摘要:宏蛋白质组学是近年来出现的一种对天然环境微生态进行大规模蛋白质组学研究工作, 其定义为对给定位点的环境微生物群落的所有蛋白质组成进行的即时的大规模的分析。以下将通过分析已有的宏蛋白质组学研究, 并结合本研究组的研究经验, 对本领域的研究策略、进展情况等加以综述。

摘要:为了制备高效表达人b-防御素-3基因的转基因奶牛提供可靠的核移植供体细胞, 本试验采用RT-PCR从人胎盘组织获得人b-防御素3 cDNA, 通过双酶切法将目的基因片段hBD插入到质粒pBCP之间, 最后再通过双酶切法将目的片段BCD插入到真核表达载体pEGFP-C1中, 最终构建乳腺特异性表达载体pEBCD。脂质体介导法转染奶牛胎儿成纤维细胞G418, 抗性筛选3~4 周后, 经PCR、RT-PCR 扩增检测和报告基因EGFP表达检测, 得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞; 同时检测稳定转染的奶牛乳腺上皮细胞系的上清液, 检测到重组人b-防御素-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮细胞组织特异性表达。

摘要:为了构建新型的杂合肽, 设计了一种新型杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素(1-15)-蜂毒素(5-12), 由牛乳铁蛋白素(LfcinB)N端第1~15个氨基酸残基和蜂毒素(Melittin)N端第5~12个氨基酸残基组成。根据大肠杆菌密码子的偏爱性, 设计合成了杂合肽LfcinB(1-15)-Melittin(5-12)的基因片段, 插入到表达载体pET-32a的Nco I和Sal I的酶切位点之间, 构建重组表达质粒。重组表达质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中, 经异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达, 融合蛋白以可溶形式在Escherichia coli BL21(DE3)中获得成功表达, 表达量占菌体总蛋白的35%以上, 每升培养物可获得35 mg融合蛋白。带His标签的融合蛋白经His×Bind纯化试剂盒纯化、肠激酶切割和抑菌实验表明, 杂合肽具有明显的抑菌效果。这为利用基因工程方法生产抗菌肽奠定了理论基础。

摘要:本研究在完成FMDV O/QYYS/s/06株全基因组序列测定的基础上, 分3段对全基因组进行克隆, 其后将各片段克隆到载体P43中, 从而获得携带O/QYYS/s/06株基因组全长cDNA的重组质粒P43C。将重组质粒P43C与表达RNA聚合酶的质粒T7共转染BHK-21细胞, 48 h后收获培养液接种2~3 d乳鼠, 取经乳鼠传代后的第4代病毒液, 经反向间接血凝、中和试验和测序等方法证明拯救的病毒为O型FMDV。以上结果表明, O/QYYS/s/06株全长cDNA分子克隆的构建成功。

摘要:研究补体C3d的受体结合功能区(M28)对伪狂犬病毒gC基因DNA疫苗免疫增强作用。将4拷贝的M28基因与伪狂犬病毒gC基因串联后, 克隆到载体pcDNA3.1中, 构建融合表达的重组质粒(sgC-M284)。BALB/c小鼠免疫试验表明, sgC-M284免疫组比单独表达伪狂犬病毒gC蛋白的重组质粒(sgC)免疫组产生的ELISA抗体高17倍, 对致死剂量(316 LD50)伪狂犬病毒攻毒的保护率提高了63%。gC基因与M28基因融合表达诱导产生的IL-4水平接近了伪狂犬灭活疫苗免疫组的产生的IL-4水平, 显著增强了基于Th2途径的体液免疫反应。

摘要:节能减排的生物预处理技术是促进木质纤维素酶水解转化乙醇的有效途径。本试验首次研究了白腐菌杂色云芝(Trametes vesicolor)生物预处理对柳木(Salix babylonica, 硬木)和杉木(Cunninghamia lanceolata, 软木)纤维素酶水解的影响及作用机制。结果显示生物预处理使硬木和软木的最终转化率分别增加4.78倍和4.02倍。通过研究酶与基质的相互作用发现, 预处理后木材基质与酶亲和力的增强并不一定导致酶水解初始转化率的提高; 但水解过程中转化速率的下降速度随着解吸附指数增加而降低, 说明生物处理主要通过减少纤维素酶对基质的不可逆吸附, 延缓水解过程中基质转化速率的急剧下降, 从而提高水解效率。不可逆吸附的降低与预处理过程中木质素的部分降解与改性有一定关系。

