摘要:

摘要:植物体细胞胚胎发生是一个极其复杂而有序的过程，受到多种内、外因素的影响与调控。其中基因的表达与调控是影响体细胞胚胎发生最重要和最根本的因素。这些基因包括PLANT GROWTH ACTIVATOR系列基因、LEAFY COTYLEDON家族基因、BABY BOOM基因、SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE基因和PICKLE基因等，它们相互作用构成了一个复杂的调控网络。以下结合本实验室对PLANT GROWTH ACTIVATOR 37等基因的研究，对这一调控网络进行了介绍，并探讨了未来体细胞胚胎发生的研究方向。

摘要:为了探讨利用褐脉少花龙葵毛状根来修复重金属镉(Cd) 污染的可能性，采用溶液培养法研究了Cd单独及其与钙(Ca) 组合对褐脉少花龙葵毛状根生长、抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD) 和过氧化物酶(POD) 活性及对Cd吸收的影响。结果表明，Cd≤50 μmol/L时能促进毛状根生长，而高于100 μmol/L Cd 则抑制毛状根生长，使其侧根根尖变褐和变短，数目减少。与对照相比，不同浓度Cd培养的毛状根可溶性蛋白含量和SOD活性先升高后逐渐下降；其丙二醛(MDA) 含量显著提高；100 μmol/L Cd使毛状根POD活性逐渐升高，但300 μmol/L Cd则使毛状根POD活性逐渐降低。与对照 (仅添加100 μmol/L或300 μmol/L Cd的毛状根) 相比，Cd和10~30 mmol/L CaCl2组合培养使毛状根可溶性蛋白含量和MDA含量降低；但提高其SOD活性；而100 μmol/L Cd和10~30 mmol/L CaCl2结合培养的毛状根POD活性均比对照低；而300 μmol/L Cd和10~30 mmol/L CaCl2结合培养的毛状根POD活性则均比对照提高。原子吸收分光光度法测定结果表明，毛状根吸收和吸附的重金属Cd含量随着培养基中Cd浓度的升高而增加。但外源加入10~30 mmol/L CaCl2能减少毛状根对Cd的吸收，并调节其抗氧化酶SOD和POD活性，降低其膜脂过氧化水平而解除重金属Cd对毛状根生长的抑制或毒害。

摘要:利用对转录因子的定向进化可对多基因控制的性状进行有效的代谢工程改造。本研究对酿酒酵母负责胁迫相关基因转录的SAGA复合体成分SPT3编码基因进行易错PCR随机突变，并研究了SPT3的定向进化对酿酒酵母乙醇耐性的影响。将SPT3的易错PCR产物连接改造的pYES2.0表达载体并转化酿酒酵母Saccharomy cescerevisiae 4126，构建了突变体文库。通过筛选在高浓度乙醇中耐受性提高的突变株，获得了一株在10％(V/V)乙醇中生长较好的突变株M25。该突变株利用125 g/L的葡萄糖进行乙醇发酵时，终点乙醇产量比对照菌株提高了11.7％。由此表明，SPT3是对酿酒酵母乙醇耐性进行代谢工程改造的一个重要的转录因子。

摘要:为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2 (Alcohol dehydrogenase 2，ADH2) 基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板，通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因，连接到表达载体pTAT上，得到重组表达质粒pTAT-ADH2，将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后，在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验，检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90％的同源性，经SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白得到了有效表达，蛋白条带扫描分析表明，表达量占总蛋白的50％左右，纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验，显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确，不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。

摘要:酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum可以利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵，主要发酵产物为丁酸和乙酸，是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。将酪丁酸梭菌乙酸发酵关键基因取代为丁酸发酵关键基因来构建突变株，可使突变株丁酸发酵量增多，乙酸发酵量减少。分别获得来源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代谢关键酶基因——乙酰乙酰辅酶A转移酶基因 (thl)、来源于酪丁酸梭菌本身的乙酸代谢关键酶基因片段——磷酸转乙酰基酶基因片段 (pta) 和来源于质粒pIMP1的红霉素抗性基因 (em)。将它们与质粒pUC19相连构建为非复制性质粒pUC19-EPT。通过电转化将其导入酪丁酸梭菌中。利用红霉素抗性平板筛选获得转化子，通过PCR验证发现，获得的突变株染色体上pta被thl替换。在以葡萄糖为底物的发酵中，突变株丁酸得率为0.47，较野生型增大了34％，乙酸得率为0.05，较野生型下降了29％。

