其表达产物经过 15 %SDS PAGE分析表明该菌株可以表达融合蛋白 ,其分子量约为 21.6kD ,且主要以包涵体形式存在 ,约占全菌蛋白的 25%。含CTB-PROIN重组蛋白的包涵体经过变性和复性后 ,CTB-PROIN可以在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果表明重组CTB PROIN蛋白可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别 ,说明该蛋白具有霍乱毒素和胰岛素的双重抗原性。同时在体外 ,CTB PROIN蛋白可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合 ,表明了该融合蛋白在体外具有生物活性。这些研究结果为利用原核生物表达系统研制廉价、高效的I型糖尿病口服疫苗奠定了基础。

摘要:参照已发表的SARS冠状病毒BJ01株基因序列 ,利用计算机软件预测并选取该病毒S、M、N三种主要结构蛋白部分抗原性优势区域 ,以编码Gly-Pro-Gly序列相连接合成两段嵌合基因A和B。并分别克隆于pGEX -6p- 1载体上用IPTG进行诱导表达 ,以纯化的嵌合蛋白A和B为抗原 ,分别免疫BALB c小鼠制备单克隆抗体。利用单克隆抗体亚型检测试剂盒和SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒对其进行亚型和特异性鉴定。结果表明融合表达两段嵌合基因产物 ,其大小分别为 34kD和35kD ,Westernblot分析证实两种表达产物都能被SARS病人康复期血清所识别。获得了 6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞克隆株。亚型鉴定结果除D3C5为IgG2a外其他单抗均为IgG1,而且所有单抗的轻链均为κ链。特异性鉴定发现除D3D1外 ,其余的 5株单抗均能与SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒发生特异性反应。将D3D1与灭活后经超声波裂解的SARS CoV进行Westernblot分析 ,发现它能特异性识别 180kD的蛋白带。分别融合表达了 6个S蛋白的寡肽 (S1- S6 ) ,并对筛选出的单克隆…

摘要:利用PCR方法扩增炭疽杆菌噬菌体裂解酶 (γlysin)基因 ,克隆至大肠杆菌表达载体pET2 2b中 ,经菌落PCR筛选、序列测定和酶切鉴定证实表达载体pET22b-γlysin构建成功 ,并在EscherichiacoliBL21(DE3)中获得了高表达。目的蛋白约占菌体总蛋白的40% ,5L发酵罐中的产酶水平高达 15g L。菌体经超声破碎 ,制备无细胞抽提液 ,StreamlineSP和SPHP柱层析以及SephacrylS-100凝胶过滤三步纯化 ,得到分子量为 2 7kD单一条带的目的蛋白 ,薄层扫描分析显示其纯度大于 95 %。目的蛋白的收率为19.1% ,纯化倍数为350。生物活性鉴定重组的γ噬菌体裂解酶具有特异性 :可快速裂解炭疽杆菌 ,比活为 1400u mg左右 ;而对大肠杆菌、枯草杆菌及蜡样芽孢杆菌没有裂解活性。

摘要:运用基因芯片技术研究了NaHCO₃胁迫下柽柳 (Tamarixandrossowii)基因的表达。将Cy5和Cy3两种荧光染料分别标记在NaHCO3处理和对照的柽柳cDNA上 ,将两种荧光探针混合 ,与载有柽柳基因的高密度芯片进行杂交并用芯片扫描系统进行扫描 ,通过Cy5与Cy3信号强度比值的计算研究基因的差异表达。共获得了 89个差异表达的基因 ,其中 ,27个下调表达 ,62个上调表达。BlastX分析表明这些基因按功能可以分为光合作用、活性氧清除、渗透调节、信号传导与表达调控、代谢、发育相关、核糖体蛋白、蛋白质的分解与再生、转运类蛋白、水通道蛋白等几大类别。同时 ,发现了一些与盐胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因 ,这些基因可能在柽柳抗盐过程中具有重要作用。揭示了柽柳的抗盐胁迫涉及的几种重要途径 ,并获得了NaHCO₃胁迫前后柽柳基因表达谱。