摘要:为研究牙鲆甲状腺激素受体TRaA在牙鲆变态发育过程中的调控作用, 将TRaA基因克隆插入融合表达载体pET30a, 并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达。表达菌株经1 mmol/L 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后, 重组蛋白TRaA表达并形成包涵体。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化, 柱上复性法对重组蛋白复性, 获得纯度较高的目的蛋白, 蛋白复性的效果良好。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。Dot blotting检测抗体效价达1:200 000, 检测证明抗体特异性良好。此外, 通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRaA的特异性结合, 表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控。

摘要:乙酰羟酸合成酶(AHAS)是磺酰脲类和咪唑啉酮类等AHAS抑制剂类除草剂的作用靶标。获得抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值。本研究从抗甲磺隆菌株Klebsiella sp. HR11和甲磺隆敏感菌株Klebsiella pneumoniae MGH 78578中分别克隆到AHAS三种同工酶基因ilvBN、ilvGM和ilvIH。抗性菌株和敏感菌株AHAS三种同工酶基因在氨基酸水平上差异位点主要集中在ilvBN和ilvGM的大亚基上。将2株菌的ilvBN、ilvGM和ilvIH分别构建到表达载体pET29a(+)中, 在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达, 测得只有含菌株HR11 ilvBN和ilvGM的转化子细胞破碎液AHAS对各类AHAS抑制剂类除草剂具有较强的抗性, 而含菌株HR11 ilvIH和菌株MGH 78578 ilvBN、ilvGM和ilvIH的转化子细胞破碎液AHAS对各类AHAS抑制剂类除草剂敏感。

摘要:通过根癌农杆菌(含植物表达载体YXu55)介导的转化技术, 将褪黑素生物合成酶-芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase, AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase, HIOMT)基因导入到烟草(秦烟95)中。对所获得的庆大霉素抗性烟草株系进行Southern blotting和RT-PCR分子生物学检测, 结果表明, AANAT-HIOMT基因已成功地整合到烟草基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定转化株系的褪黑素含量表明, 转AANAT-HIOMT基因烟草株系的褪黑素含量均明显高于pZP122(不含AANAT和HIOMT基因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株, 证明AANAT-HIOMT基因在转基因植株中的表达增强了褪黑素的合成能力。对不同株系抗氧化系统的部分指标进行了测定, 并与其亲本对照植株比较, 发现AANAT-HIOMT基因在转基因植物中的表达引起超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性增加, 谷胱甘肽(GSH)浓度以及总抗氧化能力升高, 且没有引起膜脂质过氧化物丙二醛(MDA)的变化, 说明转基因烟草抗氧化潜能得到提高。

摘要:朊病毒是引起可传染的致死性海绵状脑病的致病因子, 细胞中正常的朊病毒蛋白(PrPC)在该疾病病程发展中起着必不可少的作用。同时, PrPC已被证明在胃癌、乳腺癌等癌症中发挥着保护癌细胞的作用。根据人源PrPC(HuPrPC) cDNA序列, 本研究设计了4种19 nt的siRNA, 将其构建成RNAi逆转录病毒载体系统, 进行了其对HuPrPC表达的抑制效应的分析, 从中获得了能高效稳定抑制HuPrPC表达的3种靶向序列, 其中si626(5￠-GGTTGAGCAGATGTGTATC-3￠)的抑制效果最为明显, 其抑制效率可达85%以上。随后, 利用筛选出的si292和si626的稳定干扰细胞系进行了细胞浸润性实验, 结果发现, PrPC干扰细胞系细胞浸润能力显著下降。这为进一步研究朊病毒疾病的基因治疗、以PrPC为靶标进行PrPC相关癌症的辅助治疗研究奠定了一定的基础。

摘要:恒河猴是研究人免疫缺陷型病毒(HIV)感染与获得性免疫缺失综合征(AIDS)疫苗研制的最为重要的动物模型,其组织相容性复合体(MHC)结构的解析将有助于了解HIV?免疫逃逸机制。本研究克隆了1个恒河猴MHC-I类分子Mamu-A*02轻链(β2m)基因并插入到pET21a(+)原核表达载体中, 成功构建了重组表达质粒pET21a(+)-Mamu-β2m。pET21a(+)-Mamu-β2m和之前构建好的恒河猴Mamu-A*02重链(α)重组质粒pET21a(+)-α分别转入BL21(DE3)大肠杆菌表达体系中, IPTG诱导表达。Mamu-A*02重链和猴β2m目的蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达。重链、轻链的包涵体蛋白和Mamu-A*02限制的猴免疫缺陷病毒(SIV)Nef表位多肽(YY9)通过稀释法共复性。高纯度的复合物蛋白经分子筛层析和阴离子交换层析纯化后获得。复合物晶体利用悬滴法筛选并优化, 并在0.1 mol/L BIS-TRIS (pH 5.5)、2.0 mol/L (NH4)2SO4 条件下收集一套2.8 ?分辨率的X-射线衍射数据。晶体属于正交空间群P212121, 其晶胞参数为a=128.99 ?, b=129.01 ?, c=129.03 ?, α=β=γ=90°。该数据可通过分子置换法解析。

