摘要:新城疫病毒可以特异地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有伤害，目前在临床实验中认为是安全、有效的溶瘤试剂。随着近年来反向遗传操作技术的日趋成熟，该技术开始应用到新城疫病毒溶瘤效果的优化方面，通过改造新城疫病毒的F基因，及表达重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，干扰素-γ，白细胞介素-2和肿瘤坏死因子-α等肿瘤杀伤因子，使该病毒具备更加优越的肿瘤杀伤能力，成为肿瘤治疗领域一个新兴的亮点，为癌症的临床治疗提供了崭新的前景。以下将简要介绍应用反向遗传操作技术重组新城疫病毒优化肿瘤治疗效果的研究进展，以及本实验室在相关领域的研究情况。

摘要:禽流感病毒核蛋白 (NP) 在病毒的转录、复制以及决定病毒的宿主特异性方面都具有重要作用。通过酵母双杂交系统筛选与核蛋白相互作用的蛋白，为进一步了解NP蛋白与细胞内蛋白质的相互关系以及流感病毒与宿主的相互关系奠定基础。应用酵母双杂交系统，构建NP诱饵质粒，进而筛选人脑cDNA文库，寻找可能与禽流感病毒NP相互作用的蛋白质。经过酵母双杂交共验证，得到7个与NP相互作用的阳性克隆。该结果为深入了解病毒复制的分子机理及其在蛋白质水平上与宿主蛋白的相互作用关系提供了线索。

摘要:旨在研究白藜芦醇对猪前体脂肪细胞凋亡的作用，探讨其分子机制。以50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L白藜芦醇处理猪前体脂肪细胞，采用Hoechst 33258染色剂染色，光学和荧光显微镜分别观察细胞的形态学变化。semi-qRT-PCR和Western blotting方法检测凋亡相关基因sirt1、caspase-3、bcl-2、bax、p53、NF-κB的mRNA和蛋白的表达变化。结果表明，白藜芦醇处理后，前体脂肪细胞出现明显的细胞凋亡，伴随细胞体积缩小，染色质凝集，核质固缩等特征显现，与对照组相比200 μmol/L处理组细胞的凋亡率显著升高 (P＜0.05)。凋亡相关基因sirt1、caspase-3和bax的mRNA和蛋白表达水平显著上调 (P＜0.05)，而bcl-2、p53、NF-κB等基因的表达水平明显下调 (P＜0.05)。进一步证实白藜芦醇特异性地增加sirt1的表达活性，而sirt1的上调影响caspase-3和bcl-2家族因子的活性，同时参与调控p53和NF-κB的转录表达。因此，推测sirt1调控凋亡相关因子表达是白藜芦醇诱导前体脂肪细胞凋亡的关键原因。

摘要:为研究羊Follistatin基因的功能，提取了绵羊卵巢总RNA，通过RT-PCR方法获得羊Follistatin cDNA的完整开放阅读框 (1 038 bp)。去除信号肽序列后与原核表达载体pET41a连接，构建重组表达质粒pFSsig?，经大肠杆菌诱导表达获得FS sig?蛋白 (66 kDa)。通过RT-PCR克隆了包含N端和结构域1的Follistatin突变体 (FS N+D1)，将FS N+D1片段插入慢病毒载体 (pLEX-MCS) 构建了pFS-N+D1慢病毒重组表达质粒。在293T细胞中进行慢病毒的包装，再感染绵羊肌肉原代细胞，得到稳定表达FS N+D1的肌肉细胞系，通过细胞生长曲线结果显示稳定表达FS N+D1的肌肉细胞明显比正常肌肉细胞增殖快，且差异极显著 (P＜0.01)，表明绵羊FS N+D1结构域有促进肌肉细胞生长的功能。