摘要:本研究主要对克雷伯杆菌甘油转化1,3-丙二醇代谢途径中的2个关键酶甘油脱氢酶 (GDH)、1,3-丙二醇氧化还原酶 (PDOR) 反应机制和动力学进行了研究。首先，通过初速度和产物抑制动力学研究确定了GDH、PDOR双底物酶促反应机制为有序BiBi机制，明确了由反应物消耗到产物生成之间的历程。其次，建立了GDH、PDOR双底物酶促反应动力学模型，由动力学模型可知，在偶合反应中，如果GDH和PDOR酶量相同，GDH氧化反应成为限速反应，而辅酶I将主要以氧化型NAD+形式存在。动力学信息为酶法合成1,3-丙二醇和代谢工程研究提供理论指导。

摘要:经硫酸二乙酯 (DES) 诱变，在含61~242 mmol/L NH4+梯度平板中，筛选到一株耐铵型突变株YZ25，该菌株在含121 mmol/L NH4+发酵培养基中，琥珀酸产量达32.68 g/L，转化率为65.4％，比出发菌提高了180.5％。进一步考察了不同形态铵盐对YZ25生长的影响，结果表明添加少量铵盐能够提高突变菌的生长速率，但当超过一定量后菌株生长受到抑制，不同铵盐对菌株的抑制程度不同，硫酸铵、碳酸氢铵、氯化铵和硝酸铵对突变株YZ25的半抑制浓度分别为：215 mmol/L、265 mmol/L、235 mmol/L、210 mmol/L。为了考察铵离子对YZ25发酵产琥珀酸的影响，在3.0 L发酵罐以氨水作为pH的调控剂发酵，结果表明在稳定期前菌株生长基本不受铵离子抑制，生物量能够达到正常水平，但是进入稳定期后铵离子抑制作用越来越明显，导致菌株生长提前结束，耗糖不完全，产酸受阻。最后结合产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes代谢途径分析了铵离子对菌株抑制作用的机理。

摘要:本研究主要探讨深黄被孢霉M2菌株对生物质全糖的利用，考察其碳源同化能力、不同碳源下产脂情况以及对玉米皮渣的利用能力。研究结果表明，M2菌株能够利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖进行生长和油脂积累。M2菌株以6％糖浓度的玉米皮渣水解液为底物发酵培养，油脂微生物生物量达18.2 g/L，干菌体油脂含量45.7％，单位体积发酵液油脂产量为8.3 g/L。

摘要:从堆积骨骼的土样中筛选出高产胶原蛋白酶的MBL13菌株，经鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。对其所产的胶原蛋白酶BCC进行分离纯化，并进行酶学性质的研究。从菌株的发酵液中纯化出分子量约为38.0 kDa BCC酶。酶反应的最适温度为40℃，最适pH为8.0。在50℃以下稳定，60℃保温1 h酶活仅保留10％；在pH 7.0~8.5活性较稳定；金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+对酶有激活作用，金属离子Cu2+对酶有显著的抑制作用。EDTA和EGTA能抑制该酶，表明BCC酶为一种金属蛋白酶。酶的底物特异性表明该酶为骨胶原蛋白酶，且对Ⅰ型骨胶原蛋白水解能力极显著高于Ⅱ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白。将纯化的BCC酶应用于骨胶原蛋白的水解可以得到不同链长的多肽，其水解能力高于标准品胶原酶Ⅰ型。本研究为工业酶提供了新的菌株和新型胶原蛋白酶，为胶原蛋白酶的开发提供了重要的理论依据。

摘要:为获得可溶性高纯度HIV-1中国株CN54 Pol P51抗原，将携带CN54 pol p51基因的重组质粒pTHioHisA51转化大肠杆菌BL21 codonplus-RIL，用IPTG进行诱导表达。用Chelating Sepharose FF-Ni亲和层析柱及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化目的蛋白，采用透析复性法得到可溶性抗原，Western blotting检测目的蛋白。用纯化的P51抗原蛋白标记辣根过氧化物酶及包被酶标板进行双抗原夹心法ELISA检测。结果显示P51以包涵体的形式表达，表达量占菌体总蛋白的50％，经两步层析和透析复性，目的蛋白纯度大于95％。Western blotting和双抗原夹心法ELISA检测均显示了良好的灵敏度和特异性。本研究可以为HIV-1疫苗研究和开发检测试剂提供支持。

