摘要:为研究柔嫩艾美耳球虫热激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)的生物学特性, 应用RACE和RT-PCR技术, 从柔嫩艾美耳球虫子孢子中首次克隆获得了EtHSP的全长cDNA(GenBank Accession No. FJ911605)。EtHSP包含一个1455 bp的开放阅读框, 编码484个氨基酸, 预测表达蛋白的分子量大小为53.5 kD。应用Real-time PCR对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析, 发现该基因在子孢子阶段的表达明显高于其他阶段。同时, 构建了原核表达重组质粒pET28a(+)-EtHSP, 转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导表达后, 对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示, 重组质粒pET28a(+)-EtHSP在大肠杆菌中以包涵体形式表达, 经1 mmol/ L IPTG诱导6 h后的表达量最高, 该蛋白可被抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别, 表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。

摘要:NOBOX(新生儿卵巢同源基因)是一个卵母细胞特异性表达的同源基因, 在早期滤泡发生中起重要的作用。本研究结合电子克隆的方法, 从猪卵母细胞中成功地克隆了NOBOX基因的全长cDNA序列(GenBank Accession No. FJ587509)。猪NOBOX基因的cDNA全长为1768 bp, 包含1419 bp的开放阅读框。生物信息学分析表明NOBOX基因编码了472个氨基酸, 分子量为51.08 kD, 等电点为5.73。该蛋白定位于细胞核中, 含有一个保守的结构域——cd00086。借助Clustalw 软件, 采用N-J算法构建了NOBOX蛋白的系统进化树, 分析了不同物种间的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在母猪不同组织、细胞及4种孤雌激活胚胎的表达模式, 结果表明该基因在母猪各组织中均有不同程度的表达, 其中在心脏、肾脏和卵母细胞中表达水平较高, 推测其可能在心脏、肾脏和卵母细胞中发挥着重要的作用; NOBOX基因在胚胎发育阶段的表达水平高于G-V期的卵母细胞, 表明在胚胎发育阶段pNOBOX的表达增强。

摘要:为研究转基因乳腺上皮细胞发育的全能性, 利用电转染方法将人乳铁蛋白(hLF)乳腺特异性表达载体电转染山羊乳腺上皮细胞, 经G418和PCR筛选获得阳性克隆细胞株, 经催乳素诱导的细胞株上清液用Western blotting方法检测hLF的表达。以转基因与上清液中表达hLF均为阳性的细胞为核供体细胞, 进行山羊体细胞核移植。结果为: 16株细胞表达重组hLF, 分子质量为75 kD; 将144枚重构胚移入16只同步发情的山羊输卵管中, 在移植后的30 d、60 d和90 d的妊娠率分别为87.5%、81.3%和62.5%; 最终3只受体妊娠足月, 产下3只克隆羊, 克隆效率为2.1%, PCR-RFLP分析表明克隆羊均来自供体羊细胞, 但没有整合外源基因。结果表明, hLF转基因乳腺上皮细胞能分泌 hLF; 乳腺上皮细胞经转染、筛选和长期培养的条件下, 能保持发育的全能性。

摘要:为研究外源活性氧对木质素降解菌的影响, 本实验对外源百草枯诱导下的杂色云芝(Coriolus versicolor)产酶及其生物化学过程进行了研究。将一定浓度的百草枯加入培养7 d的杂色云芝菌培养液中, 连续培养148 h, 测定其胞外木质素降解酶、胞内抗氧化酶的活性及生物化学参数的变化。与对照相比, 30 mmol/L的百草枯能够显著促进杂色云芝锰依赖过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)和漆酶(Lac)的活性, 3种酶活性分别提高了1.3、7和2.5倍; 在连续培养的前48 h, 30 mmol/L的百草枯促进了胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性。百草枯对于胞外木质素降解酶活性的促进作用比对胞内抗氧化酶活性的促进作用明显。百草枯的加入促进了胞外酚类化合物与甲醛的浓度的增加, 而丙二醛的浓度在培养的前24 h内增加, 随后下降。结果表明, 百草枯的加入对白腐菌产生了氧化胁迫, 但菌株的抗氧化系统能够有效地进行氧化剂的清除, 从而阻止氧化剂对机体的氧化伤害。百草枯作为外源氧化胁迫剂, 可以增加木质素降解酶活性, 有利于木质素的降解。