摘要:构建IL-24和E1A双基因腺病毒载体, 获得Ad-IL-24-E1A重组腺病毒子, 分析其体外抑瘤作用。PCR及BglⅡ和SalⅠ酶切获得IL-24, 与空载体构建成pAdTrack-IL-24-IRES。Xho I和EcoR V酶切获得E1A片段, 与pAdTrack-IL-24-IRES连接后成功构建pAdTrack-IL-24-IRES-E1A, 同源重组、包装和扩增获得Ad-IL-24-E1A重组病毒子。用50 MOI重组腺病毒感染 SMMC-7721肝癌细胞, MTT法测定Ad-IL-24-E1A的细胞生长抑制作用; 流式细胞仪分析细胞凋亡情况。本研究成功获得Ad-IL-24-E1A重组病毒子。与其他组相比, Ad-IL-24-E1A明显抑制肿瘤细胞生长, 感染48 h后凋亡率达52%, 而抑制正常细胞作用不明显。研究提示Ad-IL-24-E1A双基因重组载体明显抑制SMMC-7721肝癌细胞生长。

摘要:向抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(Diabody)中引入二硫键, 使diabody两条链以共价键交联, 增强其稳定性。用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR方法, 将抗CD3/抗Pgp diabody中抗CD3或抗Pgp轻重链可变区的适当部位定点突变成半胱氨酸, 进行原核表达。表达产物经阳离子层析柱和抗Etag亲和层析柱分离纯化, 还原性和非还原性SDS-PAGE电泳鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FCM)检测生物学活性。将改造前后的两种抗体分别置37oC含0.2%人血清白蛋白(Human serum albumin, HAS)的PBS中孵育, 取多个时间点比较两者与两种把抗原的结合能力。基因重组质粒经测序证实序列正确。向抗Pgp轻重链引入突变的diabody(dsPgp-diabody)在原核表达系统中, SDS-PAGE显示纯化后的蛋白二硫键不能配对。而向抗CD3轻重链引入突变的diabody(dsCD3-diabody)能够在原核表达系统中进行可溶性表达, 二硫键能够正确配对。并且与改造前的diabody相比, dsCD3-diabody的抗原结合特异性没有改变, 抗原结合和竞争活性均无下降。改造前的diabody在37oC PBS(0.2% HAS)中孵育1 h后活性即开始下降, 24 h后活性完全丧失; 而dsCD3-diabody孵育72 h后活性并无明显下降。本实验成功构建了dsCD3-diabody, 并且能够进行可溶性表达。向diabody抗CD3轻重链区引入的二硫键在宿主菌中可以正确配对, 抗原结合活性没有明显下降, 而稳定性大大增强。向diabody轻重链区引入二硫键, 以增强其稳定性的方法是可行的。

摘要:PRAS40为富含脯氨酸、分子量为40 kD的Akt底物蛋白, 能够与雷怕霉素哺乳动物细胞靶点复合物1(mTORC1)结合, 其苏氨酸183位点(Ser183)可被mTORC1磷酸化。为了制备PRAS40(Ser183)磷酸化多克隆抗体, 本实验通过蛋白疏水性抗原性分析设计多肽抗原, 用其免疫家兔获得抗血清, ELISA检测其效价为1:10 000; Western blotting法检测发现, 通过rProtein A Sepharose亲和层析纯化并经非磷酸化的抗原条吸附处理后的抗体可以明显提高磷酸化抗体的特异性; 用PRAS40抗体及PRAS40(Ser183)磷酸化抗体对正常细胞HL7702、HEK293及肿瘤细胞HepG2、A549、S180的检测显示: 磷酸化的Ser183在不同细胞中表达差异不显著, 而在经细胞饥饿处理的HEK293细胞中却明显观察到了S183磷酸化水平随氨基酸含量降低而减弱的现象。因此, 本实验所制备的抗体可用于PRAS40(Ser183)磷酸化位点的功能研究。

