摘要:水孔蛋白属于一个高度保守的、能够进行跨生物膜水分运输的通道蛋白MIP家族。水孔蛋白作为膜水通道, 在控制细胞和组织的水含量中扮演重要角色。本研究的重点是属于PIP亚家族的GhPIP1;2和属于TIP亚家族的gTIP1在植物细胞延长中的作用。使用特异基因探针的Northern杂交和实时荧光PCR技术证明GhPIP1;2和GhgTIP1主要在棉花纤维延长过程中显著表达, 且最高表达量在开花后5 d。在细胞延长过程中, GhPIP1;2和GhgTIP1表达显著, 表明它们在促使水流迅速进入液泡这一过程中扮演重要角色。而且也研究了盐胁迫植物中钙离子对水孔蛋白的影响。分别或一起用NaCl或CaCl2处理原生质体或细胞质膜。结果发现在盐胁迫条件下, 水渗透率值在原生质体和质膜颗粒中都下降了, 同时PIP1水孔蛋白的含量也下降了, 表明NaCl对水孔蛋白的功能和含量有抑制作用。同时也观察了Ca2+的两种不同的作用。感知胁迫的胞质中游离钙离子浓度的增加可能导致水孔蛋白的关闭。而过剩的钙离子将导致水孔蛋白的上游调控。同时实验已经证明大麦的一类水孔蛋白-HvPIP2;1有更高的水和CO2转移率。本研究的目标是确定负责转运水和CO2的关键水孔蛋白的类型, 并且提高植物对水的利用率、抵抗胁迫的能力, 促进CO2的摄取及吸收、提高植物的产量。

摘要:连接酶可以催化寡核苷酸模板上2条单链在缺口处形成磷酸二酯键。这种在缺口处需要单核苷酸互补的化学反应特性催生了连接酶介导的生物分子检测技术。在过去20年中，该技术已成功应用于对已知或未知点突变、小片段核酸插入或缺失、DNA甲基化、大规模单核苷酸多态性（SNP）分型，蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用的检测以及分析。同时，连接反应通过整合进入其它生物技术，在生物分子检测中取得了更大的进展。这些新的方法经过多重杂交和酶学反应后，仍能保持很高的检测准确性，并为整个检测反应提供了内在的质量控制校核。以下综述了基于连接酶的生物分子检测技术。

摘要:克隆获得的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Act-1基因的核心启动子, 经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ限制性内切酶消化后, 与用相同酶消化的pEGFP-4.1载体连接(由pEGFP-N1去掉CMV启动子形成), 构建重组表达载体Pact-EGFP。通过脂质体介导转染Vero细胞, 结果发现EGFP在Vero细胞中有表达, 但表达量很低。通过显微注射将Pact-EGFP与pRF4共注射到C. elegans性腺, 结果发现EGFP能够在C. elegans的皮层、副皮层以及咽部表达, 根据表达部位不同, 获得了2种转基因线虫株。研究结果显示: EGFP在C. elegans体内的表达水平明显高于在Vero细胞内的表达, 表明C. elegans Act-1基因的核心启动子区域可能存在与转录水平密切相关的独特的转录调节元件。该研究为进一步实现寄生性线虫基因在C. elegans表达提供了参考。

摘要:猪霍乱沙门氏菌C500株不仅可以作为预防猪沙门氏菌病的活疫苗, 还可作为运送其他DNA疫苗的优良载体,并通过粘膜免疫诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。为增强其携带的DNA疫苗的免疫效力, 本研究以真核表达载体pEGFP-C1为基础, 将其真核启动子CMVIE与原核启动子Ptrc串联, 并在其多克隆位点MCS下游引入rrnbT1T2转录终止序列, 构建了真、原核双启动子表达载体pEGFPPtrcR。用1×TSS法将其转化C500, 得到工程菌C500/pEGFPPtrcR, 通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定了报告基因EGFP的原核表达, 该菌在荧光显微镜下能发出强烈绿色荧光, 被证明在体外至少能稳定遗传20代; 采用脂质体介导法将pEGFPPtrcR转染Vero细胞, EGFP在胞核和胞浆内表达, 24 h后观察可到明显绿色荧光。结果表明, 双启动子表达载体pEGFPPtrcR构建成功, 预示其携带的外源基因既可在C500中表达, 又可在体细胞中表达, 为研制以C500为载体的新型DNA疫苗的发展开辟了一个新的途径。