摘要:本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD，且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达，并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先，用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段，与脂联素球部基因片段融合，克隆至pAAV2neo表达载体中，构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后，用pAAV2neo-sTNFRII-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD；然后，将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液，细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式；最后，收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD无血清悬浮培养24 h后的培养上清，进行sTNFRII-gAD融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示，所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD质粒结构正确，sTNFRII-gAD序列与预期一致；分别用抗人肿瘤坏死因子受体II和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞，免疫荧光呈现阳性；免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRII-gAD融合蛋白的表达，并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明，sTNFRII-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。因此，本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。

摘要:人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白在治疗风湿性、类风湿性关节炎方面拥有广阔的市场前景和巨大的经济价值。本实验以表达TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO细胞为研究对象，结合细胞生长代谢特性和动力学参数分析，以葡萄糖为关键控制参数，通过测定培养上清的葡萄糖浓度对培养过程中的葡萄糖消耗进行及时的预测，调整流加速率，形成了以满足细胞生长代谢需要为基本原则的动态流加培养过程设计模型。在此控制模型指导下，建立了高效的流加培养过程。使最大活细胞密度和最大融合蛋白浓度分别达9.4×106 cells/mL和207 mg/L，较批次培养分别提高了3.4倍和3倍。本研究所采用的研究方法和控制策略为优化GS-CHO细胞培养过程和TNFR-Fc融合蛋白成功迈向产业化奠定了基础。

摘要:本实验所用的中国红豆杉细胞悬浮培养体系中，云南紫杉烷c (Tc) 是主要的次生代谢产物，该化合物有类神经生长因子活性，提高其产量是进一步规模化生产的前提。本研究考察了原位吸附和茉莉酸甲酯 (MJA) 联合调控提高Tc产量的可能性。在培养的第7天加入浓度为100 μmol/L的MJA虽然会使细胞的生物量下降10％~30％，但是单位细胞内Tc含量和Tc产量均有显著提高，分别是对照的3.6和3.3倍。吸附剂XAD-7在不同时间加入对Tc 的合成影响显著。在培养的第7天同时加入100 μmol/L的MJA和100 g/L的XAD-7会使细胞生物量增加，Tc产量显著提高。培养到第21天，Tc产量达477.37 mg/L，为对照的6.3倍，为只加MJA的1.9倍，其中94％的Tc被树脂吸附。实验结果表明，在MJA诱导高表达的过程中，吸附剂XAD-7的加入使细胞内代谢产物外泌，浓度降低，减轻产物反馈抑制现象，从而大幅度提高代谢物产量，有较好的生产前景。

摘要:为了制备用于在斑马鱼心脏中特异表达目的基因的转基因载体，通过分子克隆的方法对能够在斑马鱼心脏中特异表达EGFP报告基因的Tol2载体进行了改造，在原有的CMLC2启动子与EGFP编码区之间插入带有多克隆位点的IRES序列，获得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体，该载体可以实现在同一个启动子CMLC2的驱动下分别同时表达目的基因和EGFP；为了验证该表达载体的有效性，进一步在CMLC2启动子与IRES序列之间插入DsRed-Monome编码区，利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析，结果表明外源目的基因DsRed-Monome和报告基因EGFP均能以相同的表达模式在斑马鱼心脏组织中特异表达。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立心脏发育候选基因的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义。

摘要:原生动物纤毛虫是一类单细胞真核生物，其蛋白质合成终止过程中密码子使用的特殊性使其成为研究蛋白质合成终止机制的一个经典模型。为了能够有效地分析生物大分子在该细胞中的功能作用位点，本研究根据该生物染色体结构的特征，构建了含有红色荧光蛋白的大核人工染色体EoMAC_R，并与之前构建的含绿色荧光的大核染色体EoMAC_G一起，对蛋白质合成终止有关的3个重要因子核糖体大亚基蛋白L11、多肽链释放因子eRF1和eRF3在八肋游仆虫细胞中进行了荧光共定位分析。结果显示，在八肋游仆虫细胞中，蛋白质翻译过程主要位于“C”形大核内侧区域。构建的人工染色体能够作为一种有效的工具，对目的蛋白质在八肋游仆虫细胞中进行定位分析。

