摘要:猪瘟目前在许多国家流行并对养猪业造成巨大损失。虽然常规疫苗(如中国猪瘟兔化弱毒疫苗, 即C株)在猪瘟防控中发挥巨大作用, 但近年来在猪瘟防控中出现的新情况, 如非典型感染、持续性感染及免疫失败等; 同时目前世界上许多国家正开展的猪瘟扑灭计划使得弱毒疫苗的应用受到很大限制。因此, 加强猪瘟病毒在致病机理、传播机制等方面的研究以及加快新型猪瘟疫苗的开发是当务之急。近年来, 反向遗传学技术的发展为猪瘟病毒基因功能研究和疫苗制备方面开辟了新思路。以下回顾了反向遗传操作技术在猪瘟病毒基因功能研究与标记疫苗株构建方面的研究进展, 同时提出了该领域目前面临的问题, 并对其未来发展方向进行了展望。

摘要:基于来源丰富、独特的理化性质及生物学特性的壳聚糖与金属复合成为纳米材料的研究, 引起了研究者广泛的关注。人们利用生物分子或生物有机体合成的金属纳米材料反应条件温和、产物形貌可控、重复性高等特点, 结合金属纳米材料的“尺寸效应”与生物分子的自身特性来提高两者的协同功能, 进一步拓展研究与应用领域的发展。以下针对近年来壳聚糖、壳聚糖体系金属纳米材料的研制及应用等领域进行简要的总结、评述和展望。

摘要:获得无选择标记基因的转基因植物越来越受到研究者的重视。目前, 应用得较广泛的去除选择标记基因的方法有共转化法和位点特异性重组法, 其中位点特异性重组系统中Cre/lox重组系统研究最多。以下介绍了Cre/lox位点特异性重组系统的原理、特点及其近几年在植物中的应用, 针对本实验室在这一领域的研究情况, 重点阐述了Cre/lox系统的应用前景。随着植物反应器研究领域的不断壮大, 去除筛选标记基因是植物反应器研究的必然趋势。

摘要:为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体, 获得有感染性的病毒颗粒, 本研究以胎牛原始生殖嵴为材料, 用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列, 将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2基因序列(GenBank Accession No. NM-001105463)高度同源; 将测序正确的重组T载体用EcoR I和Bgl II酶切, 基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo的相同酶切位点, 成功构建了重组反转录病毒载体pMSCV-sox2。采用脂质体法用pMSCV-sox2转染包装细胞PT67, 同时用pMIG(含绿色荧光蛋白)作为阳性对照, 经流式细胞仪测定, 该载体转染效率达到68.3%; 转染后PT67细胞经G418筛选得到稳定的产毒细胞株, 其病毒滴度达 8.16×107 CFU/mL, 为下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。

摘要:为制备重组狐狸生长激素(fGH), 采用RT-PCR方法, 从银狐垂体中扩增fGH cDNA基因, 利用SnaB I和Not I位点将fGH基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽的下游, 构建成fGH基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/fGH, 载体经Sal I酶切线性化后, 通过电转移将线性化的pPIC9K/fGH转化到组氨酸缺陷型酵母宿主菌GS115中。然后利用不含氨基酸的以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体, 再经G418加压筛选出高拷贝fGH基因的重组酵母, 经摇瓶发酵培养和甲醇诱导使fGH进行分泌表达。结果表明本实验扩增的fGH基因序列与GenBank发表的序列基本一致, 发酵液经SDS-PAGE和Western blotting检测证明构建的重组酵母能够分泌表达fGH, 表达的fGH占发酵液总蛋白的34%, 表达量达119 mg/L发酵液。

摘要:本研究采用水相合成的纳米级铁磁流体对灭活酿酒酵母细胞进行磁修饰, 获得了具有良好磁响应的酵母。傅立叶变换红外光谱分析表明, 该修饰酵母在Fe-O特征峰581 cm-1处的吸收明显加强。透射电镜观察表明, 纳米磁性颗粒单个或成团聚集在酵母细胞表面。在本实验条件下, 160 μL磁修饰酵母对1 mL浓度为0.4 mg/mL直接大红染料吸附率达100%; 8 min达到吸附平衡; 在70%乙醇中, 染料脱吸附率为99.18%。由于磁修饰酵母吸附力强, 吸附速度快, 易于磁分离, 是一种有前景的水溶性染料生物吸附剂。

