摘要:自然分离得到的原始菌种远不能达到工业生产要求, 通过菌种改良获得高产菌种是有效的手段。传统方法虽然无需了解过多遗传背景就能取得成效, 但往往耗时费力。随着DNA重组技术、原生质体融合、组学研究的应用日益广泛, 微生物菌种改良的新方法和新策略诸如代谢工程、基因组改组和系统生物技术、核糖体工程、表观遗传修饰等逐步发展起来。以下综述了近年来菌种改良相关领域方法和策略特别是首次报道的表观遗传修饰的最新进展。

摘要:干扰素(IFN)是由多种细胞受病毒感染或其他生物诱导剂刺激而产生的天然蛋白质, 主要功能为抗病毒增殖、调节免疫反应和激活免疫细胞等。本研究克隆并测序了猪干扰素(PoIFN)a、g、a g及w基因。构建原核表达载体pET-His/PoIFN-a、pET-His/PoIFN-g、pET-His/PoIFN- ag和pET-His/PoIFN-w, 转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达, 经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。用细胞病变抑制法在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定, 结果表明猪a和ag融合干扰素有较为显著的抗病毒活性, 抗PRRSV活性高达108 U/mg; 猪g干扰素活性效价约为a干扰素的1/2到1/3; 猪w干扰素几乎未检测到抗病毒活性, 需进一步验证。本研究对干扰素在抗病毒、提高机体免疫方面的应用提供了理论依据。

摘要:为探讨表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) 核蛋白(N)基因的重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后诱导特异性免疫应答，本研究制备表达流行性腹泻病毒核蛋白的重组干酪乳杆菌, 应用Western blotting、间接免疫荧光和全细胞ELISA鉴定目的蛋白的表达。然后用该重组干酪乳杆菌口服免疫BALB/c小鼠, 分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性; 并测定免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞因子水平。结果显示, 目的蛋白表达在细胞表面, 可被阳性血清所识别。免疫小鼠后, 可分别在血清中和粪便中检测到较高水平特异性IgG、sIgA(P<0.01), 但血清并没有中和活性; 淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定结果显示, 免疫组可产生明显的细胞免疫应答。结果表明, 该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生黏膜免疫应答和系统免疫应答, 具有作为口服疫苗潜在的应用价值。

摘要:通过PCR技术扩增得到dhbC基因, 对其进行序列分析发现, dhbC基因片段长为1197 bp, 预期编码398个氨基酸, 蛋白分子量大小为43.8 kD。将目的片段连接到表达载体pET-30a(+), 转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-30a-dhbC, 以IPTG在30oC诱导4 h实现高效表达, 获得一个分子量为48.8 kD的融合蛋白。重组蛋白可溶性分析结果表明: 融合蛋白主要为可溶性蛋白。Western blotting分析结果表明: 重组蛋白可与兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性反应, 在48.8 kD处有特异条带, 与预期结果一致, 证明重组质粒中含有dhbC基因。通过同源重组的策略将dhbC基因敲除后重新导入, 验证了dhbC基因与嗜铁素的生物合成密切相关。

摘要:番茄线粒体小分子热激蛋白(Lehsp23.8)启动子是典型的热诱导启动子。为了研究热激条件下该启动子的调控序列, 本研究将不同长度的Lehsp23.8启动子序列与gus基因融合, 构建5￠缺失植物表达载体。然后用农杆菌介导法转化烟草, PCR及Southern blotting结果表明融合基因已经整合到烟草基因组中。GUS组织化学染色结果表明: 不同长度Lehsp23.8启动子转基因植株热激处理后, 在幼苗根、茎、叶以及花和果实中均表现出GUS活性, 只是染色强弱有差异。叶片中GUS荧光活性测定结果表明: 在热激处理条件下, 565 bp的Lehsp23.8启动子介导的GUS表达最强; 而255 bp的Lehsp23.8启动子介导的GUS表达最弱。说明Lehsp23.8启动子中255 bp的序列即能满足该启动子的热激表达, -565 bp~ -255 bp之间存在明显的增强子元件, 而-871 bp~ -565 bp之间的片段具有一定的抑制作用。

