摘要:自1990年DNA疫苗问世以来，已有许多研究者构建了不同类型的DNA疫苗。这些载体能诱发机体产生不同程度的特异性体液免疫和 (或) 细胞免疫。研究者们也在猪瘟DNA疫苗研究方面做出了很多努力并取得了一定的成果。以下从猪瘟DNA疫苗的构建和评价、佐剂在猪瘟DNA疫苗中的应用、猪瘟DNA疫苗与其他疫苗的联合应用以及目前猪瘟DNA疫苗存在的问题和解决途径等方面做了比较全面的阐述。

摘要:木聚糖酶含有催化活性结构域，有时还含有非催化活性结构域，促进酶与底物结合，特别是与不溶性底物的结合及降解，称为碳水化合物结合结构域 (CBM)，它们在木聚糖降解过程中有重要作用。以下从CBM来源，所属家族类型、对不溶性底物结合特性、与底物结合的特定氨基酸、与催化结构域间的连接肽、特别是对影响木聚糖酶稳定性的5个方面进行了综述，说明CBM对木聚糖酶性质有很大影响。自然界中碳水化合物结构复杂、难以降解，所以认识CBM相关性质对研究其与木聚糖酶的协同作用、提高木聚糖酶活性有重要意义，并根据CBM属性用于改造木聚糖酶相关性质进行了展望。

摘要:利用正负筛选策略 (Positive-negative selection，PNS) 对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。将动物的朊蛋白基因prnp敲除，使其不能表达朊蛋白 (传染性海绵状脑病的致病蛋白)，从而使其具有抵抗Prion 病感染的能力。本研究采用正负筛选策略，构建了牛prnp 基因的双等位基因敲除载体，经内切酶Sac II线性化后，再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞，分别用600 μg/mL G418、200 nmol/mL Ganciclovir (GCV) 进行正负药物筛选，最终获得了176个药物抗性细胞克隆，进一步采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对细胞克隆进行鉴定，结果表明，其中的9个细胞克隆为中靶细胞，证明牛prnp基因被成功敲除。本研究为牛prnp 的敲除提供了可行性依据，并为体细胞核移植生产敲除朊蛋白基因的转基因动物提供供体细胞。

摘要:猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度接触传染疾病，严重阻碍着全球养猪业的发展，疫苗接种是控制该病的有效措施。为提高胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗的免疫效力，以及探索胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗作为呼吸系统病原疫苗载体的可行性，通过穿梭质粒pJFF224-XN将完整的apxIA基因导入apxIIC基因缺失突变株HB04C-中，构建了含有apxIA和apxIIA基因的弱毒疫苗菌株HB04C2 (apxIIC-/apxIIA+/apxIA+)。通过对HB04C2的生物学特性分析发现，穿梭质粒可稳定传代，并表达ApxIA，其生长特性未受穿梭质粒的影响。将HB04C2以气管接种方式免疫仔猪，可产生针对ApxIA和ApxIIA的抗体。二免后2周以高致病性的血清1型胸膜肺炎放线杆菌攻毒，该弱毒疫苗可提供良好的免疫保护效果。

摘要:本研究应用套式RT-PCR方法扩增出牛病毒性腹泻病毒VEDEVAC株编码NS3蛋白的基因，克隆至表达载体pET-30a(+)，并进行测序。对瘟病毒属病毒NS3基因进行氨基酸差异性分析，显示平均P-distance为0.07，系统进化树分析表明VEDEVAC株隶属于BVDV 1型。将构建成功的重组质粒转化大肠埃希氏菌Rosetta(DE3)，在IPTG诱导下表达NS3重组蛋白，经Ni-NTA亲和层析纯化和尿素梯度透析后进行反应原性鉴定。Western blotting结果显示表达的重组蛋白可以与牛病毒性腹泻病毒阳性血清反应，并与猪瘟阳性血清有交叉反应，ELISA结果显示该重组蛋白具有良好的反应原性。所获得的蛋白为建立针对NS3抗体的ELISA检测方法奠定了基础。