摘要:采用两步法将碳酸酐酶共价键合在聚甲基戊烯(Polymethyl-pentene, PMP)膜式氧合器表面以提高其清除血液中CO2的能力。首先采用等离子体处理法将羟基引入PMP表面, 然后用偶联剂溴化氰(CNBr)将碳酸酐酶(Carbonic anhydrase, CA)固定在PMP膜表面。采用XPS、表面接触角测定仪对等离子体处理后材料表面的物理化学性质进行了表征。以对硝基苯酚乙酸酯(p-nitrophenyl acetate, p-NPA)为底物, 采用紫外分光光度计测定了接枝CA的活性、浓度、重复利用性、储存稳定性。结果表明, 等离子体处理方法能将羟基成功引入PMP表面; CA能被成功地偶联在无活性官能团聚合物表面, 在保持酶活性的同时获得较高的接枝效率; 共价接枝CA(Covalently immobilized CA, CACI)的浓度随CNBr浓度的增加而增加, 最大可达理论单分子层接枝量的73%; CACI比物理吸附的CA(Physically adsorbed CA, CAPA)具更好的重复利用性; 37oC下, CACI比CA溶液表现出更好的储存稳定性。本方法有望应用在膜式氧合器上以提高其对血液中CO2的排除效率。

摘要:本研究考察了水杨酸对霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞生长、多糖合成、碳代谢的影响, 并研究了细胞生长、多糖合成以及蔗糖消耗的动力学。结果表明, 水杨酸对霍山石斛类原球茎细胞生长有轻微的抑制作用, 但能够显著改善类原球茎对碳源的利用, 提高胞内可溶性糖的含量, 从而促进多糖的合成, 其中以添加100 mmol/L浓度的水杨酸效果最好, 培养18 d时, 多糖产量达到3.129 g/L, 为对照的1.63倍。建立的培养动力学模型能较好地反映水杨酸调控霍山石斛类原球茎悬浮培养过程中细胞生长、多糖合成和蔗糖消耗特性。

摘要:抗-CD25单克隆抗体作为免疫抑制剂拥有广阔的市场前景和巨大的经济价值。本实验以表达抗-CD25单克隆抗体的GS-NS0细胞为研究对象, 开发了支持其大规模培养和抗体表达的无血清低蛋白培养基, 批培养最大活细胞密度和最大抗体浓度分别达3×106 cells/mL和300 mg/L以上, 比商业无血清培养基(Excell 620 + 0.2% primatone)分别提高了100%和46%。通过批培养实验, 研究了细胞的生长、葡萄糖和氨基酸代谢、以及产物表达特点, 并揭示了批培养过程中初始葡萄糖浓度对GS-NS0细胞生长与代谢的影响规律。为优化GS-NS0细胞培养过程和抗CD25单抗成功迈向产业化提供了重要的科学依据。

摘要:目前主要使用激光共聚焦扫描显微镜观察绿色荧光蛋白的表达, 但需要昂贵的仪器并耗费大量时间。本研究开发了一种新型激光诱导的微流芯片检测系统来监测绿色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达。该系统主要由激光装置、光路系统、微流控芯片、光电倍增管和计算机处理系统等5部分组成。对该系统的测试结果显示, 随着诱导强度的增强监测信号峰也随之增强, 并且与激光共聚焦显微镜观察的结果一致。利用该芯片系统能够快速准确地筛选和鉴定用绿色荧光蛋白作为标记的细胞克隆, 可以替代PCR鉴定方法。但该系统仅仅能够监测表达强度, 不能够满足蛋白定位等高水平研究, 因此, 该系统适合应用于环境的微生物监测、药物筛选和其他无需观察蛋白定位等研究。

摘要:利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白, 经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs), 研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。首先, 提取HPV18的基因组DNA, 通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段, 将其插入pTrxFus表达载体, 在大肠杆菌中可溶性表达HPV18 L1蛋白; 其次, 通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析获得高纯度的HPV18 L1蛋白, 而后透析去除预先加入的还原剂DTT, 使HPV18 L1蛋白自发组装成VLPs; 最后, 通过动态光散射技术和透射电子显微镜鉴定HPV18 VLPs的大小和形态, 利用假病毒细胞中和实验评价HPV18 VLPs在实验动物体内的免疫原性和中和抗体生成水平。结果表明, HPV18L1蛋白可以在大肠杆菌表达系统中以可溶形式表达, 经过纯化的HPV18L1蛋白可以自发组装成为半径约为29.34 nm、与HPV病毒外观相似的VLP。该VLPs在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量为0.006 mg, 在兔及山羊体内诱导中和抗体滴度高达107。总之, 本研究利用原核表达系统可简便高效地获得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs, 为HPV18预防性疫苗的开发奠定了基础, 具有重要的应用意义。