摘要:假单胞菌菌株G5是分离自香菜(Coriandrum sativum L.)茎内的一株内生菌, 经BIOLOG系统分析其底物利用图谱, 初步鉴定为桔黄假单胞菌Pseudomonas aurantiaca。大量研究已表明许多革兰氏阴性细菌应用群体感应系统, 通过感应扩散性小信号分子―乙酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones, AHLs), 以种群密度依赖的方式调控基因表达, 控制植物相关细菌的多种表型。本研究组合应用AHLs检测菌株Chromobacterium violaceum CV026 和薄层层析分析, 初步检测出菌株G5 可产生几种可检测水平的AHLs 信号分子, 其中以N-hexanoyl-homoserine lactone (C6-HSL, HHL)为主, 迁移率Rf值为0.4。进一步克隆和测序了该菌株中由PhzI和PhzR组成的群体感应quorum sensing系统的编码基因phzIR, 并在大肠杆菌中异源表达了AHLs信号分子合成酶基因phzI。序列和系统进化分析表明它们与假单胞菌属其他的phzIR基因有高度同源性和进化上的保守性。

摘要:利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物病原真菌高效拮抗菌株。为了明确其抑菌活性的物质基础, 利用大孔树脂和硅胶吸附柱层析、HPLC循环制备分离等方法, 从菌株A02发酵液中分离获得了纯度达99.845%以上的单一组分活性化合物。经紫外光谱、高分辨质谱、红外光谱和核磁共振谱的测定和解析, 确定了该活性化合物的分子量为665, 分子式为C33H47NO13, 化学结构与四烯大环内酯类抗生素纳他霉素相同。这一结果揭示了利迪链霉菌产生抗真菌天然产物的新功能, 并为纳他霉素在植物病害生物防治中的应用开拓了新的途径。

摘要:安莎类抗生素例如利福霉素和安丝菌素, 通常由一组化学结构相似的组分组成。格尔德霉素为苯安莎类抗生素,已经发现4个组分。本研究采用高效液相色谱-串联质谱方法对格尔德霉素(GDM)制品中的微量组分进行了分析, 发现5个新的和1个已知的GDM类似物。依据质谱数据、结合GDM生物合成机制, 对6个GDM类似物的化学结构进行了推测: 分子式为C29H42N2O10的新化合物3个, 分别为GDM安莎链上C2-C3、C4-C5和C8-C9之间的C-C双键变为单键并同时单羟基化的GDM衍生物; 分子式为C28H38N2O8的新化合物2个, 其中1个为17(或12, 或4)-去甲氧基格尔德霉素, 另1个为4, 5-双氢-10, 11-脱水-17-去甲基-17-羟基格尔德霉素; 分子式为C29H42N2O9的已知化合物1个, 为4,5-双氢格尔德霉素。这些GDM类似物的发现有助于加深对GDM生物合成的认识, 并对通过基因阻断、组合生物合成技术获得GDM衍生物的研究有启示作用。

摘要:真核生物多头绒泡菌的原质团是研究细胞周期的好材料。但尚无合适的表达体系可供选择。本研究用多头绒泡菌ardC actin基因启动子和终止子分别替换哺乳动物细胞表达质粒pDsRed1-N1的CMV IE和SV40 polyA片段, 构建了多头绒泡菌红色荧光蛋白(RFP)表达质粒pXM1; 用PardC-MCS-DsRed1-TardC替换pTB38表达盒PardC-hph-TardC, 构建了多头绒泡菌RFP表达质粒pXM2。将多头绒泡菌转录延伸因子类似蛋白(PELF1)基因与质粒pXM2重组, 构建了PELF1红色荧光融合蛋白(PELF1-RFP)表达质粒pXM2-pelf1。通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察RFP表达发现, 电转参数为4 kV/cm(电场)、1 A(电流)、70 ms(电击时间)时, 质粒pXM1和pXM2电转多头绒泡菌微原质团(≤500 mm)后24~48 h内, RFP荧光最显著; 而PELF1-RFP则主要聚集在多头绒泡菌细胞核, 说明本试验建立的表达系统可以用于研究特定蛋白在多头绒泡菌内的瞬时表达。