摘要:生物芯片技术是 90年代初发展起来的一门新兴技术 ,将给 2 1世纪生命科学和医学研究带来一场革命。其中生物芯片中的微阵列分析最为关键 ,尤其受到人们的关注和研究。微阵列形成主要由各种探针接触式点样而得的。微机电系统(MEMS)的兴起和发展为点样探针的制备提供了简单而有效的微细加工技术。介绍了基于MEMS技术的SiO₂ 基微悬臂梁探针的设计和制备 ,并用这种探针进行Cy3标记链亲和素点样。结果表明这种微悬臂梁探针可以点样 2～3μm的样点 ,并且一次取样可以点样至少 3000个点,从而实现高价生物微阵列点样。

摘要:在 1 2MS液体培养基上研究了不同理化因子对水母雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响。实验结果表明 :氮源总浓度 (包括NH+4和NO-3)为 30mmol L ;NH⁺₄ NO^-₃比例为 5∶2 5 ;2 %蔗糖和 3%葡萄糖组合 ;0.5mg LGA₃和 0.5mg LIBA ;pH5.8;18h d的光照 (光强为 35.0.0lx) ;2.4℃ ;摇床转速为 100rmin有利于毛状根生长及总黄酮的生物合成。在此培养条件下 ,经过21d的培养毛状根生长量达到 12.8g L(DW) ,总黄酮合成量为 192.2mg L ,即总黄酮含量占毛状根干重的 15 % ,约为干重野生水母雪莲植株总黄酮含量的 2.5倍。

摘要:近年来的研究表明 ,CD4分子于细胞膜表面不仅以单体形式存在还可以通过其D4和D1形成同源二聚化及寡聚化 ,并且二聚化及寡聚化的CD4分子才能稳定地与MHC Ⅱ类分子结合。通过分析CD4分子以及CD4缺失突变体分子融合Fas基因片段所诱导的转染靶细胞的凋亡 ,以及携带绿色荧光蛋白的CD4分子转染HEK2 93细胞所筛选出的稳定克隆的不同荧光强度和与MHC Ⅱ类分子阳性细胞Raji之间的不同黏附效应间接鉴定CD4同源二聚体或寡聚体的存在 ,并对二聚化或寡聚化CD4分子所介导的生物学功能进行初步分析。

摘要:通过愈伤组织诱导和直接不定芽再生途径 ,建立了药蒲公英的快速高效再生系统。叶片外植体在含0.2mg LIAA和1mg LTDZ的MS培养基中培养 2周后便产生大量的丛生芽 ,在含有 0.5mg/L 2 ,4D和2mg/L 6BA的MS培养基中培养 30d后 ,形成明显的愈伤组织 ,愈伤组织块在含10mg/L 6BA的MS培养基中成功再生。对 9株再生植株进行RAPD检测表明 ,部分植株在DNA水平上发生了变异。与对照相比 ,再生植株的主要抗氧化成分无明显变化 ,保证了有效成分的稳定。

摘要:研究了产自于一株节杆菌的肌酐水解酶。该肌酐水解酶经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE Cellulose离子交换、疏水层析后 ,酶提纯了145倍 ,比活力达209u mg。SDS-PAGE测定显示该酶亚基质量为33.7kD。对酶特性的研究表明 :酶在pH6 0～90、60℃以下稳定 ,对肌酐的Km值为21.14mmol L。Ag⁺ 、Hg²⁺ 和邻菲罗啉能使酶完全丧失活性 ,Co²⁺ 、Mn²⁺ 对酶活性有明显促进作用。

摘要:为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HAS)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HAS-AX15 (R13K)。HAS-AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HAS融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg/kg的HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg/kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HAS-AX15(R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。

