摘要:干细胞极强的自我更新能力和多向分化潜能使其可以成为绝佳的种子细胞来源，用于各种疑难疾病的治疗。微胶囊不仅可以为细胞提供三维生长微环境，而且具有良好的免疫隔离性能和生物相容性。微囊化干细胞技术为干细胞大规模、高活性体外培养及长期保存提供了新的技术支持，为细胞移植疗法开辟了新途径。以下首先简述了微囊化技术的发展情况，然后介绍了目前用于微囊化干细胞的材料、制备方法及其免疫隔离作用，重点阐述了近年来微囊化各种不同类型干细胞的研究和应用进展。最后，提出目前微胶囊化干细胞的问题所在并对此技术进行展望。

摘要:家畜胚胎干细胞具有重要的生物学意义和广阔的应用前景。以下对比了小鼠、人胚胎干细胞多能性调控信号通路的异同，阐述了小鼠、人胚胎干细胞与家畜胚胎干细胞在多能性分子标志上的差异，并结合本实验室开展绵羊胚胎干细胞研究的实际经验，对目前家畜胚胎干细胞建系中可能存在的多能性候选信号通路及分子标志进行了探讨。

摘要:间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 具有多向分化潜能、免疫抑制能力、来源充足、可避免伦理学争议等优点，使其有望成为种子细胞，应用于临床干细胞移植治疗多种难治性疾病。目前通过生物反应器等方法已能实现MSCs的大规模体外扩增，使体外获取足量移植用MSCs成为可能，但扩增MSCs应用于临床移植前还存在着一个急需解决的问题，即MSCs扩增后的安全性和移植有效性评价，目前国内外对这方面研究尚不系统，未建立起有效评价体系，经检索还未发现有就扩增MSCs有效性和安全性的总结性资料。在全面检索相关文献基础上，就MSCs扩增后临床应用有效性、移植安全性两大方面的研究进展作一综述，希望对今后扩增MSCs临床移植提供参考。

摘要:角膜缘干细胞是角膜上皮更新与修复的来源，角膜上皮受损严重常会导致角膜盲。尽管近几年通过角膜缘干细胞移植术 (LSCT) 治愈角膜上皮受损的临床应用已被推广，但是对于角膜缘干细胞移植受损机体后的修复机理并不明确。为了实现角膜缘干细胞移植后的活体追踪，使用G418筛选标记有Venus荧光蛋白的角膜缘干细胞株 (GLSC-V)，并以其为种子细胞接种于去上皮羊膜上，体外培养21 d构建成荧光角膜上皮植片。荧光倒置显微镜下观察GLSC-V的细胞质和细胞核均有绿色荧光表达，在体外培养荧光至少持续3个月。免疫荧光检测GLSC-V细胞P63、Integrinβ1均呈阳性表达，对GLSC-V细胞及未转染的GLSCs进行半定量RT-PCR检测显示，两组细胞皆未表达终末分化角膜上皮细胞基因k3、k12，GLSC-V中p63及pcna较未转染组细胞略上调，venus强表达。经HE染色观察构建的人工角膜组织由5~6层上皮细胞组成，组织中上表皮细胞个数少、体积大且呈扁平状；基底部细胞密集、体积小且成立方状。经免疫荧光检测仅组织基底部最基层细胞表达P63，上表皮细胞不表达。该人工角膜与正常角膜上皮组织结构特性相似，可用于移植，为研究角膜缘干细胞修复严重受损角膜上皮机理奠定基础。

摘要:为了给组织工程提供种子细胞，对牛间充质干细胞 (Adipose-derived stem cells，ADSCs) 进行体外分离培养。首先应用胶原酶消化法分离牛ADSCs，进行体外培养、连续传代，并观察细胞的形态变化，通过细胞计数绘制生长曲线，细胞压片进行染色体分析，采用细胞免疫荧光化学方法检测细胞表面标记，利用成骨分化和成脂分化检测其分化能力。结果显示牛ADSCs体外培养时细胞形态呈成纤维细胞样，增殖稳定；Vimentin、CD49d、CD13表达呈阳性，CD34表达呈阴性；成骨诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性高，茜素红染色呈阳性；成脂诱导条件下细胞周围脂滴明显，油红-O染色呈阳性。结果证明牛ADSCs体外生长稳定、增殖速度快、定向分化能力强，简易的体外分离培养及诱导方法为其在组织工程中的应用奠定了基础。

摘要:为了研究猪β防御素2(PBD-2) 与猪γ干扰素 (PoIFNγ)，采用重叠延伸PCR法合成嵌合编码序列PBD-2-PoIFNγ，在此序列的基础上扩增PoIFNγ基因，并分别克隆入毕赤酵母表达载体pPICZaA，构建重组表达质粒pPICZaA-PBD-2-PoIFNγ与pPICZaA-PoIFNγ。经Sac I线性化，电击转化巴斯德毕赤酵母X33，筛选阳性重组子，在含0.5％甲醇的BMMY培养基中诱导72 h。SDS-PAGE及Western blotting结果表明，所获得的重组子能够分别分泌表达PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与PoIFNγ。琼脂扩散法和细胞病变抑制法未检测到融合蛋白的抑菌和抗病毒活性，而PoIFNγ具有明显的抗病毒活性。圆二色谱分析显示PoIFNγ与PBD-2-PoIFNγ的螺旋和无规则卷曲含量差别较大，推测是融合蛋白未能正确折叠影响了PBD-2-PoIFNγ的活性。