摘要:利用同源克隆技术从六倍体普通小麦中获得了两个不同的双脱氢抗坏血酸还原酶(TaDHAR)基因的cDNA克隆。器官表达模式分析表明, 这两个TaDHAR基因(暂时命名为TaDHAR1和TaDHAR2)在小麦根、茎、叶、幼穗以及开花后10 d、20 d和30 d的种子中均有表达, 为组成型表达基因。原生质体表达实验表明, 两个基因的产物均可能定位在细胞质中。在细菌中表达并提纯了两个基因的重组蛋白。体外生化测定表明两个重组蛋白均具有将双脱氢抗坏血酸还原成抗坏血酸的能力, 其最适pH为7.5, 在37oC时的活性比25oC高, 但25oC条件下pH 6.0和7.0时, 两个DHAR蛋白的活性显著不同。本研究的结果为进一步揭示TaDHAR基因在小麦抗坏血酸代谢中的生理作用奠定了基础。

摘要:一株属于小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)的内生真菌(编号为AL4)制成的粗诱导子可以诱发茅苍术悬浮细胞产生多种防卫反应, 包括一氧化氮(NO)、过氧化氢(H2O2)迸发和挥发油合成加强。NO专一性淬灭剂cPTIO和H2O2 淬灭剂过氧化氢酶(CAT) 则不仅可以分别抑制AL4 粗诱导子引起的茅苍术细胞的NO和H2O2 迸发, 还都能部分阻断AL4粗诱导子促进茅苍术细胞挥发油合成。添加NO供体硝普钠(SNP) 和H2O2 都可引起茅苍术细胞中挥发油积累增加, 但二者效果不同。因此暗示着NO 和H2O2 都是介导内生真菌AL4粗诱导子促进茅苍术悬浮细胞挥发油合成的信号分子。同时添加NO 的淬灭剂cPTIO 和H2O2 的淬灭剂CAT 并不能完全抑制AL4粗诱导子引起的茅苍术细胞挥发油积累增加, 这表明内生真菌AL4粗诱导子还可以通过其他方式促进茅苍术悬浮细胞挥发油合成。

摘要:本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。

摘要:本研究系统分析了酸性、碱性和中性酶在二级结构氨基酸组成上的差异。结果发现在形成特定二级结构过程中, 酸性酶和碱性酶有着不同的氨基酸使用偏向; 同时, 在酸性和碱性酶中, 中性氨基酸和侧链微小的氨基酸含量明显较高, 这可能是它们适应极端pH的普遍机制。基于此, 提出了一种提取蛋白质序列特征值的新方法, 其10倍交叉验证的精度可达80.3%。与其他常见特征值提取方法相比, 其精度提高了9.4%到18.7%不等; 而随机森林算法比其他机器学习算法识别精度也高出2.7%到21.8%不等。

摘要:为了实现人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)16亚型衣壳蛋白L1在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中的高效表达, 根据L1蛋白的氨基酸序列及多形汉逊酵母的密码子偏爱性, 对L1蛋白的编码序列进行优化设计, 合成了完整的编码序列, 命名为HPV16L1。以甲醇诱导型启动子MOXp和终止子AOXTT为表达调控元件, 以尿嘧啶合成相关基因URA3为筛选标记, 构建了HPV16L1的重组表达质粒pYMOXU-HPV16。用Sac II酶切质粒pYMOXU-HPV16使其线性化, 电转化多形汉逊酵母菌株H-ura3, 依据营养缺陷互补筛选重组菌株。通过PCR扩增及HPV16 L1蛋白表达量分析表明已获得稳定高表达L1蛋白的重组汉逊酵母菌株HP-U-16L。摇瓶发酵条件的初步优化表明, 以YPM (pH 7.0)为基础培养基进行诱导培养, 控制接种量使初始培养液OD600为1.0, 每隔12 h补加甲醇至终浓度为1% (V/V), 37oC、200 r/min条件下诱导培养72 h后, HPV16 L1蛋白的最高表达量为78.6 mg/L。本研究为多形汉逊酵母源HPV16 L1疫苗的研制奠定了基础。

摘要:磷脂酶D(PLD)催化卵磷脂(Phosphatidylcholine, PC)水解产生胆碱(Choline)和磷脂酸(Phosphatidic acid, PA), 其代谢产物参与调控细胞内许多生理和生化过程。在过表达磷脂酶D3 (PLD3)的成肌细胞(C2C12细胞)中, 研究了PLD3对胰岛素刺激后Akt通路激活的影响。研究结果表明, PLD3过表达细胞的Akt磷酸化水平比对照组低, 并且不受胰岛素浓度变化的调控。虽然PLD3过表达细胞中Akt磷酸化水平随胰岛素刺激时间的延长而有所增加, 但磷酸化总水平比对照组低。磷脂酶D抑制剂丁-1醇能够抑制对照组胰岛素刺激下Akt磷酸化, 却不能抑制PLD3过表达细胞的Akt磷酸化, 并且PLD3过表达细胞Akt磷酸化水平比对照组高6倍。用磷脂酸(PA)做刺激时, 对照组的Akt磷酸化明显增加, 而PLD3过表达细胞株的Akt磷酸化没有显著变化; 用PA和胰岛素同时刺激时, PLD3过表达株和对照组的Akt磷酸化均比PA单独刺激时降低。这说明PLD3的过表达抑制成肌细胞内胰岛素信号的传导。