摘要:利用谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,获得了大小约为60kD的融合蛋白GST-GP5-M ,Westernblot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P56-ELISA检测方法 ,与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为 94.1% ,表明建立的P56-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。进一步分析了P56-ELISA检测结果与血清中和试验的相关性 ,经回归函数分析 ,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5 M抗体水平 (OD_630nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高。

摘要:对抗狂犬病毒scFv进行稳定性改构 ,纯化制备有活性的人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段 (dsFv) ,然后对其生物学活性进行研究。将dsFvV_H 、V_L 基因在原核表达系统pET22b(+) BL21(DE3)中表达 ,将其包涵体分别在变性缓冲液中溶解 ,稀释后加入折叠缓冲液使其折叠形成有活性的dsFv抗体片段 ,上Ni-NTA柱进行纯化。然后以其亲本scFv作为对照 ,对dsFv的亲和力、稳定性以及体外中和活性进行评价。结果显示 ,与其母本抗体scFv相比 ,改构后的抗狂犬病毒dsFv保持了对狂犬病毒Vero疫苗的特异性识别能力 ,而且其亲和力明显提高 ;抗狂犬病毒dsFv在血清和BSA中的稳定性有明显的改进 ,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进 ;蚀斑减少中和实验显示 ,抗狂犬病毒dsFv抗体片段能特异中和狂犬病毒 ,阻止狂犬病毒对Vero细胞的吸附 ,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染 ,从而导致蚀斑减少甚至消失 ;scFv抗体片段仅可部分抑制蚀斑的形成 ,但不能全部抑制。这为进一步研究抗狂犬病毒dsFv基因工程抗体的免疫保护作用及其在临床的应用奠定了基础。

摘要:为阐明谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与菌体的生长以及谷氨酸合成之间的关系 ,以谷氨酸棒杆菌基因组测序用典型菌株Corynebacteriumglutamicum ATCC 130 32为出发菌株 ,构建了乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株Corynebacteriumglutamicum WTΔA。该菌株没有异柠檬酸裂解酶活性 ,不能在以乙酸盐为唯一碳源的基本培养基上生长。与出发菌株ATCC13032相比 ,WTΔA在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长时不受影响 ,说明谷氨酸棒杆菌并不需要乙醛酸循环途径提供菌体生长所需的能量和生物合成反应所需的中间产物。但是 ,与出发菌株ATCC13032相比 ,WTΔA的谷氨酸合成能力大幅下降。

摘要:目前螺旋霉素生物合成的发酵杂质含量过高 ,导致成品收率过低 ,杂质含量不符合药典规定。为解决这一问题 ,首先利用LC -MS联用技术定性分析了 4种螺旋霉素发酵杂质的结构 ,结合螺旋霉素生物合成途径分析 ,它们都起因于螺旋霉素生物合成糖基化过程的紊乱。氮源尤其是铵盐对螺旋霉素生物合成糖基化过程有重要的调节作用。进一步的氮源优化使螺旋霉素发酵液中 4种杂质含量降低 22%～88% ,杂质含量全部低于欧洲药典标准。

摘要:研究了膜 生物硝化反应器对含氨废水的处理效能以及分离膜的截留和渗透效能。膜_生物反应器启动迅速 ,在水力停留时间为 1d的情况下 ,反应器最高进水浓度达 80mmol(NH₄⁺-N)·L^-1 ,最高容积负荷达 1 12kg(NH₄⁺ -N)·m^-3·d^-1 ,氨氮去除率保持在 95%以上。试验证明 ,分离膜对微生物有良好的截留作用 ,50天内反应器的污泥浓度从 5g·L^-1 增长到 10g·L^-1 ,分离膜表面附着的生物层则对废水氨氮和亚硝氮有进一步的转化作用。在液位差低于 80cm时 ,提高液位差可增大膜渗透通量 ;液位差超过 80cm后 ,增大液位差的膜渗透通量效应很小 ;其中 ,当液位差为 2 0cm左右时 ,膜通量达 2 . 5 1L·m^-2 ·h^-1 ,阻力最小 [(2 . 6 3× 10^-5)m^-1]。该膜_生物硝化反应器可依靠液位差压力驱动出水 ,无需外加动力。