摘要:通过分段表达PrP核心片段和人工合成多肽, 分析5株羊朊毒体单抗结合表位。分段表达PrP核心片段, 通过PCR方法扩增目的片段, 经酶切、连接后, 将目的片段插入质粒pET32a, 在大肠杆菌BL21中表达。将表达的系列融合蛋白与单抗进行免疫转印试验, 根据反应情况确定单抗结合的大致部位, 在此基础上设计合成多条针对性多肽, 用ELISA方法进一步确定3株单抗的结合部位; 通过与6段融合蛋白反应证明5株单抗的结合部位分别为: 2H3在199 aa~ 213 aa之间, 4C6、5F11和7F11在139 aa~168 aa之间, 7F1在214 aa~227 aa之间, 与3段人工合成多肽进行ELISA反应进一步得到4C6、5F11和7F11抗原结合表位在149 aa~158 aa之间; 本研究确定了5株单抗在PrP分子上的结合部位,为羊痒病和牛海绵状脑病的检测、发病机制的研究奠定了基础。

摘要:本试验用高、低浓度虾红素日粮饲喂昆白系小鼠和处理原代培养小鼠骨骼肌细胞, 提取总RNA, 检测各时段UCP3、LXRa基因mRNA表达量, 探讨虾红素对小鼠个体发育、肌肉能量代谢相关基因表达变化规律的影响。结果表明: 高浓度组与对照组相比, 小鼠体重增长明显减慢, 肌肉组织第10天、30天以及骨骼肌细胞作用24 h时UCP3 mRNA表达量均显著下降(P<0.05), LXRa基因mRNA表达量均显著上升(P<0.05), 72 h达到极显著水平(P<0.01)。低浓度组与对照组相比, 肌肉组织中UCP3、LXRa基因mRNA表达差异均不显著(P>0.05); 虾红素作用骨骼肌细胞24 h UCP3基因mRNA表达量显著下降(P<0.05), LXRa基因mRNA表达量显著上升(P<0.05)。结果提示虾红素对小鼠肌肉的能量利用有一定的调控作用。

摘要:为了改良多杀菌素生产菌种, 提高多杀菌素产量, 研究了甘氨酸添加浓度、溶菌酶作用时间、温度和浓度对多杀菌素生产菌刺糖多胞菌Saccharopolyspora spinosa SP06081菌株原生质体制备和再生的影响, 并考察了不同再生培养基和渗透压稳定剂对其再生的影响, 确定了该菌株原生质体制备和再生的最佳条件。同时, 对原生质体再生菌株的形态与多杀菌素产量变化进行了比较研究。结果表明: 菌体在添加0.2%的甘氨酸的TSB培养基中培养48 h收集, 0.1 mg/mL 溶菌酶, 28oC作用20 min制备原生质体, 将原生质体涂布于以蔗糖为渗透压稳定剂的R2YE培养基中, 原生质体再生数目最多, 达108个/mL以上; 原生质体再生菌株在形态和抗生素产量上产生分化, 29.3%的再生菌株形态上保持与亲本菌株一致, 具有菌丝松散, 断裂分枝多的特点, 其中53.2%的再生菌株多杀菌素产量变异向正方向移动, 最高产量达到582.0 mg/L, 比亲本菌株提高85.6%。原生质体再生菌株的形态分化与多杀菌素产量具有重要相关性。

摘要:以产紫杉醇类化合物的云南红豆杉内生真菌12.3.2为目标菌株, 对其次生代谢物进行分离鉴定和抗菌活性研究。通过硅胶柱层析, 共分离得到3个主要成分, 红外光谱、质谱、核磁共振氢谱等光谱解析鉴定其分别为松柏烯、邻苯二甲酸二异辛酯、油酸乙酯。生物活性试验表明3种化合物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色链球菌这5种致病菌都有一定的抑制作用。其中松柏烯对金黄色葡球菌、枯草杆菌和白色念珠菌有较强的抑制作用。松柏烯是首次报道从植物内生真菌次生代谢物中分离得到, 这为松柏烯的来源开辟了一条重要的途径, 同时也为松柏烯的进一步开发利用奠定了基础。

摘要:地衣芽孢杆菌高温a-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一。为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温a-淀粉酶生产菌株的生产性能, 本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温a-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL。将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株Bacillus licheniformis B0204, 再在卡那霉素存在下介导其B. licheniformis B0204染色体中的同源整合与高温a-淀粉酶编码基因amyL的扩增, 由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子。对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定。与出发菌株B0204相比, 含2~5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高。其中, 重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%。

