摘要:有机溶剂有严重破坏微生物正常生理功能的毒害作用, 但是研究工作者发现有些细菌能够在较高有机溶剂浓度下依赖独特的耐受机制得以生存, 这种机制的发现大大鼓舞了工业菌尤其是溶剂生产菌和毒性有机物降解菌的工业适应性改造研究。以下概述了有机溶剂对细胞毒性作用机制, 并在根据参数logP衡量不同溶剂对细胞的毒性程度的基础上, 重点总结了溶剂耐受菌耐受有机溶剂的机制, 即膜上顺反异构、增加饱和脂肪酸的比率、改变极性头部、外膜的生理变化、细胞的形态变化、胞内溶剂的降解和泵出等, 结合本课题组在筛选溶剂耐受菌株和提高现有菌株溶剂耐受性研究方面的经验, 希望对重要工业微生物溶剂耐受相关的生理功能进行更深入地研究, 提高微生物的工业适应性。

摘要:利用植物生物反应器生产外源蛋白是一个有吸引力的廉价生产系统, 以下介绍了植物生物反应器的不同表达系统, 及其各个系统的发展进程和研究现状等。重点论述了应用植物各大表达系统生产疫苗、抗体和医用蛋白等方面的情况以及本实验室在这一领域的研究情况。随着该领域研究的进展, 植物生物反应器用于生产低成本药用蛋白的产业化将显示出越来越良好的发展前景。

摘要:重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV)可以作为基因运载工具将目的基因运送入靶器官并对多种疾病发挥治疗作用。以rAAV为载体进行基因治疗的关键是病毒基因组由单链变为双链, 否则不能适时、有效表达目的基因。自身互补型rAAV(scrAAV)载体基因组本身以双链形式存在, 与常规的单链rAAV(ssrAAV)载体相比, 无论在表达时间还是表达强度上都有十分明显改善, 可显著降低在疾病治疗过程中由于载体本身所诱发的免疫反应。目前, scrAAV已经在肝脏疾病、中枢神经系统疾病、眼部疾病、干细胞修饰以及RNA干扰、核酶技术等领域得到应用。以下在介绍scrAAV载体构建、表达、定位的基础上, 以血友病B为主要对象, 阐述scrAAV的应用潜力及发展趋势。

摘要:壳聚糖是一种具有良好生物相容性、独特pH值响应性、易改性和易成膜特性的高分子材料。在生物组装技术中, 壳聚糖可作为多功能活性介体, 与生物组分和微加工装置连接, 制成高选择性、高灵敏度的生物微机电系统(BioMEMS)。以下介绍了基于壳聚糖的3种生物组装技术——定向组装、酶促组装、自组装的制备原理和过程, 评述了基于壳聚糖的BioMEMS在生物、医学、环境领域中的应用现状, 并展望了今后的研究方向。

摘要:从H3N2亚型猪流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA, 采用RT-PCR方法克隆M1全长基因, 将M1基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体中, 构建重组表达质粒pET-28a-M1, 将该重组质粒转化大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达。诱导产物经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白M1获得大量表达, 表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明制备的抗M1蛋白多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的M1蛋白和病毒感染细胞的病毒M1蛋白。构建M1基因真核重组质粒p3xFLAG-CMV-7.1-M1并转染Vero细胞, Western blotting检测表明抗M1蛋白多克隆抗体可以识别在Vero细胞中得到表达的M1蛋白, 成功建立M1基因的真核表达系统。分析了病毒感染过程中M1蛋白的变化及其作为病毒复制指示分子的可能性。鼠源M1蛋白多克隆抗体的制备和M1基因真核重组表达质粒的构建, 为进一步研究猪流感病毒的复制机理以及M1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。