摘要:本研究克隆和表达了日本血吸虫Cyclophilin B (Sj CyPB) 编码基因的cDNA，分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况，评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。本研究以日本血吸虫童虫cDNA为模板，RT-PCR扩增其基因全长cDNA，提交序列到NCBI，登录号为GQ403665。荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况，构建重组表达质粒，表达纯化重组蛋白。利用Western blotting检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠，评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。结果表明，RT-PCR获得了Sj CyPB编码基因的全长cDNA，其开放阅读框为672 bp。经分析确定其为CyPs家族中的CyPB基因，命名为Sj CyPB。荧光实时定量PCR分析表明，该基因在18 d童虫期表达量最高，32 d次之。构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-SjCyPB，并在大肠杆菌中成功表达，表达产物分子量为49.5 kDa。Western blotting试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性，在小鼠免疫试验中，与空白对照组比较，免疫组小鼠获得31.5％的减虫率和41.01％的肝脏减卵率。本研究获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPB基因的全长cDNA，成功构建了Sj CyPB原核重组表达质粒，并在大肠杆菌中成功表达，证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。

摘要:超氧化物歧化酶(SOD)是一种在生物界广泛存在的抗氧化酶，在抗衰老、抗肿瘤、抗免疫疾病和电磁辐射上都起着重要的作用。本实验利用含有细胞质转导肽 (CTP，一种能够携带外源大分子穿过细胞膜，定位于细胞质的短肽) 基因序列的特异引物，以人总RNA反转录产物为模板，扩增出了CTP和人铜锌超氧化物歧化酶 (Cu/Zn SOD) 的融合基因。运用毕赤酵母表达系统成功表达了具有活性的CTP-SOD融合蛋白。CTP-SOD预处理HeLa细胞后，明显提高了邻苯三酚 (Progallol) 诱导氧化胁迫下HeLa细胞的存活率，和对照组野生型SOD相比具有显著性差异。结果表明，CTP-SOD融合蛋白比野生型SOD更容易进入细胞，具有更高效的抗氧化功能。

摘要:通过对超高底物浓度生料发酵中温度的影响研究发现，采用温度梯度的方法可大幅提高酵母的生产效率。以高粱为例，采用35％绝对干物浓度，在新型生料水解酶的配合下，通过合适的逐级降温培养方式，使用普通酒精干酵母，在90 h内发酵醪液酒精浓度可达20％ (V/V) 以上。

摘要:对一株从土壤中分离到的芽胞杆菌Bacillus sp. BSD-8菌株所产生的热稳定性较高的肌氨酸氧化酶进行纯化，并对该酶的特性进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱、Toyopearl疏水层析柱和Sephadex G-75分子筛层析，使酶提纯25倍，比活力达到5.3 U/mg。研究了纯化后的酶的生化特性，确定了该酶的主要特性：该酶为黄素蛋白，与黄素以非共价键的方式结合，由单一亚基组成，其亚基分子量为51 kDa。酶的最适反应温度及pH分别为60℃与8.5。该酶在60℃及pH 8.0~10.0条件下稳定。以Lineveaver-Burk作图法求得该酶米氏常数Km值为3.1 mmol/L。Ag+、Hg2+、SDS及 Tween 80对该酶有强抑制作用，而Tween 20和Triton X-100对酶活性无影响。该肌氨酸氧化酶在耐热性质上比以前所报道的肌氨酸氧化酶有很大的提高，在酶法肌酐测定应用中有明显的优势。

摘要:锰过氧化物酶是真菌分泌的一种糖基化的含有血红素辅基的胞外蛋白, 在染料降解和脱色过程中起着重要作用。本实验利用本实验室保存的的白腐真菌裂褶菌Schizophyllum sp. F17产锰过氧化物酶（MnP），研究MnP的酶学性质，并对酶活条件进行优化。实验通过超滤浓缩、DEAE-纤维素、DE52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤等步骤，分离纯化得到电泳纯的锰过氧化物酶。该酶蛋白含量为23 μg/mL，分子量大小为49.2 kDa，在0.1 mmol/L H2O2中半衰期为5~6 min。Mn2+、H2O2以及酶的用量可以影响MnP酶促反应的效率，在单因子分析法的基础上，通过全因子中心组合设计响应面分析表明：H2O2以及H2O2与酶用量之间的交互作用对酶促反应的作用是最显著的。在优化条件下，酶对偶氮染料金橙G、刚果红显示出较强的脱色能力。