摘要:为了表达日本脑炎病毒囊膜蛋白(E蛋白)结构域DⅢ区, 了解其作为亚单位疫苗的可能性, 本研究根据SA14-14-2病毒株序列(GenBank Accession No. D90195)设计两条引物, 以全长JEV感染性克隆pBR-JTF为模板, 通过PCR扩增出JEV E蛋白DⅢ的cDNA片段, 构建了原核表达载体pET-JE DⅢ, 转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行融合表达。融合蛋白为可溶性表达, 表达量约占菌体蛋白的75%。用纯化后蛋白免疫新西兰兔和BALB/C鼠, 通过ELISA, Western blotting, 噬斑减少实验, 及乳鼠攻毒实验验证JE DⅢ的抗原性和免疫原性。Western blotting及ELISA结果表明纯化后的表达产物具有良好的抗原性, 纯化的JE DⅢ蛋白免疫新西兰兔, 可以获得高达1: 7×105滴度的抗JEV特异性抗体; JE DⅢ蛋白免疫BALB/C鼠, 可以获得1: 8.2×104滴度的抗JEV特异性抗体。并且获得1: 256滴度的中和抗体, 乳鼠攻毒实验能达到75%的保护效果。以上结果说明本研究表达、纯化的重组JE DⅢ蛋白, 免疫小鼠以及兔后, 能产生抗JEV的特异性抗体, 中和性抗体, 能够保护部分乳鼠接受毒种的攻击, 抗原性及免疫原性较好, 有进一步开发研制成亚单位疫苗的潜能。

摘要:本研究旨在分析腺病毒携带的IL-24基因在体内外对人骨肉瘤细胞生长抑制效应及其分子机制。将Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞, 用荧光显微镜、RT-PCR法检测IL-24在MG-63细胞中的转录和表达; MTT法、流式细胞技术和Hoechst染色法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应; 半定量RT-PCR法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞中的bcl-2、bax、caspase-3相关基因表达的影响。用Ad-IL-24重组腺病毒在MG-63骨肉瘤荷瘤裸鼠的瘤体内进行注射治疗, 观察肿瘤生长变化, 15 d后处死裸鼠, 摘除瘤体, 称瘤重。并通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等与细胞凋亡相关因子的表达。结果表明Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞后, 能明显抑制MG-63细胞增殖, 并能通过上调细胞中bax、caspase-3和下调bcl-2基因表达, 诱导细胞凋亡, 呈现出典型细胞凋亡形态学变化。Ad-IL-24重组腺病毒瘤内注射MG-63裸鼠荷瘤骨肉瘤移植瘤后, 能显著抑制肿瘤生长, 瘤重的抑制率可达52%, 免疫组化结果显示Ad-IL-24重组腺病毒能明显上调与细胞凋亡相关因子Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2和CD34的表达。本研究结果显示腺病毒介导的IL-24基因在体内外均可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长, 诱导其凋亡, 其机制可能与下调bcl-2, 上调bax、caspase-3的基因表达水平有关, 由此为骨肉瘤的基因治疗提供实验依据。

摘要:本研究构建了心肌特异性a-肌球蛋白重链(a-MHC)启动子表达载体, 并对其功能进行了鉴定。以小鼠基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到a-MHC启动子, 插入pGEM?-T Easy载体, 酶切后回收目的片段, 置换pcDNA3.1(+)- EGFP-hygro中的CMV启动子, 成功构建出a-MHC-EGFP表达载体。对其进行酶切鉴定后, 通过电穿孔法转染原代小鼠心肌细胞, 转染阳性的心肌细胞出现绿色荧光, 而非心肌细胞无荧光出现。a-MHC-EGFP表达载体具有心肌特异性表达特性, 可用于纯化胚胎干细胞来源的心肌细胞。

摘要:为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达, 本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因, 对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后, 细胞培养上清和细胞裂解液中分别检测到Gluc的活性, 而上清比细胞中的含量高约100倍。表明表达的Gluc以分泌形式为主。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neo-Gluc质粒, 活体成像表明Gluc在小鼠体内呈全身分布, 而注射了萤火虫荧光素酶质粒pAAV2neo-Fluc的对照小鼠则主要在肝脏显像。将剂量分别为0.1、1、10、50 μg每只的pAAV2neo-Gluc DNA用水动力法尾静脉注射小鼠, 不同时间点连续尾静脉采血测定其中的Gluc酶活性, 观察其Gluc体内表达和分泌的动态变化。结果显示, 各剂量组的Gluc表达变化规律高度一致: 注射后2 h即可检测到Gluc表达, 10 h后达到高峰, 之后逐渐下降; Gluc的表达水平与注射质粒DNA的量呈正相关; 为了进一步观察Gluc检测的灵敏性, 本研究又比较了注射更低的质粒剂量(包括0.001、0.01和0.1 μg/每只)时Gluc体内表达情况。结果发现注射剂量低至0.001 mg每只小鼠都能在血中检测到Gluc表达, 这一结果提示了Gluc检测的高度灵敏性。本研究首次报道了以Gluc为报告基因体外实时动态监测水动力注射基因的表达规律, 为动态分析水动力注射基因的体内表达调控及功能研究提供了新的有效手段。