摘要:动物体细胞重编程为诱导多能干细胞 (iPS) 是目前干细胞生物学研究的热点。文中重点对山羊体细胞重编程过程中端粒酶 (TERT) 基因的相对表达量进行了检测，探讨了山羊重编程细胞的形成与端粒酶基因表达的关系。从关中奶山羊胎儿皮肤分离得到的胎儿成纤维细胞 (GEF)，其增殖能力较强，核型正常 (60条XY)，通过转录因子在体外诱导得到山羊重编程细胞。利用Real-time RT-PCR方法首先对关中奶山羊胎儿各种组织的TERT表达进行了检测，结果表明睾丸组织中TERT的表达显著高于上皮组织 (P＜0.01)，在山羊胎儿的其他组织中TERT也有不同程度的表达。对原代重编程细胞和4株不完全重编程细胞株的TERT表达检测结果发现，碱性磷酸酶 (AP) 阳性的重编程细胞端粒酶表达量要显著高于AP阴性的重编程细胞 (P＜0.01)。这一结果揭示，激活端粒酶活性并使其保持较高的表达水平对体细胞的重编程至关重要。

摘要:FoxO1 (Forkhead box O1) 是调控肌肉生长、代谢和细胞分化的重要转录因子，但其在成肌细胞分化中的作用还不甚清楚。为了研究FoxO1对哺乳动物成肌细胞分化的影响，以原代培养的长白仔猪成肌细胞作为实验材料，用2％马血清诱导分化，采用实时荧光定量PCR、Western blotting和脂质体转染等方法检测FoxO1及早期和晚期生肌调节因子MyoD和myogenin在猪成肌细胞分化过程中的表达变化。结果显示，在猪成肌细胞分化过程中，FoxO1 mRNA表达量显著增加，但总蛋白量变化不显著，其磷酸化水平显著上调。同时，高表达FoxO1的猪成肌细胞中，生肌调节因子MyoD和myogenin mRNA表达受到显著抑制，而MyoD蛋白变化不显著，myogenin却显著下调 (P＜0.05)。以上结果表明，FoxO1能够推迟猪成肌细胞的分化时间并抑制分化；同时推测，FoxO1可能通过抑制生肌调节因子的表达控制骨骼肌纤维类型的终末分化。

摘要:HBsAg作为乙肝疫苗的主要成分，是一种病毒样颗粒，由蛋白质和脂类通过非共价键作用形成。HBsAg保持完整结构对其功能非常重要，而目前未见对其在溶液中结构变化的研究。考察了不同溶剂环境 (温度、pH值、离子类型和盐浓度) 对HBsAg结构的影响。实验发现，HBsAg在常温下比较稳定，但在温度超过60℃时稳定性明显下降；pH值小于4.0时引起不可逆聚集，但在pH 5.0时的聚集部分可逆；不同离子对HBsAg的影响基本符合Hofmeister序列，不同之处是SO42?比F?更易引起HBsAg颗粒的聚集，在所考察的盐中，(NH4)2SO4对HBsAg有着较大的影响，0.4 mol/L时就会引起HBsAg聚集，随着浓度增加，聚集现象更加严重，所以在HBsAg的疏水层析中要谨慎使用 (NH4)2SO4。

摘要:探讨了由核定位信号 (NLS) 多肽介导的核因子-κB (NF-κB) 寡核苷酸诱骗子 (ODNs decoy) 进入HeLa细胞核的效率，以及对细胞核内NF-κB活性的调控作用。利用双功能交联剂 (Sulfo-SMCC) 共价交联末端氨基修饰的ODNs decoy和末端巯基修饰的NLS多肽，形成NLS多肽共价连接的ODNs decoy。依靠TransME 转染试剂的辅助转染NLS-ODNs decoy进入HeLa细胞，用荧光显微镜观察荧光标记的NLS-ODNs 在细胞内的分布。用MTT法检测HeLa细胞的活力，以凝胶迁移实验 (EMSA) 检测TNF-α诱导的HeLa细胞核抽提物中NF-κB的活性。结果表明，NLS多肽成功地连接到ODNs decoy上，NLS-ODNs可高效入核，入核率达到17.9％。转染NLS-ODNs进入HeLa细胞，对细胞活力无明显影响，而显著抑制核内NF-κB的活性。结果表明NLS多肽可提高ODNs decoy的入核效率，显著增强诱骗子对NF-κB活性的抑制效果。