摘要:建立了两步连续离子交换制备色谱分离、纯化聚乙二醇与重组人粒细胞集落刺激因子 (Recombinanthumangranulocytestimulatingfactor,rhG_CSF)偶联物的方法。首先用阳离子交换色谱将偶联蛋白质和非偶联蛋白质分开 ,然后使用阴离子交换色谱去除过量的游离聚乙二醇杂质 ,并分离纯化偶联蛋白异构体分别得到单聚乙二醇化、双聚乙二醇化和三聚乙二醇化的rhG-CSF。它们经十二烷基磺酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析均为单带。采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析三种偶联蛋白质的分子量 ,分别为 23.8kD、28.6kD、33.8kD。用噻唑蓝 (MTT)比色法 ,以粒细胞集落刺激因子的依赖细胞株NFS_6 0为靶细胞 ,测定重组人粒细胞集落刺激因子及其与聚乙二醇的偶联物的体外细胞生物学活性 ,单聚乙二醇化、双聚乙二醇化和三聚乙二醇化的rhG_CSF体外活性保留率分别为 92 %、75 %、4 3%。

摘要:设计并合成多个60bp左右的DNA小片段 ,经重叠延伸PCR扩增获得1640bp的抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体完整基因片段 ,将其克隆入真核定点表达载体pcDNA5 FRT中 ,脂质体法转染Flp-In^TM CHO细胞 ,获得稳定表达细胞株 ,目的蛋白在上清中的表达量约为 300μg/L。采用Ni_NTA柱对其进行了纯化 ,经SDS-PAGE蛋白电泳及Western-blot分析结果表明 ,含组氨酸标签的目的蛋白的分子量约为 70kD ,与预期结果一致。活细胞间接免疫荧光实验和玫瑰花环实验证明抗CD3抗CD20双特异性单链抗体具有与Ramous(CD20+)及Jurkat(CD3+)细胞特异性结合的活性。光学显微镜下可以观察到抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体可以有效介导人外周血淋巴细胞裂解B淋巴瘤细胞Ramous。以上工作为进一步了解抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体的体内体外生物学活性奠定了基础。

摘要:参照APP血清 1型apxIVA基因序列合成了一对特异性引物 ,从本实验室分离鉴定的胸膜肺炎放线杆菌 (APP)血清 2型中扩增了apxIVA基因 5′端 2445bp的片段。将该片段克隆到原核表达载体pET-28b的T7启动子下游 ,与 6×HisTag融合 ,再转化大肠杆菌BL21(DE3) ,在IPTG的诱导下表达大小约 90kD的蛋白。表达产物以包涵体的形式存在 ,且能与APP标准阳性血清发生特异性反应。将包涵体变性和复性后包被酶标板建立了间接ELISA方法 (ApxIVA-ELISA) ,特异性良好。用ApxIVA-ELISA检测猪胸膜肺炎三价 (1、2和 7型 )灭活菌苗和基因工程类毒素菌苗免疫猪血清抗体均为阴性 ,而 1、2、7型APP活菌感染动物的血清抗体均为阳性。实验证明 ,ApxIVA-ELISA不仅可以用于检测所有血清型APP的抗体 ,而且还可以用于APP自然感染猪和灭活菌苗免疫猪的鉴别诊断。

