摘要:2010年5月20日，美国Science杂志报道J. Craig Venter 的研究小组制造了第一个能够自我复制的人工合成生命，并立即引发了人们对这一研究潜在威胁的担忧和有关生物安全和生物伦理的讨论。但同时，这一成果也是人类在合成生物学领域的一次突破。我们相信在后基因组时代，合成生物学的发展必将广泛地应用于能源、环境、材料、医药等诸多领域，从而影响和改变人类未来的生活。

摘要:安全、有效、具有靶向性的病毒载体是基因治疗药物在临床上得以应用的关键。microRNA是一类单链、内源性的转录后调控小分子，它的发现为开发具有靶向性调控能力的病毒载体提供了新的研究方法。以下在介绍microRNA调节病毒载体靶向性原理的基础上，着重介绍microRNA在清除复制能力病毒的污染、消除转基因特异性免疫、增强肿瘤靶向性基因治疗、开发活体疫苗等领域的应用。

摘要:植物调节体内重金属的累积量以维持自身生存，其中，金属阳离子转运蛋白发挥了关键作用。P1B-ATPase是在生物中广泛存在的P-ATPase中的一个亚族，也是P-ATPase多个亚族中唯一参与重金属稳态的转运蛋白。拟南芥中共发现8个P1B-ATPase。研究表明，P1B-ATPase在植物体内具有维持金属的稳态、转运以及金属解毒的功能；与金属离子在根部区域的活化、吸收、地上部分的运输、贮存，以及植物对重金属的耐受性均相关。以下综述了P1B-ATPase的进化分类、结构特征以及功能方面的最新研究进展，并展望了其在植物修复领域的应用前景。

摘要:多环芳烃 (Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs) 是一类在环境中广泛存在的具有毒性的污染物，微生物降解是其在自然界中降解的主要途径，因而尤为重要。随着研究的深入，关于微生物降解PAHs的分子降解机制、途径等的认识逐渐积累。以下对细菌降解萘、菲的研究进展进行了概述，介绍了萘的水杨酸降解途径，菲的水杨酸、邻苯二甲酸及其他降解途径，同时也包括降解过程中涉及的降解基因簇，如nah-like、phn、phd、nid和nag等以及细菌在PAHs胁迫条件下其他相关基因的表达与调节等方面的最新进展。这些进展可为降解菌株的分子及遗传机制研究提供理论依据，将促进通过基因工程优化降解菌、更有效地检测PAHs环境污染及实现PAHs污染的生物修复。

摘要:植物脂肪酸和三酰甘油具有重要生理功能以及巨大的食用和工业价值，其生物合成途径较为复杂。近年来，植物脂肪酸和三酰甘油合成代谢途径的研究取得了很大进展，在多种植物中克隆了脂肪酸和三酰甘油合成代谢途径中的关键酶基因，同时发现一些转录因子在调控植物脂肪酸含量和组成中具有重要作用，并在此基础上开展了利用基因工程改良植物脂肪酸和提高植物含油量的研究，取得了一定的进展。以下系统介绍了植物脂肪酸和三酰甘油合成代谢途径中的关键酶基因以及在调控植物脂肪酸含量和组成中具有重要作用的转录因子，综述了基因工程研究所取得的成果，并对其应用前景进行了展望。

摘要:本研究旨在评估抗坏血酸 (VC)、表皮生长因子 (EGF)、促卵泡素 (FSH) 对绵羊原始卵泡体外培养的影响以及它们之间的相互关系。实验按照2×2×2因子试验设计分为8组，分别为：MEM(对照组)，MEM+VC (50 μg/mL)，MEM+EGF (100 ng/mL)，MEM+FSH (50 ng/mL)，MEM+VC+EGF，MEM+VC+FSH，MEM+EGF+FSH，MEM+VC+ EGF+FSH。在培养0 (未培养对照组)、2、6、12 d后，对培养的卵巢皮质薄片进行组织学和增殖细胞核抗原 (PCNA) 检测以及透射电镜 (TEM) 观察。结果表明，与未培养组 (发育卵泡比例15.4％±1.9％，正常卵泡比例88.2％±4.6％) 比较，所有培养组中发育卵泡比例显著增加(P＜0.05)，正常卵泡比例下降(P＜0.05)。培养12 d后，与对照组 (卵泡直径 (34.5±3.3) μm，卵泡存活比例 (38.9％±3.9％)) 比较，MEM+VC+FSH和MEM+EGF+FSH组中卵泡直径 (分别为(39.7±3.4) μm和 (42.5±5.1) μm) 和卵泡存活比例 (分别为58.5％±4.3％和59.3％±3.7％) 都显著提高 (P＜0.05)；各处理组中，培养12 d后，MEM+VC+EGF组中发育卵泡比例 (49.3％±3.2％) 和卵泡直径 ((32.3±2.3) μm) 最低，颗粒细胞PCNA阳性卵泡比例 (26.4％±1.2％) 也最少，而MEM+VC+EGF+FSH组中卵泡存活率 (59.7％±6.1％) 和卵泡直径 ((42.5±5.1) μm) 都显著增加 (P＜0.05)，颗粒细胞PCNA (43.5％±4.1％，P＜0.05) 表达增加。电镜结果表明，VC+EGF+FSH组能够维持与正常卵泡类似的超微结构，而在MEM 和MEM+VC+EGF组却显示不同程度的退化特征。本研究结果提示在培养中联合添加VC与EGF抑制卵泡的发育和生长，而联合添加VC、EGF和FSH可能是促进绵羊原始卵泡体外激活和生长，维持卵泡存活以及结构完整的最有效的处理手段之一。

