摘要:白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。

摘要:生长素在植物的整个生长发育过程中都具有重要的作用, 其早期响应基因可归为3类: Aux/IAAs、GH3s、SAURs。通过功能基因组学的研究, 特别是对相关突变体的分子遗传学与分子生物学的研究, 使我们对这些基因家族的作用机理的理解更为深入。以下综述了植物GH3基因的结构、功能及表达调控模式, 重点介绍了由GH3介导的生长素信号途径与其他信号转导途径之间的互作和GH3基因与植物逆境胁迫适应的关系。

摘要:植物经历冷驯化后抗冻能力会有所提高。利用cDNA-AFLP方法从经过0oC冷驯化处理的小立碗藓中筛选到差异表达的Pp-LIM only A基因片段。cDNA和基因序列比较分析表明此基因含有7个内含子和8个外显子, 编码由345个氨基酸残基组成的蛋白质, 其中只含有一个LIM结构域, 与动物蛋白质PDZ/LIM家族有很高的同源性, 推测是一种新的植物LIM蛋白。实时定量PCR分析显示其在冷驯化6 h后表达量即开始明显增加, 并随着冷驯化时间的延长表达量大幅度提高。Pp-LIM only A蛋白可能通过LIM结构域对细胞骨架的作用而影响了细胞膜的稳定性, 本研究对其在抗冻中的作用作了进一步讨论。

摘要:为了延长人促红细胞生成素(hEPO)体内半衰期以达到更好的药效, 制备通过柔性接头相连接的重组人红细胞生成素-IgG1 Fc融合蛋白(rhEPO-L-Fc), 并对其生物学活性和体内药动学进行初步研究。利用PCR技术构建rhEPO-L-Fc融合基因, 克隆至表达载体pOptiVEC-TOPO?, 在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)表达。Protein A 亲合层析柱纯化融合蛋白, SDS-PAGE、质谱、Western blotting鉴定表达产物, 细胞增殖实验检测融合蛋白的体外活性, 动物实验检测融合蛋白的体内活性和半衰期。成功构建pOptiVEC-TOPO?-rhEPO-L-Fc重组子, 实现了在CHO细胞表达,纯化后的rhEPO-L-Fc融合蛋白经鉴定, 其分子量和特异性均与理论值相符, 能刺激体外培养的EPO依赖型细胞生长, ED50 为2 ng/mL, 且明显增加大鼠外周血网织红细胞数, 体内消除半衰期达到27 h。rhEPO-L-Fc融合蛋白能延长hEPO体内半衰期, 为其临床研究奠定了基础。

摘要:FADD是Fas/FasL系统的一个信号连接蛋白, 通过传递凋亡信号, 介导细胞凋亡。为了揭示FADD在牛卵泡发育过程中的调控作用, 采用RT-PCR从牛卵巢组织中扩增FADD基因, 将其cDNA终止密码子删除, 采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-Nl中, 构建融合蛋白重组质粒, 经BglⅡ/EcoRⅠ酶切、测序鉴定后, 用脂质体介导质粒转染CHO-K1细胞, 观察有无荧光的表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、表达情况。结果表明, 成功克隆牛FADD基因, 通过PCR方法在FADD阅读框两端引入了Bgl Ⅱ和EcoRⅠ克隆位点, 并于起始位点前加入Kozak序列, 成功构建pAcGFP- bFADD融合蛋白真核表达载体, 重组质粒转染CHO-K1 24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光, 转染效率可达65%, 通过RT-PCR扩增出654 bp的转录产物, 并用Western blotting检测到51.4 kD目的蛋白的表达。