摘要:由于甲烷氧化菌只能利用甲烷作为唯一的碳源和能源, 存在生长缓慢、细胞密度低、培养困难等问题, 限制了其工业应用。解决该问题的有效途径之一是在容易实现高密度培养的异源宿主菌中表达甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase, MMO)。本实验室前期首次在一种红球菌中成功地表达了来自于甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的pMMO(颗粒状甲烷单加氧酶), 但比酶活较原始菌低很多。本试验在该结果的基础上, 通过选用不同的启动子和宿主细胞探索表达pMMO的可能性, 结果得到了具有氧化甲烷活性的重组菌, 但是产物检测到乙醇的生成, 且该重组菌的pMMO活性不稳定, 暗示pMMO的催化特性可能发生了变化。另外, 很多重组菌检测到pMMO蛋白的表达, 但没有催化活性, 说明pMMO在宿主细胞中的正确组装是其功能表达的关键。

摘要:通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因, 双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy, 线性化后电转化毕赤酵母GS115, 经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达, SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD, 培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶, 在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶, 为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。

摘要:哺乳动物卵透明带3(Zona pellucida 3, ZP3) 在诱导获能精子发生顶体反应中发挥着重要作用, 其在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达。本研究在大肠杆菌中诱导表达可溶性的mZP3融合蛋白, 并鉴定该蛋白的免疫活性。 将小鼠卵透明带3克隆至pMAL-p2x质粒, 转化至大肠杆菌BL21表达菌中。用不同温度、不同IPTG浓度、不同诱导时间及不同浓度的添加剂诱导目的蛋白表达, 以筛选出mZP3融合蛋白可溶性表达的最佳条件。大量表达纯化后以Western blotting和ELISA检测蛋白的免疫活性。酶切鉴定及DNA测序表明mZP3已克隆入pMAL-p2x质粒。经优化诱导表达条件, 筛选出mZP3融合蛋白可溶性表达的最佳条件为: 当A600为0.6时添加0.02 mol/L葡萄糖, 以0.6 mmol/L IPTG于25oC条件下诱导表达4 h。ELISA及Western blotting检测结果表明诱导表达的蛋白具有免疫活性。在大肠杆菌中表达并纯化获得可溶性mZP3蛋白, 为mZP3免疫不育疫苗研制及其免疫效果检测提供了可溶性抗原。

摘要:针对调控铜绿假单胞菌致病基因表达的群体感应系统, 将相关基因lasI和rhlA的启动子域与蔗糖致死基因相融合, 构建出一个能通过菌体生长量来检测群体感应系统小分子抑制物的筛选体系。并在特定条件下, 对一系列中药提取物进行筛选, 同时用荧光筛选系统对结果进行验证。以此筛选出3种中药提取物对铜绿假单胞菌群体感应系统有不同程度的抑制作用。这3种中药分别隶属于爵床科、败酱科和萝藦科植物。本研究所构建的筛选体系能有效地筛选群体感应系统的抑制物, 为进一步了解和控制细菌的致病感染过程和新药物的研究提供了一个有用的工具。

摘要:为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)凝集因子A(ClfA)免疫原性及免疫保护作用, 应用PCR方法扩增出金黄色葡萄球菌 Newman、Wood46和HLJ23-1株的clfa基因并进行序列分析, 再将Newman株的clfa基因插入到pQE-30载体上, 导入宿主菌Escherichia coli M15 (pREP4)并诱导表达和纯化ClfA重组蛋白。用纯化的ClfA免疫小鼠, 检测血清中抗体和细胞因子水平, 首次免疫后35 d时用金黄色葡萄球菌 Wood46、HLJ23-1、Newman株对小鼠攻毒。结果发现: clfa基因序列高度保守; ClfA重组蛋白在E. coli M15中获得表达; 在首次免疫后35 d时血清抗体效价和细胞因子浓度与对照组相比, 均显著升高(P < 0.05); 攻毒结果为蛋白免疫组小鼠获得一定的免疫保护。由此表明, ClfA重组蛋白有较好的免疫原性和免疫保护力。