摘要:本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价, 结果显示, rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体, 但攻毒后个别猪表现短期体温升高和轻微病变; 而pSFV1CS-E2免疫组猪只虽然在攻毒后得到了保护, 但产生的抗体水平较低。为了增强猪瘟甲病毒复制子载体疫苗和猪瘟重组腺病毒活载体疫苗的免疫效果, 本研究应用了复制子载体DNA疫苗初免和重组腺病毒疫苗加强免疫的初免-加强(Prime-boost)免疫策略, 并在猪体上进行了评价。结果显示, 所有免疫猪均产生了高水平的猪瘟特异性的中和抗体, 用猪瘟强毒攻击后, pSFV1CS-E2初免组所有猪(n=5)均没有出现任何猪瘟的临床症状和病理变化, 攻毒后在猪血液中也没有检测到猪瘟病毒RNA, 而重组腺病毒初免组(n=5)有一头猪出现短期发热和病毒血症及轻微病理变化。这表明初免-加强免疫策略能显著提高重组疫苗的免疫效力。

摘要:为研究重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3的抗肿瘤活性, 确定其生物学地位及意义, 本研究提取成体七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺组织总RNA, 经RT-PCR获得cDNA序列长度为357 bp的目的基因片段, 将其克隆于 pET23b载体, 获得带有组氨酸标签的分子量为15 kD的基因重组蛋白rLj-RGD3的高效可溶性表达，通过组氨酸亲和层析纯化蛋白。采用MTT法检测不同浓度rLj-RGD3对bFGF诱导下的Hela细胞增殖的抑制作用, 结果表明rLj-RGD3 能显著抑制Hela细胞的增殖, IC50为2.6 mmol/L。rLj-RGD3作用后的Hela细胞经Hoechst染色及DNA ladder检测结果显示, 细胞均发生凋亡。rLj-RGD3对Hela细胞黏附玻连蛋白(VN)作用的实验结果为有效抑制。采用Transwell细胞培养板对bFGF诱导下的Hela细胞迁移实验表明, rLj-RGD3能够抑制Hela细胞的迁移, 且抑制率达60%。采用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-RGD3对Hela细胞浸润行为实验显示, 以bFGF为趋化剂的Hela细胞穿透Matrigel的浸润行为明显受到抑制。以上研究表明, rLj-RGD3具有典型的RGD毒素蛋白的功能, 有望应用于抗肿瘤基因工程药物开发, 具有重要的生物学意义。

摘要:从山西太原水稻田土壤中, 分离得到一株能以甲烷为唯一碳源和能源生长的菌株 C611。通过生理生化特征及16S rDNA序列分析, 该菌株初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。采用响应面法优化了该菌株利用甲烷的培养条件,得到最佳培养条件为: 温度24.4oC、接种量为6.7%、甲烷含量25%。以C611固定化细菌和溶氧响应仪为体系, 采用电化学法研究了不同含量甲烷的响应时间以及溶氧变化与甲烷含量的关系。结果表明, 菌株C611能利用甲烷, 该反应体系对0~10%甲烷气体测定的响应时间小于100 s; 溶氧消耗量与通入甲烷气体含量呈线性关系, 拟合系数(R2)为0.9994。以3%甲烷气体样品进行8次测量, 测定平均值为3.09%, RSD为3.48%, 相对误差为3%。表明该反应体系重现性良好,为该菌株进一步研究甲烷传感器奠定基础。

摘要:本实验克隆了人的4种SENP(Sentrin-specific protease)C端催化结构域、3种SUMO(Small ubiquitin-like modifer)、ECFP(Enhanced cyan fluorescent protein)以及EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)的基因, 通过RecJoin克隆技术分别成功构建SENP和ECFP-SUMO-EYFP表达载体B28和B13。将表达载体转化大肠杆菌BL21, 经IPTG诱导表达, 通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化, 进一步采用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定, 并以酶切实验初步分析了SENP相对于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特异性。最终, SENP3C(SENP3 catalytic domain)截短表达, SENP5C以包涵体形式表达, 其他蛋白均为可溶性表达, SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)与预期相符, Western blotting方法进一步证实其为目的蛋白。酶切实验初步鉴定了SENP1C和SENP2C的酶切特异性。以上蛋白的原核表达为荧光共振能量转移实验奠定了实验基础。