摘要:为了获得既可预防猪细小病毒感染又能促进生长的嵌合病毒样颗粒疫苗，以PPV NJ-a株基因组DNA为模板扩增VP2基因片段，在VP2基因N端融合人工合成的4拷贝生长抑素基因，构建杆状病毒转移载体pFast-SS4-VP2。通过转化DH10Bac感受态细胞，pFast-SS4-VP2与穿梭载体Bacmid重组，获得重组Bacmid，命名为rBacmid-SS4-VP2。rBacmid-SS4-VP2转染Sf-9细胞，获得重组病毒rBac-SS4-VP2。SDS-PAGE与Western blotting鉴定可见约68 kDa的rSS4-VP2条带；rBac-SS4-VP2感染细胞IFA检测产生很强的特异性绿色荧光；感染细胞超薄切片电镜观察到大量特征性病毒样颗粒。将重组蛋白分别辅以铝胶、IMS和白油不同佐剂免疫小鼠，通过检测免疫小鼠VP2特异性ELISA抗体、PPV特异性中和抗体、生长抑素的抗体水平及生长激素水平来评价嵌合病毒样颗粒的免疫原性。结果表明，辅以铝胶与IMS佐剂重组蛋白组均产生了与PPV全毒组相似的ELISA抗体与中和抗体反应；重组蛋白免疫组均产生较好的针对生长抑素的抗体反应；免疫小鼠体内生长激素的水平明显升高；其中以铝胶佐剂组产生的各抗体水平最高，白油佐剂组各抗体水平最低。为以后生产安全、有效的颗粒化亚单位疫苗提供了一个新的设计思路，又为应用病毒样颗粒递呈外源肽，从而生产多联亚单位疫苗奠定了基础。

摘要:在成功克隆流感病毒H1N1全长HA(Hemagglulinin，HA)、NA(Neuramidinase，NA) 基因并测序的基础上，将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上，构建了重组表达质粒pMETA/HA(52~1 557 bp)、pMETA/NA(121~1 263 bp)，电转化真核酵母菌pMAD16，甲醇诱导表达，利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。SDS-PAGE显示重组蛋白在酵母菌中可以高效表达，蛋白纯度占总蛋白的95％以上，ELISA和Western blotting实验证实，重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H1N1 HA、NA基因序列，为流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了参考。

摘要:以50％的沼液为普通小球藻的全营养培养基，考察培养基的起始pH值对小球藻生长及油脂含量的影响，普通小球藻对不同初始pH的沼液中氮、磷的去除情况。设定了2组实验，一组只调节初始接种培养液的pH，分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；另一组将培养液pH分别固定在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，pH用稀HCl和NaOH进行调节。研究发现在pH 6.5和pH 7.0的偏酸环境有利于小球藻生长，而pH在7.0~8.5的偏碱性条件下有利于小球藻油脂的积累，因此综合小球藻生长和油脂积累2个因素，得到最适合小球藻生长和油脂积累的pH为7.0。培养结束后沼液中氮磷的去除率分别达到了95％和97％，沼液中的总氮由原来的134.91 mg/L降至4.86 mg/L，总磷由10.19 mg/L降到0.32 mg/L。

摘要:淡紫拟青霉NH-PL-03菌株的胞外多糖粗提物对枯萎病病原菌-尖孢镰刀菌具有较好的抑制效果，文中对淡紫拟青霉胞外多糖进行了分离纯化和结构分析，以期为其构效关系研究奠定基础。采用乙醇沉淀法从淡紫拟青霉发酵液中提取粗多糖，经Sevage法脱蛋白后，过Superdex-G75凝胶层析柱分离得到胞外多糖EP-1。紫外分光法和Sephacryl S-200 HR凝胶层析柱检测EP-1为均一多糖，Sephacryl S-200柱层析测得EP-1的分子量为35.2 kDa，完全酸水解后纸层析检测EP-1的单糖组成中仅有葡萄糖，红外光谱、高碘酸氧化和Smith降解结果表明EP-1的化学结构是以β-(1,3)糖苷键连接而成的无分枝的葡聚糖。刚果红络合试验表明EP-1在稀的碱溶液中以3股螺旋构象存在。

摘要:为了研制具有高效自主复制能力的日本脑炎病毒 (JEV) 复制子载体，验证其作为新型复制子疫苗载体的可能性。以保留全长核心蛋白C基因的JEV复制子载体pCTCJEV为基础，通过PCR的方法减短C蛋白的部分基因序列，分别保留C23和C68位氨基酸，以Lac Z基因作为报告基因，构建了C基因长短不同的JEV复制子载体pCMW-2M-1LACZ、pCMW-2M-3LACZ。将复制子载体转染表达JEV结构蛋白的细胞系CME-4，通过Lac Z的表达检测JEV复制子载体表达外源蛋白的能力，反映了JEV的系列复制子载体的自主复制能力。结果保留C基因全长，C68、C23的复制子载体表达外源蛋白的能力相当，以上结果说明仅仅保留C蛋白的69个核苷酸即可保留JEV复制子载体的自主复制能力，为进一步优化JEV复制子载体，将该载体开发研制成为高效表达外源蛋白的疫苗载体提供了依据。