摘要:在细胞表面表达具有某种功能的蛋白后, 这些细胞就具备了某些新功能, 可以对其进行功能研究和应用。将功能蛋白连接到某些跨膜蛋白的胞外区是实现目的蛋白表达于细胞表面的手段之一。本研究比较了2种跨膜蛋白A2TM和△LNGFR携带外源蛋白－myc于细胞表面的能力。利用重叠PCR法合成的A2TM和△LNGFR基因片段与载体pEF/ myc/ER和载体LL3.7进行酶切、连接、转化、鉴定, 成功构建了pEF-A2TM、pL-A2TM和pL-LN真核表达载体。利用磷酸钙沉淀法转染293FT细胞, 荧光显微镜下观察EGFP的表达、流式细胞术检测myc在细胞表面的表达情况, Western blotting检测myc目的蛋白的表达。pL-A2TM和pL-LN转染293FT细胞36 h后的荧光强度基本相同, 表明A2TM和△LNGFR在细胞内表达的强度相似。流式细胞术分析显示, △LNGFR和A2TM均可在细胞表面表达, 但A2TM只有在指示蛋白EGFP表达非常高的情况下才能在细胞表面被检测到。Western blotting显示△LNGFR表达量很高, 而A2TM没有达到检测水平。结果表明, 以糖基化形式存在的△LNGFR比没有糖基化的内源A2TM的表达更稳定, A2TM在表达量低时可能易被细胞内的蛋白酶降解, 因而△LNGFR是一种能携带外源蛋白于细胞表面的比较理想的跨膜蛋白。

摘要:为发现TRPV3调节剂, 通过荧光成像分析系统检测钙浓度, 建立高通量筛选瞬时受体势V3通道(Transient receptor potential V3, TRPV3)调节剂的细胞模型。将TRPV3表达载体转染人胚肾(HEK-293)细胞, 抗生素筛选稳定表达TRPV3的细胞系, 选取TRPV3特异性调节剂作用于细胞模型, 应用荧光成像分析系统测钙实验检测TRPV3高表达细胞系药理学特征, 同时优化实验条件, 考察模型的稳定性, 并评估应用于96孔板及384孔板进行高通量筛选的可靠性及准确性。获得了高表达TRPV3的HEK-293稳定细胞系, 通过TRPV3离子通道调节的钙流信号与TRPV3特异性调节剂成剂量依赖关系, 优化得到了最适筛选条件, 该模型稳定, 灵敏, 通过Z因子及Spiking检测, 完全符合高通量筛选需求。利用此细胞模型通过检测钙信号可筛选TRPV3调节剂。

摘要:A型流感病毒H5N1的M2离子通道(H5M2)基因经优化后由人工合成, 适合于哺乳动物细胞中表达。通过酶切克隆于pcDNA4质粒, 并在HEK293细胞中建立稳定细胞株。Western blotting和免疫荧光证实H5M2在稳定细胞中只有在四环素诱导下才能表达, 并经膜片钳证实在HEK293细胞中表达的H5M2具有H+通道活性, 为M2离子通道功能的研究和M2离子通道阻断剂筛选方法的建立提供了参考。

摘要:胶原与壳聚糖是两种具有较好生物相容性和一定力学强度的天然高分子, 可在肌腱组织工程中用于细胞外基质的构建, 但二者单独使用时各有不足。本研究利用二者性能上的互补, 在一定的外力场作用下, 采用EDC/NHS对2种天然高分子材料进行共价交联, 获得具有一定空间取向和力学强度的多孔支架, 然后引入细胞黏附因子RGD进行表面修饰, 构建了具有较好组织相容性和细胞亲和性及适当降解速率的人工肌腱组织细胞外基质。对基质材料的力学性能、亲水性、体外降解速率等的检测和显微观察结果显示: 所构建的多孔支架材料柔软富有弹性, 抗拉强度达: 15.0 Mpa, 相应形变为: 7.33%; 孔隙率: 79.4%; 吸水率: 772%; 保水率: 206%; 在RPM1640培养液(含10%胎牛血清)和人血清中, 3周总降解率分别为: 4.13%和37.2%, 其降解速率可与肌腱修复周期相吻合, RGD修饰后材料对3T3-L1细胞具有较好的亲和性。有望成为理想的人工肌腱组织和人造皮肤细胞外基质, 或整形手术的软组织填充材料。