摘要:拮抗链霉菌S24对黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉等粮食和饲料中常见的曲霉菌具有广谱抗性，本试验通过牛津杯法测定抗菌物质的效价，研究了大孔吸附树脂对链霉菌S24产生的抗菌物质的吸附、解吸性能，筛选了解吸剂，并研究了抗菌物质的部分理化性质。结果表明，大孔吸附树脂AB-8对抗菌物质的吸附及解吸性能最好，其饱和吸附量为7.0822×104 μg/g，最佳解吸剂为85％丙酮，以85％丙酮进行动态解吸，解吸率达93.82％。该抗菌物质对热稳定，对紫外线敏感，对有机溶剂不敏感，对酸敏感，对碱稳定，紫外全波长扫描发现该抗菌物质为多烯大环内酯类抗生素。

摘要:表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor , EGFR)及其配体在多种肿瘤细胞中高表达，免疫注射表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)-载体蛋白所产生的抗体能够干扰EGFR与EGF的相互作用，进而抑制肿瘤生长。本实验室设计了EGF和TGFα的嵌合配体E5T，并将具有免疫增强作用的葡萄球菌肠毒素A (Staphylococcal enterotoxin A，SEA) 与之融合。融合蛋白在大肠杆菌内表达后，通过金属螯合亲和层析，得到了纯度较高的E5T-mSEA融合蛋白。将E5T-mSEA免疫小鼠，能够产生高滴度的抗体，该抗体能够同时识别EGF和TGFα。将抗E5T-mSEA免疫血清与肿瘤细胞共培养，在1:10的稀释度下能显著抑制EGFR阳性肿瘤细胞的生长，而对EGFR阴性肿瘤细胞293T的生长没有明显影响。

摘要:获得人成纤维细胞生长因子受体2IIIc (FGFR2IIIc) 及其S252W突变型重组腺病毒，感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，为下一步研究FGFR2IIIc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2IIIc基因的质粒为模板，PCR扩增得到FGFR2IIIc基因，重叠延伸法PCR获得FGFR2 IIIcS252W突变型基因；分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上，得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2IIIc和pAdTrack- FGFR2IIIcS252W， DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组，得到的重组表达质粒Ad-FGFR2IIIc和Ad-FGFR2IIIcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增，通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度，进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明，成功构建了人FGFR2IIIc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体，获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞，并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2IIIc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖，S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2IIIc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期，抑制细胞增殖。

摘要:为解决霍山石斛类原球茎液体培养细胞生长缓慢和代谢水平低下的问题，研究了不同浓度的锗(GeO2) 对霍山石斛类原球茎增殖、多糖合成及碳氮利用的影响，分析了类原球茎细胞内还原糖、可溶性蛋白质含量、抗氧化酶活性以及细胞氧化还原态的变化。结果表明，适当浓度的二氧化锗 (4.0 mg/L) 显著促进霍山石斛类原球茎的增殖和多糖的积累，最大细胞干重为32.6 g/L，最大多糖产量为3.78 g/L；显著提高胞内还原糖和可溶性蛋白质含量，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性明显升高，而过氧化物酶的活性则有所降低；氧化还原态分析发现，二氧化锗处理的细胞内还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的值明显提高，谷胱甘肽还原酶活性升高。添加适量的二氧化锗有利于细胞生长和多糖合成。

摘要:为了探讨利用南美蟛蜞菊毛状根来改良其观赏性状和生产次生物质，研究了南美蟛蜞菊Wedelia trilobata (L.) A.S.Hitche毛状根的诱导及其离体培养过程中培养基N源、碳源、磷和钙的消耗变化。结果表明，发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes ATCC15834感染南美蟛蜞菊幼嫩叶片外植体7 d后从其叶片切口中脉处产生毛状根。毛状根能在无外源激素的培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C 基因已在南美蟛蜞菊毛状根基因组中插入、整合并得到表达。毛状根液体培养0~7 d内处于生长迟滞期、7~21 d为快速生长期、21 d后进入生长平台期。在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖、硝态氮、PO43?、Ca2+被逐渐吸收和消耗，培养至7 d时，蔗糖被消耗近50％；硝态氮含量只剩下起始硝态氮含量的5.8％；至35 d时，蔗糖和硝态氮含量分别约为其起始浓度的3.39％和1.82％。与Ca2+浓度变化不同的是，培养基的无机磷被快速消耗，培养至7 d时其浓度约为其起始浓度的1.76％；但培养至35 d时培养基中仍残存有占起始浓度约61.3％的Ca2+。该结果为今后利用南美蟛蜞菊毛状根来改良其观赏性状和设计合适的培养基来规模培养生产其次生物质提供了可能性。