摘要:以重组TpNs为抗原的ELISAs已被证明是具有较高敏感性和特异性的梅毒血清学检测方法, 若在ELISAs使用多种TpNs抗原, 可进一步提高检测敏感性和特异性。根据抗原表位分析结果, 本研究首先采用连接引物PCR获得了TpN17和TpN47抗原表位序列融合成的人工基因片段tpE17-47, 然后构建了全长tpN17、tpN47基因以及tpE17-47融合基因的原核表达系统。SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查结果显示, 所构建的原核表达系统能稳定表达目的重组蛋白rTpN17、rTpN47和rTpE17-47, 其产量分别约占细菌总蛋白的36%、20%和28%。采用Ni-NTA亲和层析法提纯的rTpN17、rTpN47和rTpE17-47蛋白经SDS-PAGE分析, 均显示为单一的蛋白条带。Western blotting结果表明, rTpN17、rTpN47和rTpE17-47蛋白均可被梅毒抗体阳性的病人血清所识别。以rTpE17-47为包被抗原的rTpE17-47-ELISA检测630例临床确诊梅毒患者血清标本的阳性率为98.6%, 仅略高于TPPA(97.9%)(P>0.05), 但明显高于rTpN17-ELISA(83.8%)、rTpN47-ELISA(83.3%)和RPR(72.1%)(P<0.01)。上述ELISAs和TPPA对25例SLE、36例RA患者和250例健康体检者的血清标本检测结果均为阴性, 但RPR分别有1、2和2例标本检测结果为阳性。本试验成功地构建了rTpE17-47抗原表位融合基因及其高效原核表达系统, 所建立的rTpE17-47-ELISA可作为一种快速、简便、安全、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。

摘要:本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库, 以可溶性Ab1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Ab1-42寡聚体的特异性单链抗体。利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因, 经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段, 将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体, 电转化TG1感受态菌, 获得库容为2.5×109单链抗体库。经辅助噬菌体M13K07拯救, 以可溶性Ab1-42寡聚体为抗原, 对抗体库进行4轮筛选, ELISA法筛选特异性识别Ab1-42寡聚体的阳性克隆, 将筛选到的阳性克隆B19转化至E. coli HB2151菌, 诱导表达可溶性scFv抗体。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达, 且能够与Ab1-42三聚体及纤维特异性结合, 亲和力(Kd)为9×10−6 mol/L。Ab1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆症(AD)的治疗研究奠定了基础。

摘要:本研究旨在建立可用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型。利用脂质体将荧光素酶表达载体pGL4.17(luc2/neo)转染至人非小细胞肺癌细胞株A549, 经G418筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆。根据体外生物发光情况及细胞的生长特性, 从中挑选合适克隆, 进行裸鼠皮下接种, SCID鼠尾静脉接种, 建立肺癌移植瘤模型。利用活体成像系统监测肿瘤的生长转移情况, 并用切片HE染色进一步验证小鼠模型移植瘤的原位成瘤和转移能力。实验结果表明: 本研究成功地构建了可用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型, 模型稳定可靠、直观、灵敏, 为肿瘤生长转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供了重要工具。

摘要:脂联素是一种重要的脂肪细胞因子, 而球状脂联素(脂联素的球状结构域, gapM1)有望开发为一种新药, 用来治疗Ⅱ型糖尿病。本研究分别通过摇瓶和发酵罐培养, 用毕赤酵母工程菌进行重组人gapM1的表达, 并用凝胶过滤和阴离子交换进行蛋白的纯化。然后, 用高脂饲料和低剂量STZ (链脲佐菌素)相结合的方法建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,鉴定gapM1的生物学活性。SDS-PAGE结果表明gapM1在毕赤酵母中得到了高效表达, Western blotting结果显示表达的蛋白为gapM1, 并从10 L发酵上清中纯化得到200 mg纯度为96%的gapM1。而制备的重组人gapM1能显著降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖(34.2%)、血甘油三酯(79.6%)和血总胆固醇(62.1%)水平。因此, 重组人gapM1在毕赤酵母中得到了成功表达, 并且通过动物模型证明其有很好的降血糖和降血脂活性。