摘要:通过菌种优选得到产高选择性羰基还原酶的热带假丝酵母(Candida tropicalis) 104菌株, 可不对称还原1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙酮生成(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇, 对映体过量值>99.9%。采用部分因子实验设计考察发酵培养基中各组分对产酶的影响, 结果表明, 酵母粉、葡萄糖和NH4Cl浓度对产酶影响显著。继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域, 并结合中心组合实验和响应面对3个显著性因素进行分析, 得到优化的发酵培养基组成: 葡萄糖47.14 g/L, 酵母粉13.25 g/L, NH4Cl 2.71 g/L, MgSO4·7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 1 g/L和K2HPO4 1 g/L。采用该优化培养基, 供试菌株的羰基还原酶活力达851.13 U/L, 较优化前提高了65.2%。

摘要:利用含有三油酸甘油酯的脂肪酶选择性筛选培养基, 从奶牛瘤胃微生物元基因组文库15 360个克隆中, 筛选得到了18个脂肪酶阳性克隆, 其插入片段大约为60 kb, 并且各个克隆的插入片段各不一样。利用p-NPP法对脂肪酶克隆的脂肪酶活性分析, 表明均具有大小不等的脂肪酶活性。底物特异性分析表明Lipase6、Lipase7和Lipase8分别对C16底物(对硝基苯棕榈酸酯)、C12底物(对硝基苯月桂酸酯)和C16底物(对硝基苯棕榈酸酯)水解能力最强。Lipase 6、Lipase 7、Lipase 8的脂肪酶最适pH为7.5; Lipase8的脂肪酶活性半衰期随反应温度的升高而缩短, 70oC时能达到30 min。本研究所筛选的脂肪酶具有不同的底物特异性和较好的热稳定性, 这对于工业化生产具有一定的应用潜力。

摘要:利用基因工程手段得到重组菌YPH499-3中的spt15有效突变基因, 通过表达载体 pYX212转化入酿酒酵母原始菌株YPH499中, 重新获得酿酒酵母重组菌株。对其性状进行研究, 结果表明该菌株能有效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC、200 r/min, 发酵72 h时, 50 g/L木糖的利用率为82.0%, 乙醇产率为28.4%; 当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时, 木糖和葡萄糖的利用率分别为80.4%和100%, 乙醇产率为31.4%; 同时发现木糖醇的含量极低。从而验证了有效突变基因spt15-10对酿酒酵母共发酵木糖和葡萄糖产酒精的影响。

摘要:采用液体深层发酵方式, 研究了药用昆虫蜣螂对灵芝细胞生长、关键活性产物发酵动力学和抗小鼠肝癌活性的影响。结果表明, 药用昆虫蜣螂在各添加浓度下对灵芝的细胞生长均无显著促进作用; 但在添加量为5 g/L时, 对灵芝多糖和灵芝三萜的发酵动力学有显著影响(P<0.05), 在发酵第7天时, 灵芝总多糖和总三萜的产量分别达到2.81 g/L 和 539.0 mg/L(对照组分别为2.25 g/L和 428.2 mg/L)。小鼠体内抗肝癌结果表明, 灵芝对照发酵物的抑癌率为41.61%, 灵芝-蜣螂配合物的抑癌率为42.24%; 而补加蜣螂发酵后的灵芝加蜣发酵物的抑癌率高达57.21%, 与灵芝对照发酵物的抑癌率相比, 提高了37.49%。研究表明, 采用昆虫蜣螂补料-分批发酵后, 灵芝发酵物抗小鼠肝癌的活性得到显著增强。

摘要:本研究采用间歇培养方式对丁酸梭菌 T4发酵木糖进行产氢研究, 考察初始pH和初始底物浓度对其产氢特性的影响。结果表明, 菌株T4 在初始pH 5.0~8.5及初始底物浓度 5~40 g/L时均可以产氢, 其累积产氢量和最大比产氢速率随着pH及底物浓度的增加均呈现先增加后减少的趋势。在pH 6.5和底物浓度20 g/L时, 比产氢速率和累积产氢量达到最大, 分别为4.26 L/L和18.86 mmol-H2/h g-DCW, 而后随着pH或者底物浓度的增加二者均呈现减少的趋势; 在pH 6.5和底物浓度15 g/L时, 得到最大值比产氢量为2.17 mol/mol-木糖。而在不同的pH下, 发酵产生的液态产物主要是乙酸和丁酸, 其中在pH小于6.0时, 有少量的丙酸生成, 而在pH大于6.0时, 则有乙醇生成。