摘要:本研究旨在得到重组的血管性血友病因子裂解蛋白酶 (ADAMTS13)，进一步研究其在血栓止血中的作用。利用脂质体将编码ADAMTS13全长序列的重组质粒pSecTag-ADAMTS13转染Hela细胞，用潮霉素 (Hygromycin-B) 筛选得到阳性克隆细胞株，并扩大培养，收集上清。利用Ni-NTA琼脂糖柱、梯度咪唑淋洗法纯化蛋白，SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化产品纯度和免疫学活性，采用GST-His双抗夹心法测定蛋白剪切活性。结果显示，成功获得一株能恒定分泌重组ADAMTS13蛋白的细胞株ADAMTS2-4，每1 L培养上清可纯化得到5.8 mg重组蛋白。Western blotting结果显示，ADAMTS13多抗能与重组蛋白在190 kDa处显单一条带，并且蛋白具有6.4 U/mL的剪切活性 (每毫升正常人混合血浆中ADAMTS13活性为1 U)。重组蛋白具有较好的免疫原活性和酶活性，为进一步研究ADAMTS13作用机理和运用奠定了良好的基础。

摘要:为了研究kallistatin (Kal) 的生物活性，本实验构建了可分泌表达Kal的毕赤酵母菌株。首先通过PCR方法从pAAV-Kal中扩增出Kal cDNA，并克隆至酵母表达载体pPIC9，得到甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9-Kal，然后将载体线性化并电击转化毕赤酵母GS115 (his4)，通过MD平板筛选出阳性表达菌株。阳性表达菌株在BMMY培养基 (pH 7.0) 中29℃培养，经2％甲醇诱导表达96 h，摇瓶表达量可达14 mg/L。表达上清经Phenyl Superose、Heparin Sepharose FF分离纯化，目的蛋白纯度达到98％，分子量为58 kDa。生物活性实验显示，所得到的Kal蛋白具有较好的抗氧化活性，过氧化物酶活性达到 (163±4) U/(mg?min)，可有效降低H2O2对LX-2细胞的氧化损伤。另外，重组产生的Kal还能抑制HUVEC细胞的增殖。本研究首次成功地利用毕赤酵母表达系统分泌表达了有生物活性的Kal，为继续开展其抗肿瘤活性奠定了基础。

摘要:为大量获取低成本的TEM-116超广谱β-内酰胺酶，并分析其降解环境中β-内酰胺类抗生素残留物的可行性，本研究在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达了重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶，经亲和层析纯化、柱复性与分子筛层析纯化，得到了高纯度的目的蛋白，对其理化性质进行了分析。结果表明，重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶的分子量、比活性分别为30 kDa和476 IU/mg，与天然酶性质相近。重组酶在体内外对多种青霉素、头孢菌素类药物均具有较高降解效率：10 IU 酶可清除1 L发酵液中7000 mg的青霉素G；320 IU酶可清除1 L尿液中各200 mg的青霉素G、氨苄青霉素和头孢唑林混合抗生素；1.0~2.5 IU的酶可在4℃~37℃温度范围内清除1 L牛奶中80 U的青霉素G；2.0×104~2.3×104 IU/(kg?bw)的酶能够清除小鼠体内8.0×104 ~9.1×104 μg/(kg?bw)的青霉素G。

摘要:芽胞衣壳蛋白CotB、CotC、CotG等可作为芽胞表面展示外源蛋白的分子载体，制备口服重组疫苗或具有催化活性的重组酶。CotX为枯草芽胞杆菌Bacillus subilis芽胞衣壳中的另一种结构蛋白。为证明CotX能否作为分子载体将外源蛋白展示在芽胞表面，本研究将cotX基因与绿色荧光蛋白基因gfp的编码序列进行基因重组，构建融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒，将该质粒转化枯草芽胞杆菌，筛选重组菌株并诱导产生芽胞，观察到重组芽胞表面具有GFP绿色荧光。结果表明枯草芽胞杆菌的芽胞衣壳蛋白CotX位于芽胞衣壳外层，可作为芽胞表面展示外源蛋白的载体分子。

摘要:磁性细菌胞内可以产生磁性颗粒，因此具有趋磁性，基于这种特性，利用磁分离的原理，本研究开发了一种磁性细菌分离仪，提供了一种分离磁性细菌的新方法。以氧化亚铁硫杆菌为例，使用磁性细菌分离仪进行分离，可以得到强磁菌和弱磁菌。利用透射电镜观察，强磁菌胞内磁性颗粒明显多于弱磁菌；半固体平板磁泳实验也表明强磁菌趋磁性明显强于弱磁菌。各项实验结果表明磁性细菌分离仪可以有效地分离磁性细菌，这是一种分离磁性细菌的新方法，将促进磁性细菌分离培养的研究。