摘要:从香茶菜属植物细锥香茶菜中分离得到的二萜类化合物Rabdocoetsin B(Rabd-B), 研究其对人类t(8;21)白血病细胞凋亡的诱导作用及其对蛋白酶体19S泛素识别亚基S6’(Rpt5)的抑制作用, 为Rabd-B应用于t(8;21)白血病治疗提供实验依据。以不同浓度的Rabd-B处理t(8;21)白血病Kasumi-1细胞, 应用CCK-8法检测细胞活力, 用Bliss法计算IC50值, 通过流式细胞术检测细胞凋亡情况, 并以稳定表达pGC-E1-ZU1-GFP的A549细胞作为蛋白酶体抑制剂筛选模型, 荧光显微镜成像拍照GFP荧光。Western blotting检测不同浓度的Rabd-B处理Kasumi-1, 检测Casp-3、S6’(Rpt5)、PARP、ubiqutin在该细胞内的表达变化。结果显示, Rabd-B明显抑制t(8;21)阳性的Kasumi-1细胞生长, 48 h的IC50值为1.27 mmol/L; 同时诱导Kasumi-1细胞凋亡效果显著; 荧光显微镜观察药物处理和未处理的pGC-E1-ZU1-GFP的A549细胞Ub-GFP表达, 结果显示GFP平均荧光值随药物浓度增高而增强; Rabd-B处理Kasumi-1细胞24、48 h后蛋白质免疫印迹技术检测Casp-3、PARP, 发现Casp-3激活, 其底物PARP发生切割产生85 kD的降解带; 2.5、5.0 mmol/L Rabd-B处理Kasumi-1细胞24、48 h后Western blotting检测蛋白酶酶体组分, 发现19S调节亚基S6’(Rpt5)降解, 细胞内泛素化水平增高。以上结果说明, Rabd-B一方面通过激活Caspase级联反应, 另一方面抑制蛋白酶体19S泛素识别亚基, 导致细胞内泛素化积累, 进而抑制t(8; 21)白血病细胞生长并诱导其凋亡。

摘要:为了提高血管支架的力学性能, 将生物相容性良好的新型生物材料类人胶原蛋白(基因工程技术、高密度发酵生产)与丝素蛋白以质量比9:1、7:3、5:5复合, 采用真空冷冻方法制备管状血管支架。研究了不同配比血管支架材料的表面结构、表面元素组成、力学性能、降解和生物相容性。结果表明：当类人胶原蛋白与丝素蛋白的质量比为7:3混合时, 类人胶原蛋白-丝素蛋白管状支架具有均匀的多孔结构, 孔径为(60±5) μm, 孔隙率达到85%以上; 获得了较理想的力学性能：应变为50%±5%, 应力为(332±16) kPa; 具有相对慢的降解速率; 提高了细胞的黏附与增殖, 具有良好的生物相容性。

摘要:细胞表面构图技术对于研究细胞以及细胞间相互作用具有重要意义。近年来随着微加工技术与表面修饰技术的发展, 出现了多种细胞表面构图方法。本研究介绍一种基于微流控芯片和电化学自组装单层修饰的多细胞表面构图方法。该方法通过软光刻技术加工具有2种细胞拦截坝结构阵列的微流控通道来实现2种细胞在芯片表面准确定位; 通过表面修饰具有阻碍细胞贴壁特性自组装单层来实现对细胞生长区域的限制; 最终实现2种不同细胞近距离表面构图。该方法的优点在于, 可以使多种细胞根据需要进行准确的表面构图, 细胞区域之间没有物理隔离共享培养微环境, 允许不同种细胞通过细胞分泌因子进行相互作用, 基底透明表面开放可以使用多种观测手段。该方法可以用于不同种细胞间相互作用的研究。

摘要:本研究旨在利用Real-time RT-PCR对外源基因在工程乳酸菌中的表达进行定量分析, 建立一种新的Real-time RT-PCR分析方法。采用玻璃珠热酚法提取工程乳酸菌总RNA, 对外源目的基因的反转录(含有cDNA和DNA)样品和非反转录(仅含DNA)样品进行Real-time PCR检测, 根据经典绝对定量方法并结合DNA 扣除法进行分析, 将得到的Ct值通过标准曲线换算为样品拷贝数, 通过从反转录样品中扣除DNA样品的拷贝数的量, 去除了DNA对实验结果的影响, 得出最终的定量结果。采用以上方法分析工程乳酸乳球菌NZ9000中外源纤维素酶基因CBHⅡ的表达情况, 对表达量较低的目的基因进行转录水平的分析, 避免了RNA的损失, 得到了外源基因表达的量为(1.28±0.02)×10-1 copies/cfu。这种基于DNA扣除法的Real-time RT-PCR绝对定量方法可以有效地对外源基因在工程乳酸菌中的表达进行分析。