摘要:为改善过程传质, 提高甾类药物中间体11β-羟基甲羟孕酮C1, 2生物脱氢转化率, 采用简单节杆菌Arthrobacter simplex UR016菌株在Tween-80/乙醇/食油/水构成的微乳体系中进行生物脱氢, 并考察了微乳体系组成、转化温度、投料浓度对脱氢反应的影响。结果表明: 以菌体培养液作为水相, 食油作为油相构建微乳体系, 食油最适加量为10 g/L, 表面活性剂Tween-80加量为4 g/L; 底物经醇溶后水析投料, 乙醇最适加量为发酵液体积的7% (V/V); 最适转化温度为33°C; 当底物浓度为4 g/L时, 在构建的微乳体系中转化46 h, 脱氢转化率达88.6%, 与水相转化工艺相比提高了66.2%。在该体系中疏水性11b-羟基甲羟孕酮底物得到了有效的增溶和扩散, 生物脱氢转化率明显提高。

摘要:使用O. intermedium DN2降解烟草薄片制备液中的烟碱。研究了各种工艺参数对烟碱降解的影响, 单因素考察结果表明烟草薄片制备液中烟碱降解的最适条件是: 添加0.1%的酵母膏, 使用氨水将pH调节到7.0, 接种15%种子液, 培养温度30oC。在上述条件下, 采用30L发酵罐对烟草薄片制备液进行3个批次的半连续发酵, 烟碱的平均降解速率为140.55 mg/L/h, 高于其他烟碱降解菌株。该结果表明菌株DN2可以用来降低烟草薄片中的烟碱含量。

摘要:以下综述了微生物发酵法制备二羟基丙酮的研究进展。利用微生物发酵法生产二羟基丙酮比化学合成法具有更大的优势, 氧化葡萄糖酸杆菌是二羟基丙酮工业发酵生产中最有应用价值的菌株。发酵过程中底物、产物、氧气、菌体量等各种因素都会对二羟基丙酮产量产生影响, 在各种发酵方式中反复流加工艺和固定化发酵工艺最有前途。重组菌株的构建和发酵工艺的优化是将来微生物发酵生产二羟基丙酮的发展方向。

摘要:微生物种类丰富, 尺寸涵盖纳米与微米级, 是天然的可用于纳米、微米及多层次跨尺度加工的“基本单元”。目前的生物制造方法大多不适用于微生物活细胞, 无法发挥其整体的生物学功能及优势。本研究探索并建立了微流控和磁控的可用于微生物活体的微纳米生物制造新方法, 定位操纵和有序排列微生物活体。以微生物为微纳米机器人, 诱发其特有的生物学功能, 进行受控自组装等生物制造过程, 由此有望设计和创制一系列新型特殊功能材料和器件。

摘要:采用液体深层发酵方式, 研究了几种药用昆虫对灵芝多糖生物合成的影响。结果表明, 药用昆虫蜣螂在添加量为5 g/L时能显著促进灵芝胞内多糖(IPS)和胞外多糖(EPS)的形成(P<0.05)。胞内多糖和胞外多糖的产量分别由对照的(1.93 ± 0.09) g/L和(520.3 ± 20.2) mg/L 提高到(2.41 ± 0.12) g/L和(608.9 ± 20.2) mg/L。灵芝胞内多糖和胞外多糖在DEAE纤维素柱上都可分离得到5种主要组分, 其中IPS-1和EPS-1分别为2类多糖的主要组分。进一步用凝胶柱分离显示, IPS-1由3个单个的组分组成, EPS-1由2个单个的组分组成。添加蜣螂发酵后, 灵芝胞内多糖和胞外多糖中没有出现新的组分, 且各组分的相对含量也没有显著变化(P>0.05), 提示添加蜣螂发酵后, 灵芝胞内多糖和胞外多糖主要组分的合成途径并未改变。