摘要:黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶, 在食品、制药等领域具有广泛的用途。获得黑曲霉脂肪酶高效表达的基因工程菌是该脂肪酶规模化应用的前提。通过全基因合成对目的基因进行分子改造和人工组建是实现基因高效表达和体外分子进化的有效手段。本研究主要针对一步法长片段基因合成中复杂结构的非特异性配对和过多的PCR引入碱基错配等问题, 采用二步法(组装PCR和酶切-酶连)合成了黑曲霉脂肪酶基因lipA。首先在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对lipA基因密码子及RNA二级结构进行优化并引入Cla I(237位)和Pst I(475位)酶切位点; 通过组装PCR分别合成lipA基因的各片段F1(237 bp)、F2(238 bp)和F3(422 bp); 通过该基因内的Cla I和Pst I限制性酶切位点连接成完整的全长lipA基因。本方法有效地降低了长片段合成过程中寡核苷酸片段的非特异性配对、复杂的二级结构以及碱基突变对DNA合成的影响, 提高了长片段合成的成功率。经密码子优化后的脂肪酶基因(lipA-syn)在毕赤酵母GS115中经诱导表达 72 h后, 发酵液酶活达176.0 U/mL, 蛋白质含量为143.7 mg/L, 较出发基因分别提高了10.8倍和5.6倍。实现了该基因的高效表达, 并为产酶参数的优化和酶的规模化制备奠定了基础。

摘要:保持酶的天然状态和高催化特性具有重要的意义。本研究筛选了辣根过氧化物酶(HRP)的稳定剂并研究了其作用机制。结果发现硫酸镁和明胶能够显著提高HRP的热稳定性, 并且两者具有协同作用。在硫酸镁和明胶组成的酶稳定剂存在的条件下, HRP在50oC保温80 h后仍能保持89%的活性, 常温下存放90 d后可保持57%的活性, 而未加稳定剂的对照样品中HRP的残留活性分别为6%和小于1%。通过对HRP的Soret带吸收光谱, 色氨酸内源荧光, ANS荧光进行分析, 揭示酶稳定剂可以明显降低在加热条件下HRP的变性程度, 从而维持较为稳定的天然构象。

摘要:分别构建杜氏盐藻诱导型和组成型异养表达载体, 筛选并初步鉴定异养转化藻株。通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆并鉴定人红细胞葡萄糖转运基因(Glut1), 构建以诱导型双拷贝碳酸酐酶启动子(DCA)驱动Glut1表达的中间载体, 然后与筛选标记Bar盒连接形成盐藻诱导型异养表达载体pMDDGN-Bar。此外, 将pUWGUS(简称G5)质粒的GUS基因去除, 回收大片段载体后与Glut1基因连接, 构建以组成型启动子ubiquitin驱动的组成型异养表达载体G5Glut1-Bar。通过电击转化法转化盐藻, 使Glut1得到表达, 筛选具有草丁膦(PPT)抗性的表达Glut1的盐藻转化株。提取转化株总RNA, RT-PCR检测目的基因的整合。克隆获得了1479 bp的Glut1序列, 编码493个氨基酸。电泳检测各酶切结果表明Glut1、DCA、Nos和Bar盒已依次连接到相应的载体上, 说明异养表达载体构建成功。经PPT筛选数周后, 转化藻株生长良好, 而对照野生藻株全部死亡。电泳检测RT-PCR产物表明两株转化株在相应位置(约250 bp处)出现了较为特异的扩增条带, Blast同源性分析显示序列与人Glut1基因的同源性为100%。诱导型和组成型启动子驱动的盐藻异养表达载体构建成功, Glut1基因确已整合到盐藻的基因组中, 构建的表达载体可用于盐藻中Glut1基因的表达。

摘要:通过构建红色亚栖热菌(Meiothermus ruber CBS-01)的基因组DNA文库, 克隆得到该嗜热菌海藻糖合成途径中的磷酸海藻糖合成酶(TPS)和磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)基因。以pET21a为表达载体, 将磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酯酶在大肠杆菌中进行表达并纯化, 利用薄层层析的方法验证了这两个酶的活性。同时, 本研究检测了红色亚栖热菌在各种环境压力下细胞内含物成分的变化情况, 发现在高渗环境压力的诱导下, 该菌会在胞内积累大量的6-磷酸海藻糖, 而并非海藻糖, 这为进一步研究TPS/TPP和TreS途径在细胞体内的作用奠定了基础。

摘要:研究了中试厌氧氨氧化(Anaerobic ammonium oxidation, Anammox)反应器的启动性能。结果表明, 以硝化反硝化污泥、短程硝化污泥、厌氧絮体污泥和厌氧颗粒污泥混合接种, 经过255 d的运行, 可在常温下（5 oC~27 oC）成功启动中试Anammox反应器, 反应器的基质氮去除速率可达1.30 kg/(m3·d)。厌氧氨氧化是致碱反应, 厌氧氨氧化成为反应器内的主导反应后, 进水pH宜控制在厌氧氨氧化适宜范围的偏低水平(6.8左右)。亚硝酸盐既是Anammox菌的基质, 也是抑制剂, 控制进水亚硝酸盐浓度（13~36 mg/L）有助于厌氧氨氧化反应。菌种是生物反应器的功能之源, 向中试装置投加少量厌氧氨氧化污泥(投加比2%), 可大大加速中试Anammox反应器的启动进程。