摘要:NS1蛋白为流感病毒非结构蛋白, 只在病毒侵入宿主细胞后产生。目前NS1蛋白对细胞整体水平上的作用仍不清楚, 为了解NS1蛋白在病毒感染细胞中的作用, 构建了重组质粒pCMV-myc-NS1并将其转染A549细胞, 利用双向电泳技术检测了受NS1蛋白调控的宿主蛋白, 以期从蛋白质组水平上研究禽流感病毒与宿主细胞间的相互作用。同时, 还检测了转染NS1对细胞增殖和细胞周期的影响。结果显示, NS1在细胞中的表达, 能够明显引起宿主细胞代谢的变化, 并通过阻滞细胞周期的正常进行而减缓细胞的增殖。

摘要:聚集现象是目前基因重组抗体面临的挑战之一。采用高效排阻色谱(HPSEC)、动态光散射(DLS)、SDS-PAGE和间接ELISA鉴定抗ErbB2嵌合抗体chA21聚集的形式和性质, 并比较温度和添加剂对抗体聚集程度、抗原结合活性的影响, 用圆二色谱(CD)检测不同聚集条件下蛋白构象的变化, 最后将抗体酶解分离分析聚集的部位。结果表明: chA21在溶液中可形成二聚和更高形式的聚集, 聚集体是通过非共价键相互作用形成, 并仍保留抗原结合活性, 聚集程度和活性受温度和添加剂影响, 而蛋白质的构象相对稳定, 抗体可变区的相互作用可能是引起聚集的主要原因之一。对抗体聚集现象的分析有助于建立稳定的抗体保存条件, 并为今后抗体进一步改造提供依据。

摘要:以pET28a为起始质粒, 构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a, 得到表达载体pEV, 在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达; 并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应, 生成环化的DnaB-N蛋白。将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置, 转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽 (含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库。随机挑取20个克隆, 测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列; 挑取其中9个克隆进行表达,结果表明可产生大量的融合蛋白, 90%的融合蛋白在16oC表达20 h后发生体内剪接。将在30oC表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化, 通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量。

摘要:利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus) YX01具有菊粉酶生产能力且乙醇发酵性能良好的特点, 直接发酵菊粉生成乙醇。在摇瓶中考察了该菌株最适发酵温度, 进而在2.5 L发酵罐中考察了通气量和底物浓度的影响。实验结果表明: 该菌株最适发酵温度为35oC; 在通气量为50 mL/min和100 mL/min时菌体生长加快, 发酵时间缩短, 但在不通气条件下糖醇转化率明显提高; 在菊粉浓度235 g/L时, 发酵终点乙醇浓度达到92.2 g/L, 乙醇对糖的得率为0.436, 为理论值的85.5%。在此基础上, 使用近海滩涂种植海水灌溉收获的菊芋为底物, 以批式补料方式直接发酵菊芋干粉浓度为280 g/L的底物, 发酵终点乙醇浓度为84.0 g/L, 乙醇对糖的得率为0.405, 为理论值的80.0%。这些研究工作, 为以菊芋为原料的燃料乙醇技术开发奠定了基础。

摘要:对法夫酵母的不同补料发酵方式进行了研究。基于底物抑制模型, 提出了一种优化的两阶段补料策略, 用于法夫酵母产虾青素的高密度发酵。在发酵的延迟期和对数生长期早期, 糖浓度控制在25 g/L左右, 在此条件下, 生物量可以达到最大, 且时间缩短。在对数生长期后期及稳定期, 糖浓度控制在5 g/L, 虾青素的合成时间可以有效延长。与传统的补料方式相比, 采用此补料策略取得了较好的发酵效果。发酵终点细胞干重达到23.8 g/L, 虾青素产量达到29.05 mg/L, 分别比分批发酵提高了52.8%和109%。