摘要:本研究采用猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)定点突变外壳蛋白(EDDIE)为融合蛋白, 对抗菌肽Cecropin AD (CAD)基因进行了高效融合表达, 获得了有抗菌活性的抗菌肽CAD。首先采用重叠PCR基因合成技术将编码抗菌肽的CAD基因与猪瘟病毒定点突变外壳蛋白EDDIE编码基因合成为e-cad融合基因, 接着将融合基因e-cad采用定点同源重组的方法连接到载体pET30a上, 构建成pETED表达载体, 然后转化大肠杆菌BL21(DE3)表达, 表达的融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在, 表达量占菌体总蛋白的40%以上。蛋白质在体外复性, 融合蛋白中EDDIE自我剪切, 产生抗菌肽CAD。抑菌试验表明抗菌肽CAD能有效地抑制大肠杆菌和藤黄八叠球菌的生长, 并且对酵母菌的生长也有微弱地抑制作用。以EDDIE为融合蛋白是在大肠杆菌中高效表达抗菌肽的一种好方法。

摘要:本研究将还原型谷胱甘肽(GSH)共价结合在异硫氰酸根末端磁性微粒表面, 制备了具有超顺磁性的谷胱甘肽-磁性微粒亲和介质, 以表面修饰有谷胱甘肽的磁性微粒为载体, 建立了谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白的纯化体系。对100 mL细胞裂解液纯化体系所需磁性微粒用量、谷胱甘肽-磁性微粒与细胞裂解液的孵育时间、清洗条件等进行了优化。以聚丙烯酰胺凝胶电泳对融合蛋白的纯度进行了检测, Bradford方法对融合蛋白进行了定量测定, 对纯化得到的目的蛋白进行了Western blotting分析。结果表明, 每毫克异硫氰酸根末端磁性微粒对GSH的固定化容量为150 mg, 10 mg谷胱甘肽-磁性微粒可满足100 mL细胞裂解体系中目的蛋白的纯化, 最佳孵育时间为40 min, 对GST融合蛋白的平均纯化量为516 mg。本方法快速、简便, 基于磁性微粒的分离还可实现自动化, 对GST融合蛋白的纯化具有很好的应用前景。

摘要:酵母Elp3(Yeast elongation protein 3, yElp3)是组蛋白乙酰转移酶复合物Elongator的催化亚基, 通过组蛋白乙酰化参与基因转录延伸。近来证实胞质中也存在的Elp3还参与胞外分泌、tRNA修饰等重要生物学过程。为深入研究Elp3的复杂功能, PCR法克隆pYES2-yElp3质粒中编码yElp3N末端亲水区段(22~94aa), 构建原核表达载体pMXB10-yElp3- 219, 经IPTG诱导表达和几丁质柱纯化后免疫兔制备多克隆抗体。ELISA检测显示该抗体有较高的效价(不低于1:2500), 免疫印迹结果表明该抗体可特异性识别表达纯化及酵母细胞中的Elp3蛋白, 运用该抗体进行的染色质免疫沉淀揭示转入elp3?菌株的酵母/人融合的yhElp3之所以可补偿突变株的基因表达延迟缺陷, 是因其直接参与SSA3基因的转录延伸。

摘要:噬菌体裂解酶是噬菌体产生的细胞壁水解酶, 通过水解宿主菌细胞壁使子代噬菌体释放, 在体外能高效且特异性地杀死细菌。本研究旨在克隆和表达链球菌噬菌体裂解酶PlyC, 并测定其生物学活性。利用PCR方法扩增PlyC的2条肽链PlyCA和PlyCB, 构建表达载体pET-32a(+)-PlyCA和pET-32a(+)-PlyCB, 分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中, 以0.7 mmol/L IPTG在30oC诱导7 h实现了高效表达, SDS-PAGE分析表明PlyCA和PlyCB表达量均可达菌体总蛋白的30%以上。采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化目的蛋白, 其纯度大于95%。用透析复性方法得到目的产物重组链球菌噬菌体裂解酶PlyC, 以浊度法和平板计数法检测其体外抗菌效果, 扫描电子显微镜观察裂解酶作用前后细菌细胞形态变化。结果表明重组PlyC能特异性裂解化脓性链球菌(A组b-溶血性链球菌), 以4 mg/mL浓度作用于OD600为0.56的菌液60 min后杀菌率达99.6%, 扫描电镜观察结果显示该酶作用于菌体后, 链球菌细胞裂解, 呈碎片状态。本研究为开发一种新型、高效的链球菌感染疾病治疗药物打下了基础。