摘要:蛋白激酶C家族是一类磷脂酰丝氨酸依赖丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶。PKCδ(蛋白激酶Cδ)是蛋白激酶C家族成员。PKCδ的异常激活将会导致糖尿病和多种癌症的发生 ,因此 ,PKCδ的特异性抑制剂能成为治疗这些疾病的潜在药物 ,如能以PKCδ为分子靶点来筛选特异性抑制剂 ,就可以建立癌症及糖尿病的药物先导化合物筛选模型。通过RT-PCR的方法 ,克隆了鼠源的PKCδ,并构建了哺乳动物细胞表达载体 ,获得了可稳定表达PKCδ的COS1细胞株。通过亲和吸附的方法获得了较为纯净的PKCδ ,并对酶学活性作了进一步的分析 ,建立了以PKCδ为靶点的药物先导化合物筛选模型。

摘要:以piezo操作系统为技术支撑 ,在掌握小鼠卵母细胞胞浆内精子注射技术 (ICSI)的基础上 ,进行了ICSI技术生产试管小鼠的尝试。来自成年昆明 (KM)小鼠附睾尾的新鲜精子 ,剪切去尾后 ,直接将精子头注射到B6D2F1小鼠卵母细胞质中 ,注射后 1h ,83.3%的卵母细胞存活。6h时 ,84.0 %的成活卵子成功受精 ,形成原核 ,排出PB2 体外培养的ICSI胚胎 ,卵裂率 (98%vs 94.7% )和 4-细胞期胚胎比率 (89.5%vs 92.1% )均与培养的体内受精卵没有差异 (P >0.05 ) ;但是 ,桑椹胚(63.8%vs84.2% )和囊胚发育率 (25.7%vs68.4% )极显著地 (P <0.01)低于对照组。120枚原核期胚胎移植给 7只假孕受体后 ,4只受孕小鼠共产出 28只ICSI小鼠 (23.3% )。健康成年的 25只ICSI小鼠都没有明显的生理和行为异常。随机选择其中的 20只小鼠 ,分别进行ICSI小鼠间、ICSI与KM小鼠间共 12组的交配 ,结果所有雌鼠妊娠产仔。在成功建立小鼠ICSI技术的基础上，成功获得了我国的首例ICSI小鼠，并且证明这些ICSI小鼠都具有正常的繁殖后代的能力。

摘要:为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1-33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位点HindⅢ ,经过简单的酶切后 ,将产物按各种组合连接 ,构建了抑制素串联 2至 6聚体基因。含3至6聚体基因的重组质粒pR 3INH、pR 4INH、pR 5INH和pR 6INH经IPTG诱导均能在大肠杆菌 (E .coli)BL21(DE3)中表达目的蛋白 ,分别占菌体蛋白的 6 %、6 %、7%和 8% ,且都以包涵体形式存在。结果说明 ,利用同尾酶切技术可以快速正确地构建短肽片段的串联多聚体重组质粒 ,为构建短肽半抗原的高免疫原性基因工程疫苗提供了新的思路。

摘要:根据H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物 ,从本室分离并保存的H9N2亚型禽流感病毒中扩增了预计约 16 83bp的血凝素基因 ,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体 ,限制性酶切及序列测定后 ,进一步将其亚克隆到pGEX-KG中 ,与GST蛋白融合表达。SDS-PAGE和Western印迹表明缺失信号肽后的HA基因在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有免疫学活性 ,融合蛋白的分子量约为 90kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,利用复性产物作为抗原包被酶标板建立了检测H9亚型禽流感抗体ELISA方法。结果表明应用HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点 ,可用于H9亚型禽流感抗体的检测。

摘要:大豆花叶病毒病是危害大豆产量和品质的主要病害之一 ,通过分子手段研究大豆花叶病毒病基因的抗病相关基因表达可以辅助抗病育种工作。利用SSH技术 ,对抗大豆花叶病毒病的大豆品种 814 3进行分析 ,构建大豆花叶病毒胁迫诱导表达的cDNA文库 ,并对文库进行初步分析。