摘要:DNA聚合酶δ结合蛋白38 (DNA Polymerase delta-interacting protein 38，PDIP38) 是2003年新鉴定的一个基因，目前认为其可能在DNA修复、有丝分裂以及血管平滑肌细胞迁移中起重要作用。根据本实验室前期在胚胎干细胞中对该基因的研究，认为microRNA可能在PDIP38的调控过程中发挥了重要作用。为证实这种推论，运用生物信息学方法预测发现在胚胎干细胞中高表达的microRNA——microRNA-291a-5p (miR-291a-5p) 与PDIP38的开放阅读框 (ORF) 有一个配对非常理想的靶位点，通过构建该靶位点的报告基因载体以及ORF表达载体，分别进行荧光素酶报告基因分析以及细胞转染和Western blotting方法。结果证明miR-291a-5p能够直接调节PDIP38的蛋白表达。进一步运用real-time PCR和Western blotting分析证明了在胚胎干细胞中miR-291a-5p能够调节内源PDIP38的蛋白表达而对其mRNA表达无影响，这些都证明PDIP38确实是miR-291a-5p的一个靶基因。

摘要:采用融合PCR的方法将黄曲霉尿酸氧化酶(UOX) 基因的307~309 bp的TGC(Cys) 突变为GCC(Ala)，将所获得的突变体基因克隆到原核表达质粒pET-42a(+) 后转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导，突变体蛋白 (UOX-Ala103) 得到高水平的可溶性表达，目的蛋白占总蛋白含量的45％。疏水柱及阴离子柱纯化后，UOX-Ala103蛋白纯度＞98％。Western blotting分析证实UOX-Ala103能与抗UOX单抗特异结合。与天然型相比较，其体外生物学活性增加约60％，在高尿酸血症小鼠模型体内也有良好的降解尿酸的活性。

摘要:构建可表达增强型绿色荧光蛋白 (Enhanced green fluorescent protein，EGFP) 的辅助病毒依赖型腺病毒载体 (Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)，并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达，电镜下观察到经CsCl纯化后的腺病毒的典型形态。分光光度计法测定病毒的浓度为4.0×1012 颗粒数 (Virus particle，vp) /mL。与可表达EGFP的第一代腺病毒载体 (First generation adenoviral vector，FGAd) FGAd/EGFP进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究，分别用约2 000 vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞，流式细胞仪检测EGFP的表达情况。通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况，可见HDAd/EGFP感染早期的A549细胞较FGAd/EGFP有更高的荧光表达率及更高的表达强度，显示HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性，是一种更有价值的疫苗载体。

摘要:以悬浮适应的表达重组尿激酶原 (Pro-urokinase，pro-UK) CHO工程细胞系11G-S为对象，采用Plackett-Burman实验设计及响应面分析法，设计支持CHO工程细胞 (11G-S) 悬浮生长的无血清培养基。以细胞密度为评价指标，在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计对影响细胞生长的培养基添加成分进行考察，确定了3种对细胞生长明显促进作用的培养基添加成分：胰岛素、转铁蛋白及腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围，设计了一种适用于CHO工程细胞 (11G-S) 悬浮培养的无血清培养基SFM-CHO-S。11G-S细胞在SFM-CHO-S批次悬浮培养的细胞最大生长密度达到4.12×106 cells/mL，pro-UK的最大累积活性达到5 614 IU/mL，培养效果优于商品化的同类无血清培养基。

摘要:应用组织块培养法高密度培养、连续传代法建立西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养体系，通过生长曲线绘制、核型分析、免疫荧光染色 (角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白)、油红染色及β-酪蛋白基因的RT-PCR分析进行培养细胞鉴定。实验结果表明细胞生长曲线为典型的S型，染色体数目众数为60，细胞角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白表达均呈阳性，油红染色后可见细胞质内的脂滴，且细胞表达酪蛋白mRNA。说明运用本方法培养的细胞为正常的乳腺上皮细胞，并具有一定的泌乳功能。

摘要:以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板，PCR扩增PPFE-I基因，并克隆到pMD19-T载体上，构建克隆载体pMD-PPFE-I，经测序正确后，将PPFE-I基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I，将其转化至E. coli BL21(DE3)，在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-I的表达，表达产物酶活性达228 IU/mL。表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达，占菌体总蛋白的18.4％。Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带，证实该蛋白为DsbA-PPFE-I融合蛋白。表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化，并用 MALDI-TOF 质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。