摘要:汞、镉、铅等重金属引起的环境污染已在世界范围内造成危害。快速、廉价地监测生境中重金属是减小其对人类及动物危害的先决条件。传统检测方法无法满足高通量的现场检测，建立更快速、更经济的免疫分析法检测汞离子是生产及经济发展的需要。本研究中，报道了汞特异性单克隆抗体的制备与筛选方法和结果。因Hg2+太小以至于不能引起免疫反应，所以用螯合剂 (二乙烯三胺五乙酸，DTPA) 将金属离子与载体蛋白 (匙孔血蓝蛋白，KLH) 连接起来。成功合成、鉴定汞复合物抗原后，免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合获得了稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。用极限稀释法亚克隆，通过ELISA筛选，获得了2株稳定分泌抗汞离子抗体的细胞株 (H2H5，H1H8)。小鼠腹腔注射1×107 H2H5、H1H8细胞株制备腹水，腹水抗体效价都在1∶51 200以上。经鉴定两株杂交瘤均为IgG1亚类，轻链为kappa型且分泌抗体稳定性较好。实验结果为汞离子残留免疫学检测方法的建立提供了技术基础，对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

摘要:为了研究STT3a基因在杜氏盐藻耐盐及鞭毛再生方面的作用，根据衣藻、拟南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL设计一对简并引物，采用RT-PCR及3'RACE的方法扩增杜氏盐藻STT3a蛋白功能结构域的cDNA序列。序列分析显示克隆的cDNA全长1 650 bp，具有一定保守性，与衣藻、拟南芥和人的相似性分别为48％、50％和46％。实时荧光定量PCR结果显示杜氏盐藻STT3a mRNA水平随着盐浓度的升高而逐渐增加，其水平在3.5 mol/L NaCl浓度时比在1.5 mol/L NaCl浓度时升高了11倍(P＜0.01)。另外，与没有脱鞭毛的杜氏盐藻相比，STT3a mRNA在鞭毛再生过程中持续高表达。本研究显示杜氏盐藻STT3a基因的高表达可以增强其盐适应和鞭毛再生能力。

摘要:近年来，植物表达人源蛋白的研究逐渐增多。本研究以人角质细胞生长因子 (KGF2) 基因cDNA为基础，根据植物偏好密码子进行改造，并利用PCR方法合成KGF2基因全长cDNA。在此基础上构建了KGF2的植物油体系统表达载体p1390-YO-KGF2，并采用农杆菌介导法对甘蓝型油菜无菌苗的子叶进行转化。通过PCR、Southern杂交和Western blotting检测，证明外源基因KGF2已经转入油菜中并得到成功表达。

摘要:聚乙烯亚胺 (PEI) 是一种具有良好生物安全性和生物相容性的非病毒载体，能高效转染肿瘤细胞。小环DNA是一种去除质粒细菌骨架，只含有目的基因表达框的环状DNA分子。与普通质粒相比，小环DNA具有表达效率高、持续时间长的优势。使用PEI包裹携带报告基因gfp和抑癌基因pten小环DNA载体，并利用各种技术手段分析了该传输系统的理化性质和生物学效应。凝胶阻滞实验、电镜实验及MTT实验分析结果表明利用PEI包裹小环DNA和质粒DNA体系性质无显著的差别，并且2种复合物对细胞毒性亦无明显差别；但是动态光散射实验结果显示由于PEI可以包裹更多数量的小环DNA，所以PEI包裹小环DNA形成的复合物粒径要略大于包裹质粒DNA形成的复合物粒径。荧光显微镜实验、real-time PCR分析和Western blotting 分析结果表明，PEI包裹小环DNA形成的复合物对细胞的转染效率要远远高于PEI包裹质粒DNA所形成的复合物，并且小环所携带的外源基因的表达效率要远远高于质粒DNA所携带的外源基因的表达效率。实验结果表明，PEI包裹小环DNA形成的纳米颗粒在细胞转染过程中具有很高的表达效率，这一研究结果为PEI包裹小环DNA的非病毒载体系统在传输外源基因过程中的应用提供理论基础和技术支持。