摘要:本研究针对同一目的基因设计构建不同茎部长度的shRNA表达载体，并对其在细胞及胚胎水平的干扰效应做一比较。以绿色荧光蛋白基因为沉默效应的靶基因，设计茎部长度分别为21 bp、27 bp、29 bp的干扰片段，退火后连入带有H6启动子的真核表达载体psiSTRIKE中 (分别命名为EGFP-21 siRNA、EGFP-27 siRNA和EGFP-29 siRNA)，将构建成功的载体以脂质体法转染小鼠胚胎成纤维细胞，利用荧光定量PCR对其荧光表达进行精确定量。不同茎部长度的shRNA载体均使绿色荧光蛋白基因表达降低，茎部为29 bp时比21 bp、27 bp表现出更明显的沉默效应。细胞水平沉默效应的初步验证，为筛选适合小鼠个体水平的最佳发夹结构奠定了基础。

摘要:PHD finger8 (PHF8) 蛋白是最新发现的一种带有PHD结构域和Jmjc结构域的蛋白。现有研究表明其可能在基因转录、组蛋白去甲基化等方面发挥重要作用。为研究其功能，本研究构建原核表达载体pET41b-PHF8 (aa886-936)，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中诱导表达带有GST标签的PHF8 (aa886-936) 亲水片段融合蛋白，并纯化该片段作为抗原免疫家兔，再以CNBr活化Sepharose 4B微珠纯化抗血清制备PHF8特异性多克隆抗体。Western blotting以及免疫荧光检测表明该抗体具有很好的特异性，同时免疫荧光染色的结果也表明PHF8蛋白定位于细胞核。

摘要:霍乱弧菌是一种重要的食源性致病菌，主要引起急性肠道传染病，其快速检测具有重要意义。根据霍乱弧菌的mdh管家基因序列，设计2对特异性检测引物，利用DNA环介导恒温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，经反应体系优化，成功建立了霍乱弧菌的LAMP快速检测方法。该方法最佳反应温度为65℃，60 min完成检测，对培养菌的检测限为25 CFU/mL，污染食品中霍乱弧菌的检测限为32 CFU/g。对33株同种或近源细菌进行LAMP检测，仅霍乱弧菌得到阳性扩增。LAMP方法实践应用结果表明，对1057份虾、蟹、牡蛎、肉类、人腹泻物等样本进行检测，共检出85份阳性，与国际标准 (ISO TS 21872-1-2007) 检测结果的符合率为100％。结果表明，本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便，有利于霍乱弧菌疫情的监测。

摘要:几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用，该酶本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。本研究从蚕蛹体内提取几丁质粗酶，经硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到几丁质酶。用SDS-PAGE测得该酶的分子量为88 kDa。水解胶体几丁质的Km值为22.3 μmol/L。酶反应的最适温度为45℃，最适pH值为6.0，金属离子和有机试剂对几丁质酶活性都有影响，其中高浓度的Mn2+对酶有较强的激活作用，而Cu2+、SDS则有较强的抑制作用。研究结果为基于几丁质酶的生物农药筛选研究奠定了基础。

摘要:Myostatin (MSTN，肌肉生长抑制素) 基因属于TGF-β超家族，对骨骼肌的生长发育具有负调控作用。该基因的功能缺失，能够引起肉用动物的“双肌”表型，从而提高产肉率。基因打靶技术是制作转基因动物的常用方法。构建了两个置换型打靶载体pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2，通过同源重组将G938A突变点引入秦川牛MSTN基因第三外显子。电穿孔方法转染秦川牛胎儿成纤维细胞，经过600 μg/mL G418和50 nmol/L GCV的药物正负筛选，共得到170个药物抗性细胞克隆。对细胞克隆进行PCR、测序及Southern blotting 鉴定，结果显示，第58号细胞克隆为发生了正确同源重组的中靶细胞。牛胎儿成纤维细胞中的MSTN基因的一条等位基因被成功改造。