摘要:溶栓疗法是血栓性疾病安全有效的治疗手段 ,开发新型纤溶酶具有实际应用意义。分离自南方小酒药的根霉 12^#以豆粕和麸皮为原料可产生纤溶酶。已采用盐析 ,疏水层析、离子交换层析和凝胶层析方法对纤溶酶分离提纯。提纯的纤溶酶比活力 2143u/mg(尿激酶单位 ) ,有直接溶解血栓和激活纤溶酶原的双重溶栓作用 ,降解纤维蛋白α、β和γ肽链速度快 ;最适作用温度 4 5℃ ,适宜作用pH范围 6.8～8.8;等电聚焦方法测定该酶等电点 8.5± 0.1;只分解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA ,其米氏常数K_m 为 0.23mmol/L ,酶转换数K_cat为 16.36s^-1;Molish实验和甲苯胺蓝实验均证明该酶为糖蛋白 ,地衣酚_硫酸法测得该酶含糖量 470% ;EDTA、PMSF、PCMB对该纤溶酶有抑制作用 ,说明活性中心含有巯基、金属和丝氨酸 ;N端12个氨基酸序列为NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly,与其它生物来源的纤溶酶相比较没有同源性。根霉 12^#产生的纤溶酶为新型纤溶酶，有希望开发成溶栓药物。

摘要:研究了利用粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis)发酵生产热凝胶的发酵条件 ,氮源是菌体生长的限制性底物 ,单纯地提高初始底物 (氮源 )浓度并不一定能促进细菌的生长和产物的合成。在分批发酵过程中 ,底物消耗导致培养环境pH的改变也是影响细菌进一步生长和产物合成的重要因素。通过增加培养基中初始氯化铵的浓度并同时控制发酵过程的pH条件 ,得到了较高的菌体浓度 ,热凝胶的合成水平也得到了显著提高。当培养基中NH₄Cl浓度提高到3.6g/L时 ,菌体浓度达到72g/L ,热凝胶合成的产量可达 30.5g L ,比原来NH₄Cl浓度为11g L时提高了51.7%。提高菌体浓度意味着需要提高溶氧水平来满足细菌的生长和代谢。初始氮源NH₄Cl浓度的增加虽然能使菌体浓度得到提高 ,但发酵过程对溶氧的需求也相应增加 ,需要提高搅拌转速和通风以增加供氧水平。但高搅拌速率产生的高剪切力对热凝胶的凝胶性能将产生破坏作用 ,因此在发酵过程中需要综合考虑细菌培养密度对合成热凝胶产量和质量的影响。

摘要:介绍一种新的方法构建近随机多肽文库。选取从大基因组物种的组织或细胞中提取的基因组DNA ,利用切割频率高的限制性内切酶切割 ,产生的短片段可以近似地认为是随机序列的片段 ,将它们与匹配的载体连接后转化进宿主细胞进行表达 ,从而获得近随机多肽文库。这样的文库可以用于蛋白质相互作用的研究。同一种基因组DNA可以利用不同的酶切 ,再分别连接到表达载体的不同读码框架 ,从而产生不同编码序列的多种近随机多肽文库。介绍了充分利用烟草基因组DNA构建两种不同酶切 ,三种读码框架 ,共六种不同编码序列的近随机多肽文库的方法。

摘要:为提高畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度 ,应用抗血清和磁性微珠首次制备弯曲菌免疫磁珠 ,利用弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中目的菌 ,不需要增菌培养 ;通过荧光PCR检测鞭毛蛋白A(flaA)基因和 或马尿酸酶 (hipO)基因 ,首次建立空肠弯曲菌的磁捕获_荧光聚合酶链反应 (IMC_FPCR)方法。IMC_FPCR法检测空肠弯曲菌方法简便易行 ,可在 2 4h内完成 ,特异性好 ,检测低限达到 10cfu mL ,抗干扰性强。IMC_FPCR方法可望解决非可培养状态的空肠弯曲菌检测难题 ,是一种适用于检验检疫、卫生防疫和农产品安全检验等领域的快速方法。