摘要:传统丙酮丁醇发酵的产物浓度太低, 蒸馏回收发酵产品大量耗能。为研究探讨直接利用发酵产物的可能性, 在15%高初始玉米醪浓度条件下、以地沟生物柴油为萃取剂, 探讨了生物柴油添加量、萃余液回用率、和添加微量电子供体对丁醇发酵耦联生产改良型生物柴油过程各主要性能指标的影响。通过环境条件优化, 地沟生物柴油的质量显著提高, 16烷值由51.4提高至54.4; 添加微量中性红后“丁醇实质性得率”可以达到18%, 耗能的发酵产品回收过程有望省去; 萃余液回用率超过50%, 有望逐步向国家所大力倡导的“节能减排”的工业生产模式靠近。

摘要:血管抑制因子(Vasostatin, VAS), 为集钙蛋白N-末端180个氨基酸大小的蛋白, 是一种内源性血管生成抑制因子, 对多种肿瘤的生长具有很强的抑制作用。近期有研究显示, VAS可以促进神经内分泌肿瘤的恶化, 提醒我们在开发该抗肿瘤药物时必需非常谨慎。将VAS cDNA插入腺相关病毒-2表达质粒pAAV-2, 采用无辅助病毒参与的三质粒共转染法制备rAAV-VAS病毒。体外分别转染小鼠胰内皮细胞MS1和结肠癌细胞HCT-116, MTT法测定对细胞生长的影响, Western blotting方法检测VAS的表达。采用小鼠皮下移植瘤模型, 验证VAS的表达对肿瘤生长、新生血管密度、以及细胞增殖的作用。结果证明构建的rAAV-VAS病毒载体, 能抑制小鼠胰内皮细胞的生长, 转染HCT-116后能有效表达VAS蛋白, 但HCT-116的体外生长不受影响。瘤体注射rAAV-VAS后, HCT-116移植瘤在小鼠体内的生长速度明显减缓,肿瘤新生血管密度明显降低。结果显示, rAAV-VAS可以抑制HCT-116移植瘤的新生血管形成, 但对其细胞增殖无明显作用。

摘要:为解释以凝血因子Xa（FXa）的识别序列为连接肽的葡激酶和水蛭素的融合蛋白（命名为SFH）在体内的强溶栓和低出血的特征，研究分析了SFH的两个血栓靶向性作用机理。首先采用ELISA和免疫组化的方法在体外分析了由水蛭素游离的C末端赋予的SFH对血栓的靶向性，结果显示SFH对凝血酶和富含凝血酶的血栓具有更高的亲和力。为阐明SFH抗凝活性在血栓部位的靶向性释放，构建表达了仅在水蛭素N末端连接FXa识别序列的水蛭素衍生物（命名为FH）。体外试验结果表明完整的FH无抗凝活性，在体内FH可以发挥抗栓作用，且出血副作用较低，这些结果说明FXa的识别序列可以封闭水蛭素的抗凝活性，在体内FH可以由于FXa的成功裂解而释放其抗凝活性，且其抗凝活性可能仅局限于血栓局部。这就间接说明了SFH的抗凝活性可以在血栓局部进行靶向性释放。以上两个血栓靶向性作用机理是SFH在体内发挥更高溶栓效率和降低出血副作用的重要机制。

摘要:血管内皮生长因子受体(VEGFR)是血管内皮生长因子的特异性受体, VEGFR-2在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用。为在大肠杆菌中实现可溶性的人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达, 并鉴定其与配体结合的活性。采用重叠PCR的方法合成人血管内皮生长因子KDR胞外3区基因, 将该基因与高效表达载体pET-32a重组, 转化大肠杆菌Rosetta (DE3)中, 表达产物依次经过CM阳离子交换树脂和镍柱亲和层析纯化。利用ELISA法和体外抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞增殖实验检测表达产物与配体结合的活性。SDS-PAGE 显示, 目的蛋白主要以可溶性Trx-KDR3融合蛋白表达于胞质, 30oC时1 mmol/L IPTG诱导细菌5 h融合蛋白表达量约占胞质可溶性总蛋白的20%, 经CM阳离子交换树脂和镍柱亲合层析纯化得到纯度为95%的产物, Western blotting鉴定是目的蛋白。ELISA和体外HUVEC细胞增殖实验显示, 表达产物具有特异性结合hVEGF165的活性, 且该作用呈一定的浓度依赖性。具有配体特异性结合活性的可溶性人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区成功表达, 为靶向血管抗肿瘤治疗和相关抗体的研究奠定了基础。