摘要:本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA, 构建到pPICZaA载体上, 并在毕赤酵母GS115中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47)。该酶的全长cDNA共1481 bp, 编码445个氨基酸, 序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外, 还含有CBD和GHF5的结构域, 因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员。诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL, 蛋白含量为440 mg/L。重组酶的最适反应温度为60°C, 在30°C~65°C比较稳定; 酶促最适pH为5.5、4.5~7.0之间比较稳定。这是首次关于Armillariella. tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道, 得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶, 将在饲料、食品、药物生产等方面有广泛的应用。

摘要:对内切葡聚糖酶的功能改进一直是纤维素酶研究领域的焦点。本研究对台湾家白蚁内切葡聚糖酶(CfEG)的活性位点做了饱和突变。首先, 以PDB数据库中高山象白蚁内切葡聚糖酶(NtEG)的三维结构(PDB id=1ks8)为模板, 对CfEG进行三维结构同源建模, 二者序列一致性高达79%。位于CfEG活性中心的D53、D56、E411, 分别与NtEG的催化残基 D54、D57、E412重合。用简并引物对CfEG的假定活性位点D53、D56、E411进行定点饱和突变。在位点D53、D56各筛选到羧甲基纤维素酶活有一定提高的突变子D53E、D56C, 其中D56C的 Km值减小为原始酶的三分之一 。双突变子D53L/D56I的比活比原始酶提高了近2倍, 同时Km值减小至原始酶的一半。而E411的饱和突变子库均没有活性, 进一步将其替换为近似氨基酸的E411D、E411Q定点突变子也丧失了酶活。由突变结果可推断, 位点E411为该酶行使功能的必需残基。

摘要:为探讨共培养对放线菌产生活性次生代谢产物的影响, 结合抗菌活性测定及HPLC-PDA分析, 研究了22株放线菌的单培养及其与枯草芽孢杆菌的共培养发酵代谢产物的差异, 并选取抗菌活性较强的链霉菌FXJ2.014进一步研究其代谢产物。发现FXJ2.014、FXJ1.296、AS 4.1252三株菌与枯草芽孢杆菌共培养时产生其在相同条件下单培养时没有的物质, 其中链霉菌FXJ2.014单培养时主要产生醌霉素A, 共培养时产物中增加了醌霉素结构类似物FXJ2.014-HB。进一步的抗菌、抗肿瘤活性测定结果表明, 两者的生物活性有较显著的差异, 且FXJ2.014-HB对多种肿瘤细胞系的抑制活性普遍弱于高毒性的醌霉素A, 为有潜力的细胞毒性较小的抗生素。共培养是一条很有希望的发掘放线菌活性次生代谢产物的新途径。

摘要:本研究开发了一种用石油醚提取毛油的工艺, 研究了以提取的毛油和甲醇为原料, 用固定化Candida sp. 99-125脂肪酶催化合成脂肪酸甲酯(FAMEs)的可行性。同时考察了磷脂对固定化酶活性、反应起始速率、固定化酶使用批次的影响以及毛油和精炼油对固定化酶使用批次等的影响。研究结果表明, 用磷脂质量分数为1%的石油醚悬液浸泡过的脂肪酶比仅用石油醚浸泡过的脂肪酶初始转酯化速率显著下降。当大豆油中无磷脂时, 15 min时FAMEs的产率为26.2%; 磷脂质量分数为5%时, FAMEs降为12.4%。当大豆油中磷脂质量分数小于1%时, 固定化酶使用10个批次, FAMEs产率无明显变化。固定化脂肪酶催化石油醚浸提得到的大豆和小桐子毛油, 经过10个批次反应FAMEs产率都保持在70%以上, 该固定化酶直接催化毛油生产生物柴油具有良好的工业化前景。

摘要:产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力, 本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1, 构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后, 电击转化根癌农杆菌LBA4404, 通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母, 构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96 h后, 重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%, 平均耗糖速率提高12.97%, 平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。