摘要:建立了在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达PeaT1蛋白的技术。将来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的基因peaT1亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K, 构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1, 分别用Sal I或Bgl II酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中, 经MD平板筛选、PCR鉴定获得整合有外源基因的重组菌株。在a-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下, PeaT1在酵母中大量表达并分泌到胞外, SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为35 kD。表达蛋白上清稀释液能诱导烟草产生对TMV的抗性, 其枯斑数抑制率可达到30.37%。每升表达上清液经超滤浓缩和离子交换层析可纯化目的蛋白16.13 mg, 该纯化蛋白能显著地促进小麦幼苗的生长。

摘要:高粱是全球仅次于小麦、水稻、玉米、大豆和马铃薯等的重要作物之一。以高粱幼穗愈伤组织为转化受体, 通过农杆菌介导法和含有抗潮霉素和gus基因的双元载体将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱品种115、ICS21B和5-27, 经Hyg筛选共获得21个独立的转基因株系, 52株转基因植株, 平均转化率为1.9%。经PCR、Southern杂交和RT-PCR分析表明cry1Ab基因已整合入高粱基因组中并得到正确转录。Bt蛋白Western blotting分析和ELISA定量测定显示, cry1Ab基因在转基因高粱植株中表达, 但不同转基因植株表达量有差异。饲虫试验表明, 转基因高粱对大螟(Sesamia inferens)具有一定抗性。

摘要:本研究以抗稻瘟病的粳稻PiA开花后12~15 d的幼胚为材料, 将诱导10~15 d的愈伤不经固体培养基继代, 直接转到AA液体培养基上, 在较短时间内成功建立起了优良的水稻悬浮细胞系; 并测定了该悬浮细胞系不同时期的生长特性和分化情况, 结果表明悬浮培养适宜的继代天数是7~10 d; 培养30~120 d的细胞分化能力和植株再生能力较好, 细胞分化率和成苗率分别为57.1%和20%, 为进一步利用悬浮细胞进行遗传转化和原生质体分离奠定了基础。

摘要:根据GenBank中公布的人多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶10(PARP10)cDNA序列, 设计并合成一对特异性引物,通过RT-PCR扩增293FT细胞mRNA, 获得PARP10 cDNA。将获得的cDNA克隆到pCMV-Myc和pEGFP-C1中, 用免疫沉淀和激光共聚焦实验验证了PARP10和b-actin存在相互作用。然后, 通过RT-PCR法发现该基因在小鼠体内表达的组织分布, 组织表达谱显示该蛋白在各组织中均有表达; Western blotting分析表明, UV造成的细胞损伤能够引起PARP10表达水平的增高。PARP10组织表达谱的确定, 与b-actin相互作用的验证以及对UV的应激反应都为进一步研究PARP10的生物学功能奠定了基础。

摘要:人工构建的五螺旋蛋白(5-helix)能抑制人类免疫缺陷综合症病毒(HIV)介导的膜融合过程中发卡三聚体的形成, 从而抑制病毒感染靶细胞。但5-helix基因在原核细胞中直接表达时易形成包涵体, 复性困难, 给研究带来不便。本研究探讨了将蛋白结构模拟用于寻找合适的表达载体的方式: 通过同源建模, 模拟了5-helix在pGEX-6P-1载体及pET44b载体上的融合蛋白形成的最有可能的2种构象。通过对比发现其在pET44b载体中与NusA的融合蛋白的溶剂化能远大于其在pGEX-6P-1中与GST融合蛋白的溶剂化能, 且酶切位点位于蛋白表面。应用PCR将5-helix基因从pGEX-6P-1-5H克隆出来, 鉴定正确后连接到pET44b载体上, 构建成重组载体pET44b-PSP-5Helix。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3), 于不同温度诱导表达。用镍柱及GST柱纯化蛋白, SDS-PAGE证实成功得到了目的蛋白。用纯化蛋白验证抑制HIV假病毒感染GHOST-CXCR4的活性。结果显示: 与NusA融合的5-helix蛋白能够实现高效的可溶表达, 且酶切容易; 纯化蛋白抑制HIV假病毒感染GHOST-CXCR4的半数抑制浓度为(22.77±5.64) nmol/L, 为进一步探讨其在HIV-1病毒感染中的应用奠定了基础。