摘要:为了提高昆虫杆状病毒在哺乳动物细胞中转导基因的效率, 构建了重组杆状病毒AcRed-tat和AcRed。两者都能在哺乳动物细胞内表达红色荧光蛋白作为报告基因。同时, AcRed-tat带有HIV-1 Tat转导肽、病毒主要衣壳蛋白基因vp39及增强型绿色荧光蛋白(egfp)三者的融合基因, 并由杆状病毒多角体启动子表达, 能够在昆虫细胞中表达该Tat融合蛋白, 并掺入子代病毒粒子。而AcRed作为相应的对照病毒, 带有多角体启动子表达vp39和egfp的融合基因。2株病毒分别转导哺乳动物细胞后, 利用流式细胞仪检测报告基因的表达水平, 发现在CHO和Vero细胞中AcRed-Tat介导的报告基因表达水平明显高于AcRed, 而在HEK293细胞中2株病毒介导的报告基因表达水平差异不显著。结果表明Tat转导肽可以提高杆状病毒对一部分哺乳动物细胞的转导效率, 为改进杆状病毒-哺乳动物细胞转导载体提供了新的思路。

摘要:乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein, SBP)是本实验室发现的一种人源蛋白, 该蛋白与人乙型肝炎病毒HBV表面抗原HBsAg存在特异性的结合能力。此前的研究证实SBP具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用。为进一步研究该蛋白的生理功能和作用机制, 利用毕赤酵母表达系统进行了SBP的表达菌株构建, 筛选得到了SBP的高效表达菌株。发酵产物经过分离纯化, 最终得到了大量高纯度的真核来源的目的蛋白。通过SDS-PAGE、高效液相色谱、Western blotting和质谱鉴定, 证实所得到的蛋白具有较高的纯度和完整性。通过ELISA方法初步证实了其与乙肝表面抗原具有较好的结合能力。该研究为进一步进行SBP的体内外功能研究及免疫增效研究打下了基础。

摘要:采用金属螯合亲和层析法, 纯化了小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原单克隆抗体, 对上样缓冲液的pH和离子强度、洗脱液种类和洗脱方式进行优化。结果表明, 采用降低pH分步洗脱时, 最佳上样缓冲液为pH 8.0, 20 mmol/L PB + 0.5 mol/L NaCl, 抗体在pH 5.0被洗脱下来, 抗体回收率80%, 纯度85%。采用咪唑浓度梯度洗脱时, 最佳的上样缓冲液为pH 8.0, 20 mmol/L PB + 5 mmol/L咪唑, 抗体纯度大于95%, 回收率65%; 在上样缓冲液中不添加NaCl而添加少量的咪唑, 更有利于抗体分离。以上洗脱方式都能较好地保持mAb的生物学活性, 为该抗体的应用提供了必要的实验基础。

摘要:本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因, 经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞, 包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒; 用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白, 间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体; RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录; 荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞, 可见报告基因eGFP的表达; 间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别, 表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒, 转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白, 为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。

摘要:旨在研究携带人IL-24基因的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制作用并分析其分子机制。以不同MOI(感染复数)的Ad空载体腺病毒感染SGC-7901人胃癌细胞, 筛选出最佳感染剂量; Ad-IL-24以最佳感染剂量感染SGC-7901胃癌细胞, RT-PCR法和Western blotting法检测腺病毒介导的IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中的转录; MTT法检测Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用, 流式细胞仪检测其诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡和细胞周期改变的效应, Hoechst33258染色荧光显微镜检测其诱导胃癌细胞凋亡的核形态改变; RT-PCR半定量法进一步检测SGC-7901胃癌细胞中凋亡相关基因的转录。结果显示, 100 MOI 为感染SGC-7901胃癌细胞的腺病毒最佳感染剂量; Ad-IL-24能成功介导IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中转录性表达; Ad-IL-24感染SGC-7901胃癌细胞后, 能明显抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡; Ad-IL-24能显著上调SGC-7901胃癌细胞中bax、caspase-3和p53的表达和下调bcl-2的表达。因此, 腺病毒介导的IL-24表达具有明显抑制SGC-7901人胃癌细胞生长和诱导凋亡的抗肿瘤效应, 其机制可能与上调bax/bcl-2、caspase-3和p53密切相关。