摘要:干扰素β(IFN-β) 和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 是有效抗癌药物。腺相关病毒(AAV) 为目前最有应用前景的基因转移载体之一。利用AAV携带IFN-β和TRAIL基因并置于hTERT启动子控制下分别构建成肿瘤靶向病毒AAV-hTERT-IFN-β和AAV-hTERT-TRAIL，且单个IFN-β或TRAIL基因治疗发挥了一定的抗癌效果。将AAV-hTERT-IFN-β和AAV-hTERT-TRAIL进行联合，旨在研究其对A549肺癌细胞体内外的生长抑制效应。ELISA法检测了AAV-hTERT-IFN-β感染A549细胞后分泌型IFN-β的表达；MTT法检测AAV-hTERT-IFN-β联合AAV-hTERT-TRAIL对肿瘤细胞的生长抑制作用；凋亡细胞染色和流式细胞仪分别检测了AAV-hTERT-IFN-β、AAV-hTERT-TRAIL及其联合对A549细胞的凋亡效应；进一步评价了联合AAV-hTERT-IFN-β和 AAV-hTERT-TRAIL对A549裸鼠移植瘤的抑癌效果。结果显示，联合治疗优于任一单独治疗并且导致了增强的肿瘤细胞毒性和凋亡诱导效应。更进一步显示，联合AAV-hTERT-IFN-β和AAV-hTERT-TRAIL治疗发挥了重要的抑制裸鼠移植瘤效果甚至消除全部移植瘤，为探究IFN-β和TRAIL联合抗癌的分子机制奠定了基础。

摘要:骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 具有增殖和多向分化潜能，临床应用广泛，近年来备受关注。另一方面，MSCs易于转导和表达外源基因，是理想的基因工程细胞。非人灵长类 (NHPs) 和人类具有非常相近的遗传背景，NHPs模型在评价药物疗效和移植治疗等方面具有不可替代的价值。本研究采用密度梯度离心法分离成年食蟹猴骨髓单核细胞 (Marrow mononuclear cells，MNCs)，贴壁培养MSCs。同时构建表达绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 的慢病毒载体，感染成年食蟹猴MSCs。结果显示，体外培养的成年食蟹猴MSCs均感染猴泡沫病毒 (Simian foamy virus，SFV)，体外培养成年食蟹猴MSCs必须添加抗病毒药物Tenofovir。但由于食蟹猴MSCs感染SFV，以及培养中添加了抗病毒药物Tenofovir，慢病毒载体的感染效率明显降低 (＜10％)。本研究通过停用抗病毒药，在细胞复苏后6 d转染慢病毒，可大幅提高慢病毒的感染效率 (＞50％)。为成年食蟹猴MSCs作为基因工程细胞应用于实验和临床研究提供了技术保证。

摘要:类受体激酶在植物发育、自交不亲和、雄性不育、抗逆和抗病等生命过程中起着重要的调控作用。为了对水稻类受体激酶的功能及生物学特性进行深入研究，本实验克隆表达了水稻中5个类受体激酶抗原表位片段，以纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰兔，获得了特异性较高的多克隆抗体。Western blotting检测结果表明，5个类受体激酶均在叶片中表达。

摘要:甜瓜蔓枯病是当前危害瓜类的主要病害，严重影响甜瓜的产量和品质，但是蔓枯病菌Didymella bryoniae病原学研究还非常落后，关于该菌功能基因的研究还未见报道。本研究以携带潮霉素B磷酸转移酶基因(hph) 的pBIG2RHPH2作为转化载体，根癌农杆菌C58C1作为转化介体，转化甜瓜蔓枯病菌的强致病菌株DB11。研究发现，甜瓜蔓枯病菌的最优转化体系为：甜瓜蔓枯病菌的分生孢子悬浮液浓度为1×106个孢子/mL，农杆菌悬浮液OD600为0.15，共培养时间48 h，诱导培养基中添加200 μg/mL乙酰丁香酮，选择培养基添加100 μg/mL潮霉素B、200 μg/mL头孢噻肟钠、200 μg/mL氨苄青霉素和200 μg/mL四环素。1×105个蔓枯病菌分生孢子可以产生45个左右的转化子，随机挑取3个转化子进行PCR和RT-PCR检测发现，在不含潮霉素B的PDA培养基平板上转化子连续培养5代后，hph基因仍能稳定存在和转录，Southern blotting检测发现，T-DNA都是单拷贝插入3个转化子的染色体内。本研究建立的甜瓜蔓枯病菌的转化体系将为该病菌的功能基因研究和寄主与病原菌的互作研究提供重要技术支撑。