摘要:雌激素受体α (Estrogen receptor α, ERα)是一种类固醇核受体, 在机体的多种生理功能中起关键作用。为了筛选新的ERα调节剂, 本研究建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因技术的高通量ERα调节剂筛选模型。利用RT-PCR技术从脂肪组织总RNA中扩增ERα配体结合区(Ligand binding domain, ERα LBD)基因序列, 并插入含GAL4 DNA 结合域的pBIND-GAL4表达质粒构建pBIND-GAL4-ERα(LBD)的嵌合表达质粒。该质粒与本室已构建好的含GAL4响应元件和荧光素酶的报告质粒pGL3-GAL4共转染, 通过测定荧光素酶的活性评价ER调节剂的转录调剂的活性。经过多种条件优化, 激动剂阳性药对照雌二醇可以剂量依赖地诱导荧光素酶的表达, 最大上调倍增数可达28.1倍, EC50为0.17 mmol/L。拮抗剂阳性对照它莫昔芬可以有效地拮抗雌二醇的活性, 最大下调倍数为6.3倍, EC50为0.1 mmol/L。该筛选模型可微量化于384孔板, 且Z'因子均大于0.5。利用该模型从2000多个微生物和植物来源的天然产物以及合成化合物中筛选得到4个ERα激动剂。该模型灵敏、稳定, 可以快速进行多种来源的ERα调节剂的筛选和活性评价。

摘要:在以往工作的基础上本研究对现有猪胚胎玻璃化冷冻保存技术进行了优化。以巴马小型猪为供体, 采用超数排卵技术, 采集5~6日龄的胚胎(囊胚/桑椹胚), 比较冷冻方法、胚胎承载工具胚胎、透明带处理和冷冻胚胎移植受体对猪胚胎冷冻效果的影响。结果表明, 冷冻方法I[胚胎首先在冷冻液1 (TCM199+20% FBS+10% EG+10% DMSO)中平衡 3 min, 然后立即转入冷冻液2 (TCM199+20%FBS+20%EG+20%DMSO+0.4 mol/L SUC)中并在1 min内装管(每管含2~6枚胚胎), 直接投入液氮保存]与冷冻方法II[透明带完整的胚胎在NCSU23(含7.5 mg/mL CB)培养液中平衡25 min, 13 000 ×g离心12~13 min, 然后在含2 mol/L EG的NCSU23中平衡5 min, 再在含8 mol/L EG+7% PVP的NCSU23中快速漂洗, 装进OPS/GMP管, 放入液氮保存]冷冻效果没有显著差异; GMP法能显著提高冷冻胚胎存活率(83.8% vs 77.6%, P < 0.05)和囊胚细胞数(47.5 vs 53.1, P < 0.05); 以0.5%链蛋白酶(Pronase)处理透明带10 s, 虽然对猪胚胎存活率没有显著影响, 但能显著提高囊胚细胞数(60.1 vs 46.6, P < 0.01); 以地方猪种(枫泾母猪)为冷冻胚胎移植受体能显著提高妊娠率和胚胎效率(P<0.01)。

摘要:研究利用intein的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对凝血VIII因子(FVIII)重链和轻链的连接作用, 将B结构域大部分缺失型FVIII(BDD-FVIII)于满足剪接所需的保守性氨基酸Ser1657前断裂为重链和轻链, 分别与split mini Ssp DnaB intein的106个氨基酸的N端(Int-N)和48个氨基酸的C端(Int-C)融合, 构建到原核表达载体pBV220。诱导表达后SDS-PAGE分析可见预期大小的BDD-FVIII蛋白条带, Western blotting用FVIII特异性抗体证明其为剪接所产生的BDD-FVIII蛋白, 表明intein可有效连接BDD-FVIII的重链和轻链。为进一步甲型血友病基因治疗研究应用intein以双腺相关病毒载体(AAV)携带FVIII基因, 克服单个AAV载体的容量限制提供了依据。

摘要:淋巴细胞形态和机械性质的变化与人的健康、疾病的治疗和诊断有着密切关系。本研究利用原子力显微镜研究淋巴细胞和Jurkat细胞形态和机械性质。结果显示, 这3种细胞的形态较为相似, 但通过对力曲线的分析得出这2种细胞的机械性质明显不同。正常淋巴细胞粘弹力范围大致为(796.7±248.5) pN, 而Jurkat细胞分布于(158.5±37.5) pN；正常淋巴细胞的杨氏模量(0.471±0.081 kPa)近4倍于Jurkat细胞(0.0964±0.0229 kPa)；而Jurkat细胞(4.322±0.382 mN/m)的硬度近2倍于正常淋巴细胞(2.278±0.488 mN/m)。结果表明原子力显微镜能可在临床诊断上区分正常细胞与肿瘤细胞, 即使两者形态区别不明显。