摘要:为了解牙胚细胞解离重聚过程的细胞形态和分子机制，将小鼠帽状期牙胚解离细胞重聚，移植到小鼠肾囊膜下培养，组织切片，HE染色，观察再生牙齿的形态发生过程，并用原位杂交的方法进一步检测了与牙上皮发育密切相关的基因在再生牙上皮中的表达情况。结果发现，解离重聚的牙胚细胞在牙齿器官的再生过程重现了正常牙齿的形态发生过程；解离的牙上皮细胞在重聚和再生过程中保持Fgf8、Noggin和Shh等牙上皮发育基因表达。以上结果表明，即便是被解离形成分散状态的牙上皮细胞，在与牙胚间充质细胞重新聚合后，仍保持牙向分化的潜能。该结果为理解牙齿再生的机理提供新的实验数据，对利用干细胞进行牙齿再生的研究有重要的提示意义。

摘要:利用DNA同源重组方法 (基因打靶) 对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体，本研究以pBS246质粒为骨架，在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因；在两个LoxP序列外侧分别插入两组携带“8碱基”酶切位点的多克隆位点序列 (MCS-1和MCS-2) 和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk) 基因，构建成通用型基因打靶载体pGT-V1，并且在C2C12细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点：1) 在载体中引入绿色荧光标记，可以实时监控载体的转染效率，而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证；2) 在两个LoxP位点间插入绿色荧光标记，可以直观监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况，并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法，将最终去除了筛选标记的阳性细胞 (即丢失绿色荧光的细胞) 分选出来，降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响；3) 采用“8碱基”酶切位点的MCS序列，便于DNA大片段的连接和重组，极大提高了该载体的通用性。总之，该载体优化了基因打靶的技术手段，为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。

摘要:ΔfosB是fosB基因的自然截短型，稳定存在于许多组织中，在脂肪细胞和成骨细胞的形成和分化中起到重要作用。ΔFosB蛋白可能与钙在骨和乳腺中的代谢有关，并且调控钙从骨向乳腺转移的信号通路。将奶山羊的ΔfosB基因亚克隆到pET32a载体得到pET32a-ΔfosB原核表达载体，IPTG诱导其在大肠杆菌中表达，纯化融合蛋白免疫兔子制备多克隆抗体。ELISA检测显示抗体效价达1∶51 200，Western blotting 结果显示制备的抗体能特异性检测原核表达的ΔFosB蛋白以及在HEK-293细胞中表达的ΔFosB蛋白。进一步的组织差异表达检测表明ΔFosB在山羊的乳腺、骨髓、脑髓、肌肉、心脏、肝和肺组织中均有表达。

摘要:CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化 (CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因，旨在研究翻译后水平CFTR的连接，以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域 (TMD2) 前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分，与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合，分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1，构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞 (BHK)，瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接，并用膜片钳技术记录Cl?通道电流。结果显示，基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带，膜片钳记录到全细胞Cl?电流和单个Cl?通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因，为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体 (AAV) 转运CFTR基因，克服AAV的容量限制提供了依据。

摘要:谷氨酸-1-半醛氨基转移酶 (Glutamate-1-semiadhyde aminotransferase，GSAT) 是尿卟啉原Ⅲ生物合成上游途径的一个酶，尿卟啉原Ⅲ是红色荧光报告蛋白尿卟啉原Ⅲ甲基化酶 (Uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase，UPMT) 的底物。为了探明大肠杆菌共表达GSAT对UPMT荧光强度的影响，通过PCR扩增玉米upmt基因，将其插入pET Duet-1质粒中第2个顺反子中，构建的载体命名为pETU，表达UPMT的N端含有组氨酸标签；通过PCR扩增大肠杆菌编码GSAT的hemL基因，定点突变去除hemL基因中NcoⅠ序列，亚克隆至pET-51b质粒，再将获得的hemL基因插入pETU质粒的第一个顺反子中，构建pETeGU载体。表达GSAT的N端含有Strep标签。和单独表达upmt基因相比，表达2个基因后，蛋白印迹分析表明没有明显改变UPMT表达量，光谱扫描分析显示没有改变荧光物质的组成，但是增强了重组细胞的红色荧光物质三甲基咕啉的含量，该物质在354 nm有特异吸收。用2 mmol/L的GSAT抑制剂3-氨基-2,3二羟基苯甲酸处理后，表达两种酶的菌落荧光消失，表明重组GSAT可能增加内源尿卟啉原Ⅲ水平，从而增强重组UPMT催化产生的红色荧光。

摘要:对内源性的内皮生长抑制剂的序列来源分析后，用RT-PCR方法从人脐带中获得了417 bp的cDNA，并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9，然后转化毕赤酵母GS115获得重组表达菌株。表达菌株通过甲醇诱导表达后，将发酵液通过分离纯化获得重组蛋白纯品，命名为EDI-8t。体外实验结果表明，这个胶原蛋白VIII来源的rhEDI-8t蛋白能特异性地抑制牛主动脉内皮细胞的增殖和迁移，并能引起内皮细胞的凋亡。动物体内实验结果表明，rhEDI-8t蛋白样品可有效抑制裸鼠皮下肝癌肿瘤的生长，抑制效果和参照品endostatin相同。但在小鼠黑色素瘤肺转移模型中，rhEDI-8t显示了高于参照品的抑癌效果。