摘要:从序列出发预测某蛋白质是否为脂肪酶以及属于哪种脂肪酶具有重要的理论和应用价值。提出了基于Z标度和T标度的伪氨基酸组成方法提取序列特征值, 采用了k-近邻算法回答上述问题。经参数选择后, 三种方法在各自最优运行参数下, 其10倍交叉验证的结果为: 对脂肪酶和非脂肪酶预测精度分别为92.8%、91.4%和91.3%; 对脂肪酶类型预测的精度分别为92.3%、90.3%和89.7%。其中基于Z标度伪氨基酸组成效果最佳, 基于T标度的次之, 但均明显优于其他6种常见的特征值提取方法, 并对其可能的原因进行了探讨。

摘要:hUBE2W是新近鉴定出的一种I型泛素结合酶, 可能在肿瘤发生和DNA损伤修复过程中起重要作用。RNA干涉是指通过形成局部双链RNA进而特异性地降解细胞内同源基因mRNA的机制, 目前已成为基因功能研究的有力工具。通过构建H1-U6双启动子RNAi载体, 可以在体内直接转录出针对hUbe2w基因的两段互补小RNA, 更接近于生理状态下小干涉RNA的作用。利用RT-PCR方法从293FT细胞总RNA中扩增出hUbe2w基因, 分别将其连接至质粒pGL3-Control、pCMV-myc和pDsRed-express-C1中, 以便在mRNA水平和蛋白水平检测RNA干涉效果。RNA干涉载体分别与上述报告载体共转染293FT细胞, 测定萤光素酶活性和hUBE2W蛋白表达水平, 结果显示靶点125和259能够在mRNA水平和蛋白质水平显著降低hUbe2w的表达。

摘要:为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞, 我们在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体。采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段, 然后克隆到pMD19-T载体上进行测序, 经双酶切回收目的基因片段后, 将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上, 转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠, 最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体。用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性, 间接ELISA法测定该抗体的效价。序列分析表明, 我们所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp, 原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的。本文成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG, 且GST- RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达, 表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上。制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白, 其效价达1:20 000。获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础。

摘要:利用启动子捕获对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。敲除动物的Prnp可使其具有抵抗Prion病感染的能力。采用启动子捕获策略, 构建了牛Prnp启动子缺陷型打靶载体BoPrneo, 线性化后, 再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞BFF, 用250 mg/mL G418进行药物筛选, 共得到99个药物抗性细胞克隆。对细胞克隆进行PCR、测序及Southern blotting鉴定, 结果表明, 其中的4个细胞克隆为中靶细胞, 说明牛胎儿成纤维细胞中的Prnp一条等位基因被成功敲除。本研究为牛Prnp的敲除提供了一种简单、安全、有效的方法。

摘要:研究了Penicillium janthinellum菌株GXCR对低品位黄铜矿中的Cu和Fe的生物淋滤浸出。结果表明摇浸淋滤效率优于静置浸没淋滤效率, 对Cu的淋滤浸出效果最佳; 在添加最佳碳(10%蔗糖, W/V)、氮源(1.5% NaNO3; W/V)、摇浸淋滤和最佳条件组合(淋滤培养基初始pH 6.0, 矿石大小200目, 矿石浓度5% (W/V)和初始接种菌量3.0×105分生孢子/mL)时, Cu的浸出率达到87.31% (W/W); 摇浸淋滤时影响Cu的生物浸出的主要因素是淋滤培养基初始pH (F>F0.05); 对Cu和Fe淋滤起主要作用的有机酸分别是柠檬酸和草酸; 浸没淋滤效率低是与柠檬酸和草酸产量低有关; GXCR的生物淋滤机制有2种: 柠檬酸和草酸的生化作用和体附着生长所产生机械压力对矿石的破碎作用。