摘要:新近报道糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体(GITRL)具有抑制前体破骨细胞的作用, 故命名为Osteostat, 为深入研究其功能和机制, 本研究原核表达人GITRL胞外段并进行活性分析。利用限制性内切酶Eco31I获得大肠杆菌偏嗜性GITRL的胞外段cDNA序列, 构建了基于pQE-30Xa的原核表达载体, 并在M15[pREP4]菌株中经IPTG诱导表达带有His融合标签的GITRL重组蛋白, 主要以包涵体形式存在。经体外包涵体变性、复性及纯化后, 采用SDS-PAGE和Western blotting进行分析和鉴定。同时建立了报告基因技术检测GITRL重组蛋白生物活性的方法, 简单便捷、灵敏而且周期短, 利用此方法分析了重组GITRL胞外段表达蛋白的生物活性。

摘要:为了表达具有中和活性的抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体, 采用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗禽流感H5N1-HA鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因及相应的信号肽编码序列, 分别与人免疫球蛋白IgA2重链恒定区、Kappa恒定区基因拼接, 构建表达质粒pEF-IGHA9和pEF-IGK9, 共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO(CHO-dhfr-)细胞,用ELISA检测培养上清中嵌合IgA抗体的表达, 对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blotting 印迹分析。结果成功地在CHO细胞中表达了抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体, 为制备抗H5N1重组分泌型IgA预防性抗体制剂奠定了良好的基础。

摘要:根据A型流感病毒密码子使用偏嗜性, 选取稀有密码子对A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒NS1基因内部110个氨基酸区域进行密码子同义突变改造, 并全基因合成NS基因, 利用反向遗传操作技术拯救出含有密码子去优化NS1基因的重组病毒(deoNS)。体外细胞噬斑形成实验和病毒生长曲线证明该病毒在MDCK细胞内的感染和复制能力比野生型病毒低约1000倍; BALB/c小鼠体内致病力实验证明deoNS病毒不能引起小鼠发病和死亡, 该病毒在小鼠肺内的复制滴度比野生型病毒低100~1000倍。本研究探索了通过基因组密码子去优化改造途径降低A型流感病毒毒力的可行性,首次证明流感病毒NS1基因密码子去优化同义突变可以降低病毒毒力, 为流感减毒活疫苗的研究提供了新的思路。

摘要:DNA-PKcs作为DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)的催化亚基在DNA双链断裂(DSBs)的非同源末端重组(NHEJ)通路中起重要的作用。本实验以人乳腺上皮细胞株MCF10F为研究对象, 通过siRNA技术抑制细胞内DNA-PKcs的表达,用50 cGy 137CS照射细胞, 测定细胞生长曲线以确定细胞对低剂量辐射(LDR)的敏感性, 同时检测DNA 修复相关蛋白表达的变化, 旨在探讨DNA依赖蛋白激酶(DNA-PKcs)基因沉默对人乳腺上皮细胞株MCF10F低剂量辐射敏感性的影响及机制。结果显示: 转染特异性siRNA可使人乳腺上皮细胞(MCF10F) DNA-PKcs基因沉默, 增殖受到明显的抑制; 50 cGy g射线辐射可使乳腺细胞内DNA-PKcs、Ku80、ATM、P53等DNA修复相关蛋白表达增多, 但DNA-PKcs基因沉默细胞(MCF10Fpk)中, 这些蛋白表达显著低于对照组(MCF10Fmock)。以上结果提示, DNA-PKcs基因沉默可引起乳腺细胞对低剂量辐射敏感性增加, 其原因可能与相关DNA修复蛋白表达减少有关。