摘要:建立了一种以分泌型的荧光素酶Gluc为报告基因的miRNA传感器质粒 (命名为Gsensor) 监测活细胞中miRNA (microRNA) 活性的方法。首先构建了pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA质粒作为Gsensor的空载体，同时其中的MCS位点可供插入miRNA的靶序列。以miR142-3p为检测对象，将1个和3个拷贝的与miR142-3p完全互补靶序列分别插入pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA中，构建成miR142-3p Gsensor和miR142-3p Gsensor-3。将它们分别转染至U937细胞中,检测培养上清中Gluc的表达水平。结果显示二者均可有效反映U937细胞中miR 142-3p的抑制活性 (分别与Gsensor空载体相比)，提示Gsensor中采用一个拷贝的miRNA靶序列即可满足检测要求。并且miR142-3p Gsensor也能有效地反映出Anti-miR142对miR142-3p活性的抑制作用。随后，分析了时间、转染剂量对Gsensor检测结果的影响。结果表明，在U937细胞中miR142-3p Gsensor表现的miR142-3p活性在48 h后趋于稳定；Gsensor转染剂量在0.001~0.05 pg/cell范围内不影响其功能。最后，利用miR142-3p Gsensor 检测了HEK293、U937、K562、SP2/0和P815细胞内miR142-3p活性，结果发现miR142-3p活性在U937、K562、SP2/0和P815细胞中均较高，而在HEK293中几乎没有活性。用QRT-PCR方法检测miR142-3p的相对拷贝数。结果表明，在HEK293、U937和K562细胞中，miR142-3p活性与其相对拷贝数呈正相关。本研究表明Gsensor可作为一种有效的miRNA活性检测工具，为体外实时动态监测miRNA活性提供了一种新方法。

摘要:针对诺如病毒II型的保守区域设计引物，建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝，标准曲线的线形范围为102~106拷贝，相关系数为0.9952，斜率为?2.982，截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异，与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数 (CV) 为0.95％~1.69％ (n=5)，批间试验CV为0.87％~1.24％ (n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品，检测出2份阳性样品。结果表明，SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好，可应用于贝类水产品的快速检测。

摘要:本研究通过对脊椎动物分子标记基因进行序列分析，最终选择线粒体DNA (mtDNA) 16S rRNA基因为目标基因，利用一对通用引物，在该引物扩增区间设计了4条特异性基因芯片检测探针及2条质控探针用于对牛、山羊、猪、鸡等4种动物源性成分进行检测。通过对PCR扩增体系及杂交体系的优化，该检测方法能实现对上述4种动物源性成分同时进行快速、准确地检测，具有很好的特异性，灵敏度均达到1 pg，最终建立了这4种动物源性基因芯片检测方法。该基因芯片检测技术将为我国进出口饲料中的动物源性成分的鉴别提供新的检测方法和技术支持。

摘要:为了建立非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系，将家蚕核型多角体病毒极早期基因 (ie-1) 启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (hGM-CSF) 基因的表达盒克隆至pIZT/V5-His，获得重组载体pIZT-IE-hGM-CSF，该载体转染家蚕BmN细胞后，通过博莱霉素 (Zeocin) 筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定，成功检测到ie-hGM-CSF，Western blotting分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的大小为22 kDa，ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2 814.7 pg/106个细胞。

摘要:利用基因工程技术，体外重组小分子类泛素修饰蛋白酶1 (Ulp1) 的活性片段，获得高表达、高特异性重组蛋白酶。从酿酒酵母Saccharomyces cerevisia中提取Ulp1编码第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段 (Ulp1p)，在其C端加入6×His并连接到大肠杆菌表达载体pGEX中，构建重组表达质粒pGEX-Ulp1p-his6。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta (DE3) 中，氨苄青霉素抗性筛选转化子。表达、纯化后，以SUMO融合蛋白检测其活性。经过优化，该蛋白可溶性表达，表达量占菌体总蛋白的40.12％。可通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱或Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到纯度98％的蛋白。经酶切分析，比活力为1.375×104 U/mg。融合蛋白GST-Ulp1p-His6无需切除谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 标签，具有很高的活性，制备简易；6×His标签，有利于底物蛋白切割后纯化，减少蛋白损失。本研究为制备高活力的SUMO蛋白酶提供了一个新方法。