摘要:真菌免疫调节蛋白家族(Fungi immunoregulatory proteins, FIPs)各成员所具有的免疫调节和抗肿瘤活性已被广泛研究。本研究利用毕赤酵母表达系统对其成员Lz-8进行了重组表达。以毕赤酵母突变株GS115为表达宿主细胞, PCR和DNA测序结果均显示Lz-8的cDNA已被成功地整合入酵母基因组。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和免疫学实验均被用于重组表达蛋白的检测。实验结果表明Lz-8在毕赤酵母表达系统中得到成功表达, 在SDS-PAGE中可观察到分子量为14 000 D的单一条带, MALDI-TOF-MS的实验结果显示rLz-8的分子量为12 722 D。在相关的免疫学实验中, rLz-8可引起绵羊血红细胞凝集, 但对人血4种血型的红细胞并没有凝集作用, rlz-8还可诱导巨噬细胞吞噬作用, 均与其他报道中的实验结果吻合。以上结果表明, 本实验已成功地利用毕赤酵母表达系统对Lz-8进行重组表达。

摘要:探讨牛黄对原代小鼠口腔成纤维细胞功能的影响, 揭示其在溃疡愈合过程中的作用及机制。本试验采用MTT法、氯胺-T法、明胶酶谱分析和酶联免疫反应测定了牛黄对小鼠口腔成纤维细胞增殖、胶原沉积、金属蛋白酶-2、-9活性和基质金属蛋白酶抑制因子-1合成的影响。结果表明牛黄能显著抑制小鼠口腔成纤维细胞的增殖、胶原沉积和金属蛋白酶-2活性, 同时也极显著(P < 0.01)抑制基质金属蛋白酶抑制因子-1的产生。结果提示牛黄在溃疡愈合过程中不具生肌作用, 可能通过抗炎促进溃疡愈合; 其抑制胶原合成的机制可能与极显著抑制基质金属蛋白酶抑制因子-1有关。

摘要:为建立基于绿色荧光蛋白(GFP)的药物筛选模型, 并用此模型从包括中药提取物在内的化合物中筛选新型蛋白酶体抑制剂, 本研究构建了pGC-E1-ZU1-GFP融合蛋白慢病毒表达载体并感染A549细胞, 筛选稳定表达细胞株, 用已知蛋白酶体抑制剂PS-341处理细胞, 荧光显微镜检测处理前后细胞GFP水平变化。结果获得了稳定表达pGC-E1-ZU1-GFP的A549细胞, 这些细胞用PS-341处理24 h后用荧光显微镜检测, 发现细胞绿色荧光强度相对于对照组明显增强。利用这一模型对一些化合物进行筛查, 发现了一些新的蛋白酶体抑制剂。

摘要:为发现代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)的调节剂, 通过荧光检测胞内钙浓度的方法, 建立一个基于细胞功能性检测的高通量筛选(HTS)系统。将人mGluR4基因转染稳定表达Ga15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293), 用Zeocin筛选获得稳定表达mGluR4的细胞株, 并通过钙流检测试验证实该细胞系的生物学功能。优化了实验系统中荧光染料的孵育时间, 溶剂二甲基亚砜(DMSO)耐受性, 以及溶剂氢氧化钠(NaOH)耐受性, 建立了可靠稳定的筛选系统。钙流检测试验数据表明, mGluR4细胞系对其激动剂的活性程度排序是: L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyric acid (L-AP4)> L-Serine-O-phosphate (L-SOP)>L-Glutamic acid (L-Glu); 拮抗剂是: (RS)-a-Methylserine-O-phosphate (MSOP)> (RS)-a-Methyl-4-phosphonophenylglycine (MPPG)。在96和384细胞微孔培养板中, 得到该筛选系统Z’因子分别是0.80和0.65。结果表明, 该稳定细胞系拥有一个稳定的检测系统, 适合于mGluR4激动剂/拮抗剂的筛选。

摘要:利用DNAStar 分析了GenBank中所有8株羊痘病毒全基因序列, 选取位于山羊痘病毒(AY077835)基因组gp064区域约64 bp的基因片段, 设计并合成了一对PCR引物和一条TaqMan-MGB探针, 建立了FQ-PCR和标准曲线,并利用该方法对山羊痘临床皮肤痘疹材料和人工感染动物材料进行GPV核酸检测。结果表明, 构建的FQ-PCR具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。该方法的建立为山羊痘临床快速高效地诊断和山羊痘病毒感染羊只的发生、发展及转归研究提供了一种有效的手段。