摘要:本研究探讨了共培养对小鼠囊胚质量及其表观遗传修饰的影响。将小鼠的受精卵体外随机分别置于含颗粒细胞(试验组I)、输卵管上皮细胞(试验组Ⅱ)、输卵管组织块(试验组Ⅲ)的KSOM培养液中作为试验组进行共培养, 同时设立对照组A(体外培养, 仅含KSOM)和对照组B(体内培养)。比较各组受精卵的卵裂率和囊胚发育率; 并应用碘化丙啶和Hoechest333258对囊胚进行染色, 利用ICM/TE值评价各组胚胎体外发育的质量; 同时将囊胚进行免疫荧光染色, 观察其基因组甲基化和组蛋白乙酰化的水平。结果表明, 与对照组A相比, 试验组的卵裂率和囊胚发育率均有显著提高(P<0.05); 同时其囊胚细胞数目及内细胞团细胞数与滋养层细胞数比值 (ICM/TE) 值均显著高于对照组A(P<0.05); 各试验组囊胚基因组甲基化水平与对照组A差异不显著(P>0.05), 但各体外培养组均与对照组B差异显著(P<0.05); 试验组组蛋白乙酰化水平与对照组A、B差异均不显著(P>0.05)。共培养能够有效促进小鼠胚胎的体外发育, 提高囊胚的发育质量, 但是仍不能克服由体外培养造成的基因组甲基化异常。

摘要:本试验用醋酸钙、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂SB203580及钙通道阻滞剂和激动剂刺激小鼠前体脂肪细胞。通过实时定量PCR技术检测前体脂肪细胞分化标志基因和钙信号相关受体基因表达水平, 用油红O染色提取法和Fura-2/AM荧光法测定胞内脂质蓄积情况及胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)变化, 以探讨钙信号调节前体脂肪细胞分化的潜在机制。结果表明：钙通道阻滞剂和激动剂显著改变了脂蛋白脂酶(LPL), 过氧化物增殖激活受体 γ(PPARγ)、脂肪酸合成酶(FAS)的表达水平，且影响细胞内的脂质蓄积。与降低外钙摄入相比，降低内钙释放能促进前体脂肪细胞分化(P<0.01)，而提高外钙摄入与提高内钙释放相比，提高外钙摄入显著抑制前体脂肪细胞分化(P<0.01)。 SB203580可降低胞浆[Ca2+]i浓度，促进前体细胞分化和脂质蓄积(P<0.01)。但钙信号并未影响维生素D受体(VDR)和细胞外钙敏感受体(CaSR)的表达水平。提示钙信号可能通过p38 MAPK通路影响前体脂肪细胞分化和脂质蓄积。

摘要:支持细胞是睾丸的重要组成部分, 其主要功能是为生精细胞提供适宜的生长环境。从幼鼠睾丸中分离得到支持细胞, 并通过苏木精-伊红和Fas-L免疫组化染色对分离得到的细胞进行了鉴定。通过对原代小鼠睾丸支持细胞的贴壁、生长和培养液中葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养底物及其副产物乳酸、铵根离子等的代谢以及培养液渗透压和pH的研究, 发现支持细胞的贴壁时间主要集中在接种后2~4 h; 当培养液中氨根离子浓度高于2.3 mmol/L, 渗透压高于 326 mosm/kg, pH≤6.8时支持细胞生长进入衰亡期; 在氨基酸代谢方面, 发现培养过程中丙氨酸和谷氨酸浓度迅速增加, 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度略有降低, 丝氨酸、精氨酸和甘氨酸浓度基本保持不变。因此培养液中铵根离子浓度的过量积累、渗透压和pH的异常和贴壁面积不足是限制支持细胞静态生长的主要因素。研究结果为支持细胞大规模培养及工艺优化奠定了基础。

摘要:干细胞治疗被认为是一种非常有潜力的治疗手段, 其中成体干细胞由于不存在伦理问题, 更为广大学者所青睐。本研究成功从人羊膜间质细胞中分离纯化出具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。首先从羊膜间质细胞中通过极限稀释法进一步分离得到羊膜来源成体干细胞(Amnion-derived stem cells, ADSC), 分析其形态、生长方式及主要的免疫表型, 并在体外分别将其向脂肪、成骨、内皮、肝细胞及神经细胞诱导分化。结果发现, ADSC在适宜条件下能够向3个胚层的细胞分化, 经连续传代30次, 其形态及表型稳定, 并仍保持多向分化潜能。证实了ADSC的干细胞特性, 可能为细胞治疗及干细胞工程提供种子细胞的新来源。