摘要:建立了一种基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印核酸检测新方法。首先，用纳米金颗粒同时标记检测探针P2和两种长短不同且生物素化的信号探针 (T10,T40)，其中检测探针与靶DNA 5￠端互补，两种信号探针起信号放大作用。当靶DNA分子存在时，芯片表面捕捉探针P1 (与靶DNA分子3￠端互补) 通过碱基互补配对原则结合靶DNA分子，将其固定于芯片上，同时检测探针通过与靶DNA 5￠端互补配对将纳米金复合探针结合于芯片表面，结果在芯片表面形成“三明治”结构，后通过链霉亲和素-生物素反应，使芯片表面对应有靶DNA分子的部位结合上碱性磷酸酶，最后利用BCIP/NBT显色系统使芯片表面信号结果镜面转印至尼龙膜表面。当检测探针和信号探针摩尔比为1∶10，T10和T40摩尔比为9:1时可以检测1 pmol/L合成靶DNA分子或0.23 pmol/L结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物，检测结果通过普通的光学扫描仪读取或肉眼直接判读信号有无。本芯片检测系统灵敏度高，操作方法简单、快速，不需要特殊仪器设备，在生物分子的检测方面具有较高的应用价值。

摘要:猪精子经冷冻干燥后，在光学显微镜和电子显微镜下观察其超微结构，并借助辅助生殖技术将其注入猪卵母细胞后，进一步观察受精卵的发育情况。结果表明：海藻糖组雄原核形成率 (68.52％)、卵裂率 (59.17％) 和囊胚率 (19.16％) 优于EDTA组 (64.59％、56.26％和15.62％) 和对照组 (35.36％、52.33％和8.60％) (P＜0.05)；海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃下保存60、120、180 d，雄原核形成率、卵裂率和囊胚率均无显著差异 (P＞0.05)；海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子复水化后孵育1 h和2 h，卵裂率、卵裂率和囊胚率均差异显著 (P＜0.05)；海藻糖处理组与EDTA处理组中的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃和?20℃下保存后各处理组间精子形态差异不显著 (P＞0.05)；海藻糖组中B级冷冻真空干燥精子百分数显著多于EDTA处理组 (P＜0.05)。超微结构分析表明，冷冻真空干燥猪精子的损伤主要表现在顶体和颈部的肿胀与缺损、尾部断裂。

摘要:旨在建立一种可定量检测人血清高敏CRP的化学发光检测方法 (High-sensitivity C-reactive protein quantifiable chemiluminescent immunoassay，hs-CRP CLIA)。首先利用亲和层析和离子交换层析技术从肝硬化病人腹水中纯化出高纯度的天然CRP作为免疫原制备了22株CRP单克隆抗体 (单抗)，其中13株单抗在磷酸胆碱配体捕获ELISA中呈阳性，然后利用方正滴定法筛选出单抗10C5和10C11建立了hs-CRP CLIA。试剂盒评估结果显示：该方法对血清中干扰物质IgG、血红蛋白、甘油三酯等无非特异性反应；该方法检测灵敏度高，在0.04~20.38 mg/L范围内定量检测人血清CRP标准品呈良好线性关系 (R2＞0.993)；该方法准确性高、可重复性好，平均回收率为99％，批内差为4.2％~5.8％，批间差为9.0％~11.5％；该方法与进口商品化高敏CRP ELISA试剂盒平行比较检测90份血清标本，结果显示两者有良好的可比性 (r=0.968)。综上，建立的hs-CRP CLIA是一种准确、可靠、可定量的高灵敏C反应蛋白检测方法，该方法的临床应用，有利于改善我国心脏病风险评估及肠炎性疾病预后判断。

摘要:为建立一种基于阴离子交换介质辅助的含多对二硫键的抗凝溶栓双功能水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白质 (HV12p-rPA) 的复性方法，采用Q Sepharose XL作为层析复性介质，通过正交实验考察蛋白质上样量、流速、脲梯度、洗脱液中精氨酸浓度、脲浓度、pH、还原型及氧化型谷胱甘肽等因素对复性过程的影响，探索最佳层析复性条件。结果表明：脲梯度、上样量及精氨酸浓度是影响复性的3个主要因素。脲梯度是复性成功的关键，上样量增大时复性蛋白质比活降低，精氨酸辅助HV12p-rPA复性的最佳浓度为1 mol/L。创建了脲、pH双梯度下的阴离子交换层析辅助HV12p-rPA的复性方法，复性后蛋白质的溶栓比活达到46 520 IU/mg，抗凝比活达到9 980 ATU/mg，与稀释复性方法相比，该方法能使复性蛋白质的溶栓比活提高14~15倍，抗凝比活提高7~8倍。