摘要:根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性, 克隆了家蚕丝素重链基因(Fib-H)启动子及其下游的信号肽序列(FibHS), 将DsRed 基因与信号肽序列融合构建了分泌型瞬时表达载体; 转染细胞实验显示, 该载体能在家蚕BmN 细胞中瞬时表达DsRed; 家蚕注射载体后, 可在丝腺腔中检测到红色荧光, 表明瞬时表达的DsRed分泌到丝腺腔, 推测所克隆的序列具有信号肽的功能。此外, 本研究为家蚕丝腺生物反应器分泌表达外源基因的研究奠定了基础。

摘要:为建立一种快速、简便、灵敏检测Asia1型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析方法(GICA)。本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒, 标记纯化的抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体, 将该标记物与羊抗豚鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane)上, 作为检测带和质控带。经条件优化, 组装成检测Asia1型口蹄疫的诊断试纸条。用该试纸条分别对A、O、C和Asia1型口蹄疫病毒抗原以及猪水泡病病毒抗原等87份样品进行了检测, 发现该试纸条不与口蹄疫病毒A、O、C型以及猪水泡病病毒抗原发生反应, 特异性良好。用该试纸条对口蹄疫细胞毒(TCID50为6.25)的10倍系列稀释液进行了检测, 最低可以检测到大约10-4。该试纸条与其他传统诊断方法的符合率为98.8%。初步实验确定该试纸条在4oC下可保存3个月、37oC和室温下大概可保存1周左右。该试纸条是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法, 对现场检测具有一定实用价值。

摘要:在10 L发酵罐中, 对高致病性禽流感病毒H5N1糖蛋白HA1在重组毕赤酵母中的表达发酵工艺进行了研究。通过分批补料培养方法探讨不同培养温度、诱导温度、补料方式、微量元素等因素对菌体的生长以及重组蛋白表达和活性的影响。结果表明, 菌种培养和诱导温度均为25oC时, 菌体的生长、分泌表达量和与广谱中和抗体的反应活性较好;微量元素是影响重组HA1蛋白生物活性的重要因素; 通过优化高密度发酵工艺, H5N1病毒糖蛋白HA1在发酵罐中的表达量比摇瓶培养提高10.5倍, 达到约120 mg/L, 为大规模制备高致病性禽流感病毒的HA1蛋白奠定了基础。

摘要:细胞区域分布培养以及如何有效地对微流体进行操控是微流控阵列芯片在细胞药物研究中的关键技术。本研究介绍了一种利用SU-8负性光刻胶模具和PDMS制作双层结构的微流控细胞阵列芯片的方法, 该芯片通过C型的坝结构将进样细胞拦截在芯片的细胞培养的固定区域, 键合双层PDMS构成阀控制层, 阀网络的开关作用成功实现了芯片通道内微流体的操控, 同时芯片设计了药物浓度梯度网络, 产生6个不同浓度的药物刺激细胞。通过对芯片3种共培养细胞活性的检测和药物伊立替康(CTP-11)对肝癌细胞的浓度梯度刺激等实验结果验证该芯片在细胞研究和药物筛选等方面的可行性。

摘要:研究了乙醇和H2O2胁迫对芽孢杆菌(Bacillus sp.) WSHDZ-01过量合成过氧化氢酶(Catalase, 简称CAT)的影响。在Bacillus sp.WSHDZ-01培养体系中添加2.0%(V/V)乙醇, 胞内过氧化氢酶酶活达到11 151 U/mL, 是对照组的2.5倍。而在培养体系中添加0.3%(V/V)H2O2, 则使胞内过氧化氢酶不断分泌到胞外, 胞外酶占总酶活比率增加至27%。基于上述发现, 分别以不添加胁迫物(a)、乙醇胁迫(b)、H2O2胁迫(c)为对照, 在培养体系中维持持续的乙醇和H2O2胁迫, 结果表明: 1) 胞外酶比例达到82.5%; 2) 发酵周期缩短为42 h, 比对照a延长了6 h, 比对照b和c分别缩短了8 h和6 h; 3) 生产强度达到470 U/(mL·h), 比对照a提高了18.6%, 为过氧化氢酶工业化生产奠定了基础。